香菜多酚超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其生物活性

張波，連芯，2，楊若琦，孫紅艷*

（1.太原科技大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，山西 太原 030024；2.太原科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030024）

果蔬組織中存在的酚類物質(zhì)、類黃酮和花青素等植物次生代謝產(chǎn)物，與果蔬的色澤發(fā)育、品質(zhì)和風(fēng)味形成、抗逆性和抗病性等作用密切相關(guān)，還可影響果蔬的貯藏加工性能和營養(yǎng)價(jià)值[1]。其中，多酚類化合物已被列入天然抗氧化劑范疇，廣義的多酚類化合物可分為黃酮類、酚酸、單寧、芪類和木脂素類，具有一定的抗氧化能力、抗癌作用以及抗炎、抗菌等多種生物活性[2-3]。

香菜，學(xué)名芫荽，是我國南北各地普遍食用的一種蔬菜，以其特殊香味而深受喜愛，主要食用器官是莖葉。香菜的營養(yǎng)豐富，含有豐富的胡蘿卜素、維生素、鐵、鈣和磷等元素，具有較高的食用和藥用價(jià)值，同時(shí)具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抑制重金屬、抗糖尿病和抗抑郁癥等多種保健功能，可應(yīng)用于食品、飼料添加劑和重金屬吸附劑等領(lǐng)域[4-5]。香菜在食品中的應(yīng)用研究多處于初始加工階段，在香菜多酚的提取及其抗氧化活性方面僅有少量的研究。香菜中多酚的提取多采用亞臨界水萃取法、微波輔助提取法和超聲輔助提取法[6-8]。在天然抑菌劑方面，段斌等[9]對(duì)水提香菜精油抑菌作用的初步研究表明，其對(duì)部分微生物有較強(qiáng)的抑制作用。Kubo 等[10]證明了香菜中的揮發(fā)性化合物對(duì)霍亂沙門氏菌具有一定的抑菌活性，并分析了可能的抑菌原理。然而，在香菜多酚的提取工藝、抗氧化活性及抑菌活性等方面的研究均未得到很好的開發(fā)應(yīng)用。

超聲輔助提取法是利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等加速有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，顯著提高提取效率的提取方法。其設(shè)備便宜、操作簡單、提取時(shí)間短、多酚提取率高。

本研究以乙醇為溶劑，采用超聲輔助提取法，通過單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì)香菜多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用香菜提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料與主要試劑

新鮮香菜：市售；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC25923）、大腸桿菌（Escherichia coli）（ATCC 25322）：上海博湖生物科技有限公司；無水乙醇、福林酚試劑、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、濃鹽酸、溴水、硫酸亞鐵、雙氧水、碳酸鈉、鄰二氮菲、維生素C、氯化鈉、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鐵、醋酸鈉、冰醋酸、硫酸、鐵（III）-三吡啶三嗪（ferric-tri-pyridyl-triazine，F(xiàn)e3+-TPTZ）（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸緩沖溶液（pH7.4）：生工生物工程（上海）股份有限公司；多酚標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

PX125DZH 電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；XFB 粉碎機(jī)：吉首市中誠制藥機(jī)械廠；UV-2600i 紫外-可見分光光度計(jì)：山西凱米科技有限公司；5430R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：艾本德（中國）有限公司；THC-5B 實(shí)驗(yàn)室超聲波提取機(jī)：濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；DHG-9075A 烘干機(jī)：上海合恒儀器設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 香菜多酚提取工藝優(yōu)化

原料預(yù)處理：新鮮香菜去根洗凈晾干，置于60 ℃烘箱烘干12 h 至恒重后，用粉碎機(jī)粉碎過40 目篩，避光密封于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

多酚超聲輔助提取法提取多酚：稱取0.67 g 已預(yù)處理的香菜置于錐形瓶中，加70%乙醇至10 mL，用封瓶膜封口。超聲提取溫度60 ℃，功率100 W，3 次試驗(yàn)分別提取50、60、70 min 得到提取液，提取液分別在10 000 r/min 離心10 min，分別取上清液，即為香菜多酚提取液，置于4 ℃冰箱避光密封保存。

單因素試驗(yàn)：在文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上[11-13]，設(shè)定料液比1∶16（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間70 min。分別考察料液比1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%，提取時(shí)間40、50、60、70、80、90、100 min 對(duì)香菜多酚提取率的影響。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以香菜多酚提取率為指標(biāo)，選擇料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平Table 1 Experimental factor levels

2.2 香菜多酚濃度測(cè)定

采用福林酚法測(cè)定香菜多酚濃度[14-15]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算香菜多酚濃度及提取率。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：依次量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mL 于25 mL具塞試管中，分別加入1 mL 福林酚試劑，搖勻后，再加入2 mL 12%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻。室溫避光反應(yīng)2 h 后，在765 nm 波長下分別測(cè)定吸光度。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=120.11x-0.004 5（相關(guān)系數(shù)為0.992）。

香菜多酚濃度及提取率測(cè)定：取0.25 mL 香菜提取液，加1 mL 福林酚試劑，搖勻后再加入2 mL 12%Na2CO3，最后用蒸餾水定容至25 mL，搖勻。室溫避光反應(yīng)2 h，測(cè)定765 nm 處吸光度。多酚濃度按照沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算，多酚提取率按以下公式進(jìn)行計(jì)算，試驗(yàn)3 次取平均值。

式中：Y 為多酚提取率，mg/g；C 為多酚濃度，mg/mL；V 為提取液體積，0.25 mL；W 為原料質(zhì)量，0.67 g。

2.3 香菜多酚抗氧化活性分析

2.3.1 鐵離子還原／抗氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定

采用FRAP 法測(cè)定總抗氧化能力[16]，其原理是酸性條件下抗氧化物可以還原Fe3+-TPTZ 產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，隨后在593 nm 處測(cè)定吸光度即可獲得樣品的總抗氧化能力。以硫酸亞鐵（FeSO4）作標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.000 7x+0.034 6（相關(guān)系數(shù)為0.990 3；式中：y 為吸光度；x 為FeSO4濃度，μmol/L）。取2.7 mL FRAP 工作液進(jìn)行預(yù)熱，分別加入濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的香菜多酚提取液0.3 mL，靜置10 min，于593 nm 處測(cè)吸光度。6 組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，求平均值，計(jì)算得到FeSO4濃度，即FRAP 值，并與維生素C（VC，乙醇溶解）的FRAP 值作比較。

2.3.2 羥基自由基（·OH）清除能力測(cè)定

量取2 mL 0.75 mmol/L 鄰二氮菲溶液，加2 mL 150 mmol/L、pH7.4 的磷酸緩沖溶液，混勻。再加2 mL 0.75 mmol/L 硫酸亞鐵，混勻。最后加1 mL 0.01%H2O2，蒸餾水定容至10 mL，作為損傷管。37 ℃水浴60 min，測(cè)量539 nm 處吸光度Ap。未損傷管中用1 mL 蒸餾水代替H2O2，其他同損傷管，測(cè)得的吸光度記為Ab。樣品管以0.5 mL 香菜多酚提取液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL）樣品代替損傷管中的蒸餾水，蒸餾水定容至10 mL，測(cè)得的吸光度記為As，6 組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，并與維生素C（VC，乙醇溶解）的羥基自由基清除率進(jìn)行比較。羥基自由基清除率（R，%）的計(jì)算公式如下[17]。

2.4 香菜多酚抑菌活性試驗(yàn)

采用濾紙片法測(cè)定香菜多酚提取液對(duì)大腸桿菌（G-）和金黃色葡萄球菌（G+）的抑菌活性[7，18]。將經(jīng)過2 次活化的菌種于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，通過平板計(jì)數(shù)法使菌種濃度為108CFU/mL。將香菜多酚提取液稀釋成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 抗菌液。分別移取以上抗菌液10 μL 垂直滴于6 組直徑為10 mm 的滅菌圓濾紙上，備用。在超凈臺(tái)中分別向3 個(gè)培養(yǎng)皿中倒入培養(yǎng)基并冷卻。移取100 μL 經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌種均勻涂布于固體培養(yǎng)基上制成3 個(gè)含菌平板。將6 組含不同濃度抗菌液的濾紙按照濃度從小到大依次放入到平板中，每個(gè)平板包含2 張不同濃度的抗菌液濾紙和1 張空白對(duì)照濾紙，呈正三角平鋪間隔放入。以滅菌蒸餾水作為對(duì)照，放置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后測(cè)量抑菌圈直徑。重復(fù)3 次取平均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

本研究中所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Origin 2022 作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

3.1.1 料液比對(duì)香菜多酚提取率的影響

料液比對(duì)多酚提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)多酚提取率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of polyphenols

由圖1 可知，多酚提取率隨溶劑用量增加，呈先上升后緩慢降低的趨勢(shì)，在料液比為1∶16（g/mL）時(shí)，達(dá)到最大值。這是由于當(dāng)溶劑用量較少時(shí)，提取不完全，多酚提取率較低。隨著溶劑用量增多，香菜中的多酚逐漸浸出，當(dāng)料液比為1∶14、1∶16、1∶18（g/mL）時(shí)，多酚的提取率較高。隨著溶劑繼續(xù)增加，不僅多酚浸出，香菜中的雜質(zhì)也溶出，使得提取液中的多酚提取率降低[19]。因此，選擇料液比1∶16（g/mL）左右為宜。

3.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)香菜多酚提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of polyphenols

由圖2 可知，多酚提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%時(shí)，多酚的提取率僅為5.02 mg/g。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大時(shí)，香菜多酚提取率逐漸升高。乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，多酚提取率達(dá)到最大值，為8.06 mg/g。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，多酚提取率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。這是由于當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大時(shí)，較易溶出香菜中醇溶性雜質(zhì)脂類物質(zhì)，反而使得多酚提取率降低[20]。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%左右為宜。

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)香菜多酚提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of polyphenols

由圖3 可知，當(dāng)提取時(shí)間小于70 min 時(shí)，提取率與提取時(shí)間呈正相關(guān)；當(dāng)提取時(shí)間大于70 min 時(shí)，提取率與提取時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)提取時(shí)間為70 min 時(shí)，香菜多酚提取率達(dá)到最大值，為9.02 mg/g。當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，香菜多酚浸出不完全，提取率較低。隨著時(shí)間在一定范圍內(nèi)的不斷延長，香菜多酚提取率逐漸升高，達(dá)到最大提取率。當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，香菜多酚易被氧化，且香菜中的其他物質(zhì)也不斷溶出，導(dǎo)致多酚提取率降低。因此，合適的提取時(shí)間為70 min 左右。

3.2 正交試驗(yàn)

基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，依次確定料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的正交試驗(yàn)水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2 極差R 值可知，各影響因素對(duì)香菜多酚提取率的影響從大到小依次為料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間。香菜多酚超聲輔助提取最優(yōu)工藝條件：料液比1∶16（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、提取時(shí)間60 min，為正交試驗(yàn)表中的第6 組，最優(yōu)條件下多酚提取率為（13.11±0.19）mg/g。

3.3 香菜多酚抗氧化活性結(jié)果分析

3.3.1 香菜多酚總抗氧化能力

香菜多酚總抗氧化能力見圖4。

圖4 香菜多酚提取液總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capacity of cilantro polyphenol extracts

由圖4 可知，香菜多酚提取液和VC的FRAP 值均隨濃度增大而增加，且同等濃度下香菜多酚提取液的FRAP 值均小于VC。說明香菜多酚具有一定的抗氧化能力，但是抗氧化能力低于VC。

3.3.2 香菜多酚羥基自由基清除能力

香菜多酚羥基自由基清除能力見圖5。

圖5 香菜多酚提取液羥基自由基清除率Fig.5 Hydroxyl radical scavenging by cilantro polyphenol extracts

由圖5 可知，香菜多酚提取液對(duì)羥基自由基具有一定清除作用，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。但與VC的羥基自由基清除能力相比，還具有一定差距。試驗(yàn)中當(dāng)溶液濃度為0.6 mg/mL 時(shí)，VC的羥基自由基清除率達(dá)90%以上，而香菜多酚的羥基自由基清除率僅為60%左右。

3.4 香菜多酚抑菌活性

香菜多酚抑菌活性見表3。

表3 不同濃度香菜多酚提取液抑菌圈直徑Table 3 Diameter of the inhibition circle for different concentrations of cilantro polyphenoe extracts

由表3 可以看出，香菜多酚提取液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用。相同濃度的多酚提取液，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制強(qiáng)度大于對(duì)大腸桿菌的抑制強(qiáng)度。0.6 mg/mL 的香菜多酚提取液對(duì)大腸桿菌進(jìn)行活性測(cè)試的抑菌圈直徑為（6.76±0.02）mm，對(duì)金黃色葡萄球菌活性測(cè)試的抑菌圈直徑為（7.04±0.02）mm。抑菌圈直徑與香菜多酚提取液濃度呈正相關(guān)，隨著香菜多酚提取液濃度升高，抑菌圈直徑增大。

4 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了超聲輔助提取香菜多酚的最優(yōu)工藝條件：料液比1∶16（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、提取時(shí)間60 min，此時(shí)，提取率為（13.11±0.19）mg/g。影響效果依次為料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。通過FRAP 法和鄰二氮菲法測(cè)定香菜多酚的抗氧化能力和羥基自由基清除能力，結(jié)果顯示，香菜多酚具有一定的抗氧化活性，且抗氧化能力和羥基自由基清除率與提取液濃度呈正相關(guān)。最后，對(duì)香菜多酚提取液的抑菌活性進(jìn)行了研究，證明香菜多酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定抑制作用。抑制強(qiáng)度大小排序?yàn)閷?duì)金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌；且抑菌圈直徑與香菜多酚提取液濃度相關(guān)。本研究為香菜多酚的開發(fā)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。