一株低溫蛋白酶產(chǎn)生菌的分離及該酶的鑒定與酶學(xué)性質(zhì)表征

張軍，朱檬，湯偉，3*，李佳欣，喬曉妮，孫曉雯，唐濤，3，何增國(guó)

（1.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島 266000；2.青島百奧安泰生物科技有限公司，山東 青島 266000；3.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島 266000）

低溫蛋白酶又稱適冷性蛋白酶或冷活性蛋白酶，是在低溫條件下能夠催化底物水解的一類蛋白酶。相較于普通蛋白酶，低溫蛋白酶具有天然的催化特性：低溫下的高活性，有效降低了酶促反應(yīng)熱處理的成本；高溫下的低穩(wěn)定性，極大方便了酶促反應(yīng)的控制[1-2]。近年來(lái)，低溫蛋白酶在洗滌、制革、食品加工、環(huán)境治理中具有廣泛應(yīng)用，低溫蛋白酶資源的發(fā)掘成為新的研究熱點(diǎn)。

在地球生態(tài)圈中約80%的區(qū)域常年處于5 ℃或5 ℃以下的低溫環(huán)境，在其中孕育的生物，特別是微生物，為低溫蛋白酶資源的挖掘和篩選提供了重要來(lái)源[3-4]。來(lái)源于深海、極地、冰川、凍土等低溫環(huán)境中的嗜冷菌（Psychrophiles）和耐冷菌（Psychrotrophys）逐漸成為低溫蛋白酶的主要來(lái)源[5]。然而，使用低溫微生物規(guī)?；a(chǎn)低溫蛋白酶存在技術(shù)瓶頸，且目前對(duì)低溫微生物在低溫條件下產(chǎn)酶所需的營(yíng)養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件的研究較少，因此尚未見(jiàn)公認(rèn)的適用于低溫蛋白酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝[6]。受此限制，目前真正實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的低溫蛋白酶產(chǎn)品并不多見(jiàn)，可檢索到添加有低溫蛋白酶的市售產(chǎn)品僅有KanaseR、PolarzymeR、Pura fectR、PropertaseR和ExcellaseR等[7-9]。

本課題組從低溫土壤樣品中篩選得到1 株乙酰微小桿菌YD37（Exiguobacterium acetylicum YD37），該菌株可在低溫下生長(zhǎng)，并具有水解蛋白活性。目前E.acetylicum 產(chǎn)蛋白酶的研究鮮見(jiàn)，本研究主要對(duì)E.acetylicum YD37 產(chǎn)低溫蛋白酶進(jìn)行鑒定和對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，同時(shí)開展該菌株產(chǎn)低溫蛋白酶的工程化發(fā)酵，以期為低溫蛋白酶的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采集自江蘇省鹽城市沿海的水產(chǎn)養(yǎng)殖塘口池底的土壤樣品。

苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、N-（對(duì)甲苯磺?；?L-苯丙氨酰甲基氯酮（1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone，TPCK）、細(xì)菌基因組提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；透析袋（截留1 kDa）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：北京索萊寶科技有限公司；離子交換層析填料（DEAE-80S）：蘇州納微生物科技股份有限公司；超濾管（截留1 kDa）：美國(guó)Millipore 公司；蛋白Marker：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨、酵母浸粉：北京雙旋微生物制品有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基苯磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100、雙氧水：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基配制

脫脂奶粉篩選培養(yǎng)基：脫脂奶粉20 g/L，瓊脂20 g/L，115 ℃滅菌10 min。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉20 g/L，NaCl 7 g/L，胰蛋白胨6 g/L，酵母浸粉2 g/L，KCl 74.5 mg/L，121 ℃滅菌20 min。

1.3 儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-9000S）：上海元析儀器有限公司；蛋白純化儀（HD-1）：上海滬西分析儀器有限公司；PCR儀（C1000）：美國(guó)BioRad 公司；真空冷凍干燥機(jī)（Alpha1-2）：德國(guó)Crist 公司；發(fā)酵罐（FZ-EI）：江蘇豐澤生物工程設(shè)備制造有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 低溫蛋白酶產(chǎn)生菌株篩選

取采集樣品在無(wú)菌水中進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選取合適的稀釋度，取100 μL 涂布于脫脂奶粉篩選培養(yǎng)基上，20 ℃培養(yǎng)24 h。篩選蛋白水解圈/菌落直徑比值較大的菌株作為復(fù)篩備選菌株。將備選菌株接種于LB培養(yǎng)基中，20 ℃180 r/min 培養(yǎng)24 h，10 000 r/min 離心10 min，取培養(yǎng)物上清液測(cè)定酶活，篩選出酶活最高的菌株，保藏于甘油管中以待進(jìn)一步研究。

酶活測(cè)定：參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林酚法測(cè)定酶活。20 ℃條件下，1 mL 酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸，定義為一個(gè)酶活單位（U）。

1.4.2 低溫蛋白酶產(chǎn)生菌株鑒定

將YD37 在LB 平板上劃線培養(yǎng)24 h，觀察其菌落形態(tài)特征，透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察其菌體形態(tài)特征。采用基因組提取試劑盒提取YD37 基因組DNA，使用通用引物27 F 和1492 R擴(kuò)增YD37 的16S rRNA 基因序列。產(chǎn)物測(cè)序后，結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast N 比對(duì)，用MEGA 10.0 軟件（Neighbor-Joining 法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。同時(shí)，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)YD37 的生理生化特征進(jìn)行鑒定。

1.4.3 低溫蛋白酶的分離純化與鑒定

將保存的YD37 菌液按1%的接種量接于10 mL LB 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)6 h。取2 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到200 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，20 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。離心收集上清液，采用硫酸銨沉淀法純化目的蛋白，用PBS（0.1 mol/L）復(fù)溶沉淀。采用底物浸泡酶譜法[10]，測(cè)定蛋白電泳凝膠中目標(biāo)條帶的位置，進(jìn)一步采用陰離子交換柱DEAE-80S（苯基）純化凍干樣品，超濾除鹽凍干后作為粗酶，并進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。

將電泳凝膠上的粗酶條帶切下，進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。在已公布的E.acetylicum 基因組對(duì)應(yīng)的蛋白序列中檢索，獲得該低溫蛋白酶對(duì)應(yīng)的基因序列。以該基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，以YD37 的基因組為模板進(jìn)行PCR，測(cè)序獲得該低溫蛋白酶的基因序列。采用Translate（https：//web.expasy.org/translate/）、SignalP（https：//services.healthtech.dtu.dk）、BlastP（https：//www.uniprot.org/blast）、ClustalW（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）、InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）等一系列生物信息學(xué)工具對(duì)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4.4 菌株YD37 產(chǎn)低溫蛋白酶的液體深層發(fā)酵

對(duì)YD37 生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的溫度進(jìn)行測(cè)定，在前期單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行50 L 規(guī)模的中試產(chǎn)酶工藝研究。采用發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件設(shè)定為裝料量50%、初始pH6.5、溫度20 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)發(fā)酵液的酶活。

1.4.5 低溫蛋白酶的表征

1.4.5.1 低溫蛋白酶結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用ProtParam 工具對(duì)低溫蛋白酶序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（https：//web.expasy.org/protparam/）。采用Phyre2 工具對(duì)序列進(jìn)行同源模建（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/），并利用Swiss-PdbViewer 4.0 程序?qū)︻A(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（https：//spdbv.unil.ch/）。

1.4.5.2 溫度對(duì)酶活的影響

將粗酶液與酪蛋白溶液分別在10、20、30、35、40、50 ℃條件下反應(yīng)后，測(cè)定酶活，確定最適酶催化溫度。將粗酶液在10、20、30、40、50 ℃條件下水浴90 min，再與酪蛋白反應(yīng)測(cè)定酶活，研究不同溫度處理對(duì)酶活的影響，將10 ℃下的酶活設(shè)為100%，其它處理組用相對(duì)酶活表示。

1.4.5.3 pH 值對(duì)酶活的影響

將粗酶液與酪蛋白分別在pH6.0、7.0、8.0 和9.0條件下反應(yīng)后，測(cè)定酶活，確定最適催化pH 值。將粗酶液在pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0 條件下水浴90 min，再與酪蛋白反應(yīng)測(cè)定酶活，研究不同pH 值處理對(duì)酶活的影響，將pH7.0 下的酶活設(shè)為100%，其它處理組用相對(duì)酶活表示。

1.4.5.4 金屬離子對(duì)酶活的影響

在粗酶液中分別加入終濃度1 mmol/L 的Cu2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Co2+和Zn2+溶液，孵育90 min 后，在最適溫度和pH 值下，測(cè)定殘余酶活。以不加金屬離子的粗酶液為對(duì)照。

1.4.5.5 蛋白酶抑制劑和有機(jī)試劑對(duì)酶活的影響

在粗酶液中分別加入終濃度5 mmol/L 的SDS、PMSF、TPCK 和EDTA 等蛋白酶抑制劑，在粗酶液中分別加入終濃度1%的吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100和雙氧水，孵育90 min，在最適酶反應(yīng)溫度和pH 值下，測(cè)定殘余酶活。以不加蛋白酶抑制劑和有機(jī)試劑的粗酶液為對(duì)照。

1.4.5.6 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定

參考Farooq 等[11]的方法進(jìn)行動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定。在最適反應(yīng)溫度和pH 值條件下，將粗酶液與不同濃度（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.6%和0.8%）的酪蛋白溶液，反應(yīng)10 min，于680 nm 處測(cè)量其吸光值，根據(jù)米氏方程計(jì)算米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)值用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，受試組和對(duì)照組間的比較用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素ANOVA 檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，并用鄧肯氏進(jìn)行多重比較，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

初篩低溫蛋白酶產(chǎn)生菌株及目標(biāo)菌株的菌落和菌體形態(tài)特征見(jiàn)圖1。

圖1 低溫蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選Fig.1 Screening of the strain producing cold-adaptive protease

初篩得到產(chǎn)蛋白酶的菌株32 株，通過(guò)圖1a 比較蛋白水解圈/菌落直徑比值，并在LB 中進(jìn)行產(chǎn)酶活性復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)編號(hào)YD37 菌株發(fā)酵液上清液酶活最大，可達(dá)33.1 U/mL。YD37 在LB 平板上的菌落直徑為2～3 mm，呈黃色、不透明（圖1b）。在TEM 下菌株有短桿狀和球狀兩種形態(tài)，細(xì)胞大小約0.5～1.5 μm，有鞭毛（圖1c，箭頭處）。

YD37 的16S rRNA 基因序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast N 比對(duì)，選擇相應(yīng)模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 YD37 的16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of YD37 strain

由圖2 可知，YD37 與2 株乙酰微小桿菌（E.acetylicum）聚類到一個(gè)進(jìn)化分支上，其相似性達(dá)99%。因此，初步判斷YD37 為E.acetylicum。將YD37 的16S rRNA 基因序列數(shù)據(jù)上傳到國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心（National Microbiology Data Center，NMDC），獲得序列號(hào)：NMDCN0000RC2。

YD37 菌株的理化性質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株YD37 生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical properties of YD37 strain

表1 的結(jié)果與《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology（Second Edition）》中對(duì)E.acetylicum 的描述一致，進(jìn)一步確定YD37 為E.acetylicum，將其命名為E.acetylicum YD37。同時(shí)《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology（Second Edition）》認(rèn)為E.acetylicum 具有短桿狀和球狀兩種形態(tài)，一般年幼細(xì)胞一般為短桿菌狀，年老之后則退化成球狀，同樣見(jiàn)于圖1c。Exiguobacterium 屬微生物分布極為廣泛，在深海、永久凍土和海鮮加工廠等低溫環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)[12]。其中，E.acetylicum 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種極具應(yīng)用價(jià)值的益生菌，其菌落呈黃色，色素至少包含了6 種胡蘿卜素，且在抗炎、抗腫瘤和抗氧化方面表現(xiàn)出應(yīng)用潛能[13]。

2.2 YD37 產(chǎn)低溫蛋白酶的分離純化與鑒定

YD37 發(fā)酵液離心后的上清液經(jīng)不同飽和度硫酸銨沉淀后上清液中殘余的酶活見(jiàn)圖3。

圖3 不同硫酸銨沉淀后上清液中相對(duì)殘余酶活Fig.3 Relative activity of enzyme in the supernatant after precipitation with ammonium sulfate

由圖3 可知，60%飽和度硫酸銨沉淀后的上清液中殘余酶活僅為3.2%，表明該濃度下可實(shí)現(xiàn)96.8%低溫蛋白酶的有效沉淀。

硫酸銨沉淀后的蛋白電泳及酶譜試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 沉淀蛋白的SDS-PAGE 及底物浸泡酶譜分析Fig.4 Electrophoresis and zymography of the precipitated protein

由圖4 可知，60%飽和度硫酸銨沉淀中主要存在兩條蛋白條帶，位于約30～45 kDa 之間。有報(bào)道顯示，不同微生物來(lái)源的低溫蛋白酶的分子量差異極大，從23 kDa 到115 kDa 不等[1]。采用底物浸泡酶譜法可在蛋白凝膠上定位低溫蛋白酶的位置[14-15]。底物浸泡酶譜法結(jié)果顯示45 kDa 處條帶出現(xiàn)具有明膠水解區(qū)域，表明該處條帶具有低溫蛋白酶活性。

用DEAE-80S 進(jìn)一步純化低溫蛋白酶后的蛋白電泳及電泳條帶的質(zhì)譜鑒定結(jié)果分別如圖5 和表2所示。

表2 蛋白酶的肽指紋圖譜驗(yàn)證Table 2 Identification of protease by peptide mass fingerprinting

圖5 DEAE 層析柱純化的蛋白電泳分析Fig.5 Electrophoresis of the protease purified by DEAE column

由圖5 可知，45 kDa 處的目的條帶位于0.3 mol/L的NaCl 洗脫組分中。由表2 可知，蛋白條帶水解后，共解析出13 條肽段。將各肽段與E.acetylicum 基因組推導(dǎo)出的蛋白序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所有序列可匹配到一條氨肽酶上（登錄號(hào)：WP_149427726.1）。因此，初步判斷該低溫蛋白酶可能是來(lái)源于E.acetylicum 的一種氨肽酶。

從E.acetylicum YD37 的基因組中克隆出氨肽酶基因，將克隆的該低溫蛋白酶基因及翻譯后的蛋白序列上傳到NMDC，獲得相應(yīng)的序列號(hào)：NMDCN-00011VG（核酸序列）和NMDCP0000001（蛋白序列）。該核酸序列含有1 110 bp 個(gè)堿基，編碼一條由370 個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其屬于Peptidase M29 家族，且不存在信號(hào)肽序列。在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)目的蛋白酶序列進(jìn)行Blast N 分析，發(fā)現(xiàn)同源性最高的4 條序列均注釋為金屬氨肽酶。

E.acetylicum YD37 氨肽酶序列其他微生物來(lái)源的4 條金屬氨肽酶序列對(duì)齊結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同微生物來(lái)源的金屬氨肽酶氨基酸序列比對(duì)Fig.6 Amino acid sequence alignment of aminopeptidases from microorganisms

由圖6 可知，對(duì)上述5 條序列進(jìn)行對(duì)齊后，其結(jié)合金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基E216、E281、E301、H308、H327 和D329 高度保守。綜上所述，本研究從E.acetylicum YD37 中分離的低溫蛋白酶屬于金屬氨肽酶。之前，有低溫環(huán)境中的Psychrophiles 產(chǎn)低溫氨肽酶的研究[15-16]，但尚未發(fā)現(xiàn)E.acetylicum 產(chǎn)氨肽酶的報(bào)道。

2.3 YD37 產(chǎn)酶的發(fā)酵工藝研究

溫度對(duì)E.acetylicum YD37 生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響見(jiàn)圖7。

圖7 溫度對(duì)YD37 生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of temperature on the growth and enzyme production of YD37

由圖7 可知，E.acetylicum YD37 的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃（OD 值14.4，酶活63.3 U/mL），而最適產(chǎn)酶溫度則為20 ℃（OD 值12.3，酶活85.0 U/mL）。胞外酶產(chǎn)生菌的熱抑制是低溫微生物的普遍特征，其最適生長(zhǎng)溫度常常高于最適產(chǎn)酶溫度[17]。類似的研究顯示，Chryseobacterium sp.和Planococcus sp.的最適生長(zhǎng)溫度菌均高于最適產(chǎn)低溫蛋白酶的酶溫度[18-19]。通過(guò)前期單因素和響應(yīng)面優(yōu)化研究，在50 L 規(guī)模的發(fā)酵罐中，對(duì)E.acetylicum YD37 產(chǎn)酶的中試工藝進(jìn)行研究，發(fā)酵24 h 后，經(jīng)檢測(cè)上清中酶活達(dá)到273.5 U/mL，較搖瓶水平的33.1 U/mL，提高了8.26 倍。通過(guò)優(yōu)化提高低溫蛋白酶產(chǎn)量的研究也見(jiàn)于相關(guān)報(bào)道，Wang 等[6]和Bia?kowska 等[20]分別通過(guò)優(yōu)化使菌株Colwellia sp.NJ341 和Sporobolomyces roseus LOCK 1 119 合成低溫蛋白酶的產(chǎn)量分別提高了3 倍和4 倍。極端微生物通常難以培養(yǎng)，未來(lái)低溫蛋白酶的規(guī)?；瘧?yīng)用，需要在極端微生物發(fā)酵工藝方面有所突破[9]。另一方面，使用基因工程菌對(duì)低溫蛋白酶進(jìn)行異源表達(dá)，可能也代表了低溫蛋白酶規(guī)模化生產(chǎn)的方向[1，9]。目前已有關(guān)于構(gòu)建低溫酶表達(dá)的基因工程菌的初步研究[8，21-22]。

2.4 低溫氨肽酶的表征

2.4.1 低溫氨肽酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

E.acetylicum YD37 產(chǎn)低溫氨肽酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，分子量和等電點(diǎn)分別為41 521.96 Da 和4.66。之前有研究對(duì)低溫酶結(jié)構(gòu)特征歸納，其序列中含有較多甘氨酸、丙氨酸等短側(cè)鏈氨基酸殘基，為構(gòu)象提供了更大的靈活性，而具有剛性結(jié)構(gòu)的脯氨酸則含量較低，同時(shí)三級(jí)結(jié)構(gòu)表面的親水性由帶負(fù)電荷的氨基酸提供[1，8，15]。本研究分離的低溫氨肽酶氨基酸序列中甘氨酸和丙氨酸殘基占比達(dá)14.9%，脯氨酸含量?jī)H有4.9%，帶負(fù)電荷氨基酸殘基占比高達(dá)15.4%。

通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該酶缺乏已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白（相似性均小于30%），因此采用線串法模擬結(jié)構(gòu)。E.acetylicum YD37 產(chǎn)低溫氨肽酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 氨肽酶的三維結(jié)構(gòu)模擬Fig.8 Three-dimensional structure modeling of the aminopeptidase

由圖8a 可知，待測(cè)序列同來(lái)源于肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）的氨肽酶同源性最高[23]，基于該模板預(yù)測(cè)350 個(gè)氨基酸殘基（95%的序列）已被模建，可信度為100%，結(jié)構(gòu)中包含了14 個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，19 個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)。由圖8b 可知，三級(jí)結(jié)構(gòu)被負(fù)電荷表面覆蓋（紅色區(qū)域）。由圖8c 可知，空間結(jié)構(gòu)C 端有兩個(gè)較大的空腔，空腔周圍存在較多短側(cè)鏈和親水性氨基酸殘基。作為可能的底物結(jié)合位點(diǎn)，低溫酶空腔周圍的短側(cè)鏈和親水性氨基酸殘基多于中溫酶，可為其提供更高的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)，進(jìn)而增強(qiáng)了其在低溫下的酶活[8，15]。

2.4.2 溫度、pH 值、金屬離子、有機(jī)試劑及蛋白酶抑制劑對(duì)低溫氨肽酶粗酶酶活的影響

溫度、pH 值、金屬離子、有機(jī)試劑及蛋白酶抑制劑對(duì)低溫氨肽酶粗酶酶活的影響見(jiàn)圖9。

圖9 溫度、pH 值、金屬離子、有機(jī)試劑及蛋白酶抑制對(duì)酶活的影響Fig.9 Effects of temperature，pH，metal ions，surfactant，and inhibitors on enzyme activity

由圖9A 可知，35 ℃酶活最高，為167.46 U/mL，在10 ℃和20 ℃的低溫條件下仍具有酶活，分別為36.9、73.0 U/mL，且不同溫度下酶活差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。低溫下具有較高酶活是低溫蛋白酶最主要的特征，據(jù)報(bào)道低溫蛋白酶溫度的作用范圍為10～60 ℃[1]。由圖9B 可知，隨著溫度升高，相對(duì)酶活逐漸降低，50 ℃處理組相對(duì)酶活完全喪失，表明該酶的溫度耐受性較差。研究表明，低溫蛋白酶難以耐受50 ℃以上的高溫環(huán)境[13，16，24]。對(duì)于高溫環(huán)境的不耐受是低溫蛋白酶的普遍特征，利用這一特性，通過(guò)熱處理可實(shí)現(xiàn)酶促反應(yīng)的有效控制[10]。由圖9C 可知，該酶最適pH 值為7.0，此時(shí)酶活達(dá)到147.33 U/mL，屬中性蛋白酶，不同pH 值的酶活差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。由圖9D 可知，該酶在pH6.0～8.0 內(nèi)孵育90 min，相對(duì)酶活均能保持在75%以上。但是當(dāng)pH 值小于6.0 或大于9.0 時(shí)，相對(duì)酶活急劇下降，表明該酶pH 值耐受范圍較窄。上述結(jié)果表明，低溫蛋白酶在低溫下保持酶活，可能需要犧牲其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。Huston 等[24]研究表明產(chǎn)自Colwellia psychrerythraea 34H 的低溫蛋白酶對(duì)溫度（＜45 ℃）和pH 值（6.0～8.5）耐受范圍同樣較窄。由圖9E 可知，酶活顯著受到Mn2+和Co2+激活，而Zn2+、Fe2+和Cu2+則表現(xiàn)出對(duì)酶活的抑制作用（P＜0.05），Ca2+和Mg2+對(duì)酶活的影響則不顯著（P＞0.05）。據(jù)報(bào)道，在已知的15 個(gè)氨肽酶家族中，M24 家族中常以Mn2+和Co2+作為活性中心[23]。因此本研究分離出的低溫氨肽酶可能屬于該家族。由圖9F 可知，粗酶在吐溫80 和曲拉通X-100 及漂白劑H2O2中酶活均保持83%以上；表明該酶在洗滌劑中具有應(yīng)用潛能[11]。SDS 對(duì)酶活抑制作用最強(qiáng)，達(dá)100%（P＜0.05）；表明氫鍵在酶促反應(yīng)中具有重要作用[25]。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF 和TPCK 對(duì)酶活表現(xiàn)出一定的抑制作用（P＜0.05）；表明該酶可能具有絲氨酸蛋白酶的某些特征[2]。金屬離子螯合劑EDTA的抑制作用最強(qiáng)，直接導(dǎo)致酶活喪失，進(jìn)一步表明該酶發(fā)揮作用需要金屬離子參與[24]。

2.4.3 低溫氨肽酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

Km和Vmax是酶促反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)常數(shù)，是酶催化效率的重要指標(biāo)。以不同濃度的酪蛋白為底物，采用Lineweave-Burk 雙倒數(shù)法作圖，得到蛋白吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.313 8X+0.226 7，R2=0.998 8，經(jīng)計(jì)算低溫蛋白酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km為1.38 mg/mL，Vmax為4.41 mg/（mL·min）。

3 結(jié)論

本研究從江蘇沿海地區(qū)的低溫土樣中分離得到1株能夠產(chǎn)低溫蛋白酶的E.acetylicum YD37。經(jīng)鑒定，該低溫蛋白酶屬于氨肽酶家族，該酶由370 個(gè)氨基酸殘基組成，氨基酸殘基組成和空間結(jié)構(gòu)模擬表明其符合低溫蛋白酶的一般特征。通過(guò)對(duì)E.acetylicum YD37產(chǎn)酶的工藝研究，酶活提高了8.26 倍。對(duì)該酶特征研究表明，酶活性依賴于Mn2+和Co2+；最適作用溫度為35 ℃，20 ℃仍有43.6%的活性，而50 ℃處理90 min 酶活則完全喪失；最適pH 值為6.0，僅可耐受pH6.0～8.0環(huán)境條件。因此，本研究分離的低溫蛋白酶可滿足洗滌、制革、食品加工和環(huán)境治理中對(duì)低溫環(huán)境的需求，同時(shí)高溫環(huán)境的不耐受和較窄的pH 值耐受范圍極大地方便了對(duì)酶促反應(yīng)的控制，使其具備了良好的應(yīng)用前景。