乳酸菌作為生物活性物質(zhì)體內(nèi)遞送載體的研究進(jìn)展

陳韞慧，夏永軍，宋 馨，艾連中，王光強(qiáng)

（上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

生物活性物質(zhì)可以調(diào)節(jié)人體生命活動(dòng)，維持人體健康，包括蛋白質(zhì)、多肽、多酚、黃酮等多種化合物，1982年美國食品和藥品監(jiān)管總局批準(zhǔn)了重組人胰島素的使用，促進(jìn)了生物活性分子在疾病治療中的應(yīng)用[1]。蛋白質(zhì)和多肽等生物活性分子經(jīng)口服傳遞時(shí)要經(jīng)受胃介質(zhì)的酸性和胃腸道環(huán)境中分泌的各種降解酶等的破壞，使其功效的發(fā)揮具有極大難度[2-3]，因此，生物活性物質(zhì)的遞送成為熱門研究領(lǐng)域。為通過口服途徑有效傳遞蛋白質(zhì)和多肽等活性物質(zhì)，許多策略被用于提高其口服生物利用度，如化學(xué)改性、使用pH敏感性腸溶衣包埋、添加蛋白酶抑制劑等[4]。然而，這些方法都存在局限性：由于胃腸道環(huán)境中pH值變化范圍廣、降解酶種類多樣，腸溶衣和蛋白酶抑制劑的可靠性和效率不能確定，而化學(xué)改性方法存在降低目標(biāo)蛋白生物活性的可能性[5]。為克服上述問題，細(xì)菌常被用作體內(nèi)遞送載體以防止活性物質(zhì)在消化道運(yùn)輸過程中的快速降解[6]。本文將重點(diǎn)討論乳酸菌作為生物活性物質(zhì)體內(nèi)遞送載體的研究進(jìn)展。

乳酸菌在自然界中廣泛存在，常定植于植物和哺乳動(dòng)物腸黏膜，在生長(zhǎng)過程中釋放共軛亞油酸、多胺、細(xì)菌素和酚類化合物衍生物等生物活性化合物，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)健康的作用[7-9]。由于存在長(zhǎng)期的安全食用歷史，乳酸菌通常被認(rèn)為是一種安全的食品級(jí)載體。同時(shí)，易于獲得的參考基因組和高通量多組學(xué)分析手段提供了乳酸菌功能基因和調(diào)控元件的關(guān)鍵信息；由此開發(fā)的一系列遺傳工具使乳酸菌作為細(xì)菌載體的可操作性和兼容性極大增強(qiáng)[10-11]。在乳酸菌載體中，乳酸乳球菌與乳酸桿菌中的一些屬（植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌等）應(yīng)用最為廣泛。乳酸乳球菌作為一種在胃腸道中短暫定植的模式微生物，具有成熟的質(zhì)粒載體與表達(dá)系統(tǒng)，是生物活性物質(zhì)生產(chǎn)的理想宿主。而乳酸桿菌在胃腸道內(nèi)定植時(shí)間更長(zhǎng)，并且可以引起強(qiáng)烈的局部和全身免疫反應(yīng)，是一種很有潛力的黏膜遞送載體[3]。本文聚焦于蛋白質(zhì)和多肽這類易被破壞的生物活性物質(zhì)，首先介紹乳酸菌遞送載體中影響基因表達(dá)的重要因素，包括啟動(dòng)子、復(fù)制子等，然后詳細(xì)論述生物活性物質(zhì)不同的表達(dá)形式，最后介紹乳酸菌遞送系統(tǒng)在各類疾病中的應(yīng)用情況。

1 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)

乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)中的重要元件包括：具有相關(guān)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子、用于篩選陽性重組菌株的選擇性標(biāo)記以及用于維持乳酸菌宿主系統(tǒng)中重組質(zhì)粒的復(fù)制子。這些元件的功能與效率將直接影響乳酸菌載體的穩(wěn)定性和承載能力。

1.1 啟動(dòng)子

啟動(dòng)子控制基因表達(dá)起始時(shí)間和表達(dá)程度，是表達(dá)載體的關(guān)鍵元件，可以分為組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子兩種。P23、P32、P44等都是乳酸菌中常見的組成型啟動(dòng)子[12]。組成型啟動(dòng)子的調(diào)控不受外界條件影響且基因的表達(dá)具有持續(xù)性，因此當(dāng)需要在體內(nèi)進(jìn)行原位生產(chǎn)或需要穩(wěn)態(tài)基因表達(dá)時(shí)一般使用組成型啟動(dòng)子[13]。Hazebrouck等[14]將牛β-乳球蛋白基因插入到干酪乳桿菌染色體中內(nèi)源性的組成型啟動(dòng)子下游并成功表達(dá)，在第1天與第6天灌胃重組菌株后連續(xù)收集小鼠的新鮮糞便并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該重組菌株可有效定植腸道，且在小鼠體內(nèi)β-乳球蛋白可持續(xù)分泌10 周以上，有效治療了小鼠的過敏癥狀。

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可識(shí)別特定轉(zhuǎn)錄因子激活基因表達(dá)，在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到生物活性分子的高水平表達(dá)[15]。Peirotén等[16]介紹了乳酸菌中用于基因表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，常見的有細(xì)菌素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、碳水化合物誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及鋅誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等。其中，基于雙組分系統(tǒng)開發(fā)的細(xì)菌素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子通過添加相應(yīng)的肽信息素誘導(dǎo)基因表達(dá)，應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子通過pH值、溫度、膽汁鹽或NaCl等環(huán)境脅迫條件誘導(dǎo)基因表達(dá)，而碳水化合物誘導(dǎo)型啟動(dòng)子通常來源于碳水化合物相關(guān)代謝途徑的操縱子，比如乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。盡管使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制生產(chǎn)的生物活性物質(zhì)可以在體內(nèi)發(fā)揮作用，但在使用這些重組菌株之前需事先添加誘導(dǎo)劑以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，不能實(shí)時(shí)控制菌株中基因的表達(dá)。因此，應(yīng)激誘導(dǎo)型這類不需要外部添加誘導(dǎo)劑、可以響應(yīng)體內(nèi)環(huán)境信號(hào)并進(jìn)行原位生產(chǎn)活性分子的啟動(dòng)子具有極高的應(yīng)用潛力。Zhao Chenming等[17]構(gòu)建了通過酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P170表達(dá)草酸鹽脫羧酶的重組乳酸菌并灌胃大鼠，結(jié)果表明酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子P170顯著緩解了高草酸尿癥的癥狀。Chien等[18]在大腸桿菌中將環(huán)境響應(yīng)型啟動(dòng)子如厭氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子、乳酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及pH誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與細(xì)菌生長(zhǎng)相結(jié)合，通過邏輯門電路構(gòu)建多路復(fù)用的生物防護(hù)回路。未來相似的設(shè)計(jì)可以應(yīng)用于乳酸菌，通過邏輯門設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)未來特定生理區(qū)域的精確定位，控制生物活性分子的有效表達(dá)，提高療效并避免脫靶毒性。

1.2 選擇性標(biāo)記

大多數(shù)質(zhì)粒依靠抗生素標(biāo)記物，如紅霉素和氯霉素抗性基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子選擇和質(zhì)粒維持。然而，抗生素基因的存在會(huì)增加抗生素耐藥性轉(zhuǎn)移到菌株外部環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)。出于生物防護(hù)的需要，近些年研究人員開發(fā)了多種基于非抗生素顯性選擇標(biāo)記或互補(bǔ)選擇標(biāo)記替代常規(guī)抗生素標(biāo)記物的方法。非抗生素顯性選擇標(biāo)記主要通過細(xì)菌素耐藥性或重金屬耐受性基因進(jìn)行選擇，如乳酸鏈球菌素抗性基因以及一些耐鎘離子、銅離子的抗性基因[19]。值得注意的是，重金屬抗性標(biāo)記的使用會(huì)在菌體培養(yǎng)階段引入有毒害作用的重金屬離子，且在胃腸道中很難找到相關(guān)環(huán)境維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，因此，這種標(biāo)記并不適用于生物活性物質(zhì)的體內(nèi)遞送。

互補(bǔ)標(biāo)記通常需要在宿主染色體基因中敲除特定代謝途徑中重要的或賦予其某種表型特性的關(guān)鍵基因，同時(shí)在質(zhì)粒載體上攜帶相應(yīng)的互補(bǔ)基因[20]。因此，這種標(biāo)記只能在對(duì)特定菌株進(jìn)行基因組編輯之后才能使用。特別的是，糖類互補(bǔ)標(biāo)記不需要對(duì)基因組進(jìn)行編輯，而是通過將乳酸菌自身不能發(fā)酵的糖作為單一碳源并表達(dá)其互補(bǔ)基因以維持菌株的生長(zhǎng)和質(zhì)粒的穩(wěn)定性[21]。在各類互補(bǔ)標(biāo)記中，丙氨酸消旋酶使用最為廣泛，該基因可以催化L-丙氨酸與D-丙氨酸的相互轉(zhuǎn)化，而D-丙氨酸是細(xì)菌肽聚糖合成和脂質(zhì)酸代謝中的關(guān)鍵底物[22]。II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白[23]、殼聚糖酶[24]、治療蛋白P8[25]以及草酸鹽脫羧酶[22]等重組蛋白都已在含丙氨酸消旋酶互補(bǔ)標(biāo)記的乳酸菌中成功表達(dá)。除此之外，Yin Sheng等[26]將植物乳桿菌的膽鹽水解酶作為互補(bǔ)標(biāo)記，將脫氧膽酸鈉作為選擇脅迫來源添加到培養(yǎng)基中以篩選轉(zhuǎn)化子，結(jié)果顯示重組菌株在生長(zhǎng)50 代后質(zhì)粒丟失率僅為0.1%。由于胃腸道環(huán)境中存在多種膽鹽，該互補(bǔ)標(biāo)記可以作為乳酸菌遞送載體構(gòu)建中的一種選擇，但需要考慮膽鹽水解酶的過量表達(dá)是否存在潛在的健康威脅。

1.3 復(fù)制機(jī)制

獨(dú)立的復(fù)制系統(tǒng)是在生產(chǎn)過程中維持基于質(zhì)粒編碼蛋白表達(dá)系統(tǒng)的基本要求之一。乳酸菌中存在兩種常見的質(zhì)粒復(fù)制機(jī)制，分別為滾動(dòng)循環(huán)復(fù)制（rollingcircle replication，RCR）和θ復(fù)制。RCR需要復(fù)制起始蛋白（replication initiation protein，Rep）、雙鏈起源（double-strand origin，DSO）和單鏈起源（single-strand origin，SSO）這3 種遺傳元件，而θ復(fù)制需要Rep、復(fù)制起源和宿主編碼的聚合酶[27]。RCR型質(zhì)粒通常體積較小并具有多個(gè)拷貝，其復(fù)制通過質(zhì)粒編碼的Rep與DSO的特異性結(jié)合而啟動(dòng)并產(chǎn)生單鏈DNA復(fù)制中間體，然后啟動(dòng)SSO滯后鏈合成，轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA[28]。θ復(fù)制型質(zhì)粒的復(fù)制子種類多樣，質(zhì)粒的DNA合成可以是單向或雙向，并且可以從多個(gè)位點(diǎn)開始，與RCR質(zhì)粒相比，由于其不存在中間復(fù)制體，θ復(fù)制型質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和分離穩(wěn)定性都較高，適合作為大型DNA片段的載體[29]。近年來，乳酸菌載體中使用較多的幾種復(fù)制子分別是RCR型的pWV01、pSH71以及θ復(fù)制型的pCI305、pMB1和pAMβ1[27]。例如，基于高拷貝數(shù)pSH71重復(fù)子開發(fā)的pNZ系列載體和誘導(dǎo)表達(dá)型的pSIP系列載體已廣泛用于乳酸菌中[30]。目前，對(duì)于乳酸菌質(zhì)粒復(fù)制子和穿梭載體的開發(fā)仍在進(jìn)行中。Eom等[31]對(duì)明串珠菌CB2567的θ復(fù)制型質(zhì)粒pCB42進(jìn)行表征并構(gòu)建大腸桿菌和乳酸菌的穿梭載體，在植物乳桿菌中成功表達(dá)報(bào)告蛋白β-半乳糖苷酶，可以作為乳酸菌蛋白表達(dá)和遞送的工具。

2 生物活性物質(zhì)的表達(dá)形式

生物活性物質(zhì)在乳酸菌中的表達(dá)形式主要有3 種：在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)、分泌表達(dá)以及通過表面展示技術(shù)錨定在乳酸菌的細(xì)胞膜或者細(xì)胞壁上。不同的表達(dá)形式會(huì)影響功能蛋白或肽段的作用效果，但目前哪種表達(dá)形式效果最佳仍沒有定論，需要在具體的研究中綜合考慮。

2.1 胞內(nèi)表達(dá)

在傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)策略中，重組蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累并需要通過外部機(jī)械作用或化學(xué)方法將其釋放，這些程序可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活并使下游純化過程復(fù)雜化。一些研究表明，乳酸菌遞送載體在腸道中經(jīng)各類消化酶、抗菌肽、噬菌體處理或與其他細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)后可被裂解并釋放細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的異源蛋白[32]。例如，羅伊氏乳桿菌VPL1014的前噬菌體在胃腸道運(yùn)輸過程中被激活，促使細(xì)菌裂解并釋放胞內(nèi)積累的瘦素蛋白[33]。Grangette等[34]使用具有細(xì)胞壁生物合成缺陷（丙氨酸消旋酶基因突變）的重組乳酸菌遞送胞內(nèi)抗原后發(fā)現(xiàn)，其免疫原性較野生菌株更強(qiáng)，這也證明了細(xì)胞裂解遞送策略的可行性。但這種方法需要考慮胞內(nèi)蛋白的生產(chǎn)濃度以及可溶性，并且很多異源蛋白對(duì)宿主具有毒性，無法在胞內(nèi)大量積累[35]。

2.2 分泌表達(dá)

乳酸菌具有一個(gè)高效的分泌表達(dá)系統(tǒng)，分泌蛋白可與機(jī)體細(xì)胞相互作用并發(fā)揮治療效果。分泌表達(dá)策略需要在目標(biāo)蛋白N端起始位置加入信號(hào)肽（signal peptide，SP）序列，其可以將相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽引導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)膜并分泌到外部環(huán)境。SP通常具有保守的三區(qū)結(jié)構(gòu)，分別是帶正電荷的氨基末端N區(qū)、中央的疏水核心H區(qū)和包含信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)的極性羧基末端結(jié)構(gòu)域C區(qū)[36]?；谏疃冗f歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和隱馬爾科夫模型開發(fā)的網(wǎng)站SignalP常用于預(yù)測(cè)SP的切割位點(diǎn)和跨膜螺旋[37]。由于不同SP在膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的輸送效率不同，其與靶蛋白組合后mRNA轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也不同，因此篩選靶蛋白的最佳SP序列是提高分泌效率的關(guān)鍵步驟[38-39]。

目前，來自乳酸乳球菌分泌蛋白Usp45的SP是乳酸菌中利用最廣泛的SP之一，其他較為常見的還有來自化膿性鏈球菌M6蛋白和短乳桿菌S層蛋白的SP[40]。研究發(fā)現(xiàn)天然SP與異源SP相似或具有更高的分泌效率[41]。Mathiesen等[42]基于植物乳桿菌的全基因組序列測(cè)試了76 種假定的內(nèi)源SP功能特性，發(fā)現(xiàn)82%的SP具有分泌信號(hào)的作用。Chen等[43]選擇來自植物乳桿菌的155 種預(yù)測(cè)SP和來自乳酸片球菌的110 種預(yù)測(cè)SP，通過雙重復(fù)子策略和DNA組裝技術(shù)構(gòu)建穿梭載體并建立高通量細(xì)胞文庫，成功鑒定了12 種植物乳桿菌SP和8 種乳酸片球菌SP。這些SP豐富了構(gòu)建乳酸菌分泌表達(dá)載體的工具箱。表1中所示為來源于不同宿主的SP在分泌異源蛋白質(zhì)中的應(yīng)用情況。

表1 使用不同來源的SP分泌表達(dá)功能蛋白Table 1 Secretory expression of functional proteins using signal peptides from different sources

2.3 表面展示

活性分子分泌后完全暴露于體內(nèi)惡劣的胃腸道環(huán)境與各種蛋白水解酶中，而乳酸菌的單細(xì)胞膜和相對(duì)較厚的細(xì)胞壁為靶蛋白錨定在細(xì)胞表面從而降低暴露程度提供了機(jī)會(huì)。許多研究均表明乳酸菌的表面展示技術(shù)可以提高異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和作用效果，特別是在遞送抗原時(shí)能夠更好地誘導(dǎo)特定的系統(tǒng)性免疫反應(yīng)和黏膜毒性細(xì)胞免疫反應(yīng)[51]。當(dāng)靶蛋白從細(xì)胞內(nèi)易位到胞外后可以通過多種方式錨定在細(xì)胞表面，如可以使用脂蛋白錨或使用分選酶通過LPXTG基序共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞表面，也可以通過結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行非共價(jià)連接[52]。使用不同的錨定元件會(huì)使靶蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)生變化。由于嵌入細(xì)胞表面的程度可能會(huì)影響蛋白的作用效果，研究人員需要根據(jù)靶蛋白預(yù)期暴露程度選擇不同的錨定元件[53-54]。

脂蛋白錨的N端SP末尾存在脂質(zhì)盒基序，脂蛋白易位后SP被脂盒特異性信號(hào)肽酶SPase II切割，脂蛋白將共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞膜的磷脂雙分子層[52]。Zadravec等[55]評(píng)價(jià)了來自乳酸乳球菌的堿性膜蛋白A（basic membrane protein A，BmpA）作為脂蛋白錨的能力。作為顯示IgG結(jié)構(gòu)域的錨點(diǎn)，BmpA蛋白在其C末端被截?cái)嗖⒂尚〉酱螽a(chǎn)生了9 個(gè)變體，其在截?cái)?4 個(gè)殘基后信號(hào)最強(qiáng)，隨著蛋白分子的逐步縮短，表面展示能力逐步降低，這表明融合蛋白中脂蛋白錨本身的長(zhǎng)度在易位和結(jié)合過程中十分重要。LPXTG基序的蛋白含有C端細(xì)胞壁分選信號(hào)，其序列為亮氨酸（L）、脯氨酸（P）、X（任何氨基酸）、蘇氨酸（T）和甘氨酸（G），當(dāng)N端SP通過分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外時(shí)，其帶電尾部的疏水區(qū)域仍固定在細(xì)胞膜上，分選酶在甘氨酸和蘇氨酸殘基之間切割使蛋白解離并共價(jià)結(jié)合至細(xì)胞壁[56-57]。已有研究對(duì)比了脂蛋白錨和LPXTG錨對(duì)靶蛋白的作用效果。Kuczkowska等[58]利用來自植物乳桿菌的脂蛋白錨Lp_1261和LPXTG錨Lp_2578成功展示了結(jié)核分枝桿菌的AgE6抗原，并證明了其在黏膜免疫疫苗中的應(yīng)用潛力；此外，Kuczkowska等通過比較兩種錨點(diǎn)的亞細(xì)胞定位與免疫原性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)使用脂蛋白錨的融合蛋白嵌入了細(xì)胞壁內(nèi)部，并在鼻內(nèi)和口服黏膜遞送中均引起更強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答，而使用LPXTG錨點(diǎn)后熒光顯示在細(xì)胞壁表面[58]。

非共價(jià)錨定策略不僅可以選擇乳酸菌作為重組蛋白表達(dá)的宿主，含有非共價(jià)錨定結(jié)構(gòu)域的融合蛋白還可以在大腸桿菌等表達(dá)菌株中生產(chǎn)并純化，然后反式錨定到野生型乳酸菌菌株中，其過程如圖1所示[59]。非共價(jià)的表面顯示系統(tǒng)需要為靶蛋白選擇合適的細(xì)胞壁錨定基序。Pfam數(shù)據(jù)庫中已描述了幾種可以與細(xì)菌肽聚糖結(jié)合的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度在20～200 個(gè)氨基酸殘基之間，可含有多個(gè)重復(fù)序列，并且可以位于融合蛋白的中心、N端或C端[60]。LysM賴氨酸基序的氨基酸殘基數(shù)為42～65，多以重復(fù)序列的方式出現(xiàn)，可特異性非共價(jià)結(jié)合到肽聚糖的N-乙酰葡萄糖殘基上，是最為常見的一種細(xì)胞壁結(jié)合域[61]。來自發(fā)酵乳桿菌溫帶噬菌體φPYB5的內(nèi)溶素Lyb5蛋白C末端的3 個(gè)假定LysM重復(fù)基序與靶蛋白融合后可與嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌等多種乳酸菌表面結(jié)合，具有作為新型錨點(diǎn)的潛力[62]。另外，SH3結(jié)構(gòu)域多發(fā)現(xiàn)于厚壁菌門的細(xì)菌中，有多個(gè)亞型且不同亞型的結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞壁結(jié)合的靶點(diǎn)有所不同，如SH3_5可結(jié)合肽聚糖的五聚糖肽橋，而SH3_6與肽聚糖的交聯(lián)莖肽發(fā)生相互作用[63]。其他推定的結(jié)構(gòu)域如ChW結(jié)構(gòu)域、WXL結(jié)構(gòu)域、CPL-7結(jié)合域等在乳酸菌表面展示中的報(bào)道較少。Plavec等[64]篩選了來自乳酸菌與其噬菌體的LysM、CW_1、Cpl-7、WxL、SH3和ChW等15 個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合效率，其中ChW結(jié)合域顯示出良好的錨定適用性。更多潛在的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)域還有待研究者開發(fā)。

圖1 常見乳酸菌表面工程（A）與反式乳酸菌表面工程（B）的區(qū)別Fig.1 Difference between common lactic acid bacterial surface engineering (A) and trans lactic acid bacteria surface engineering (B)

3 乳酸菌呈遞系統(tǒng)在各類疾病中的應(yīng)用

3.1 黏膜感染

由于黏膜表面不斷暴露于病原體和抗原，許多感染因子或抗原可以通過黏膜穿透身體并感染呼吸道和胃腸道，從而導(dǎo)致高發(fā)病率和疾病風(fēng)險(xiǎn)[65]?？诜虮莾?nèi)接種基于乳酸菌的疫苗是控制黏膜感染的一種有前途的方法，乳酸菌可以在免疫原性和反應(yīng)原性之間取得理想的平衡，通過在血液和黏膜部位誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)以有效地實(shí)現(xiàn)免疫激活[66]。乳酸菌的黏膜疫苗可以避免抗原降解并促進(jìn)其在胃腸道的攝取，刺激適應(yīng)性免疫反應(yīng)，而口服抗原在許多研究中只能觀察到耐受性免疫反應(yīng)[67]。但這些重組乳酸菌疫苗的有益效果根據(jù)產(chǎn)生的抗原、使用的載體菌株和所針對(duì)的不同傳染病而存在較大差異。表2羅列了近年來基于乳酸菌載體開發(fā)的針對(duì)不同病原體的黏膜免疫疫苗。

表2 乳酸菌黏膜免疫疫苗Table 2 Mucosal immunization vaccines based on lactic acid bacteria

隨著乳酸菌疫苗平臺(tái)的持續(xù)開發(fā)，增強(qiáng)疫苗的保護(hù)性免疫原性已成為一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。黏膜免疫誘導(dǎo)位點(diǎn)組成黏膜相關(guān)淋巴網(wǎng)狀組織網(wǎng)絡(luò)并向黏膜效應(yīng)器部位提供連續(xù)的記憶B細(xì)胞和T細(xì)胞，需要各種策略提高乳酸菌載體將抗原遞送到免疫誘導(dǎo)位點(diǎn)的效率[78]。樹突狀細(xì)胞是研究最為廣泛的抗原遞送靶標(biāo)，其在細(xì)胞表面和內(nèi)部具有專門的模式識(shí)別受體，在捕獲、處理和呈遞抗原方面起核心作用[79]。樹突狀細(xì)胞能夠與B細(xì)胞和T細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，介導(dǎo)B細(xì)胞的IgA類切換，sIgA、Th1和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)增加并誘導(dǎo)整合素α4β7的分泌[80]。乳酸菌疫苗的靶向性主要通過特異性樹突狀細(xì)胞結(jié)合肽與抗原的融合表達(dá)實(shí)現(xiàn)，而樹突狀細(xì)胞結(jié)合肽的篩選則是通過噬菌體表面顯示技術(shù)在體外進(jìn)行[81]。多項(xiàng)研究證明乳酸菌疫苗中樹突狀細(xì)胞結(jié)合肽的存在可以增加體內(nèi)sIgA和血清IgG并引起潛在的免疫增強(qiáng)作用，但其效率會(huì)受到樹突狀細(xì)胞肽自身靶向性、抗原刺激水平及乳酸菌呈遞抗原的方式影響[82-83]。微折疊細(xì)胞（M細(xì)胞）是黏膜相關(guān)淋巴組織特化的上皮細(xì)胞，它們?nèi)狈︷ひ悍置?，具有稀疏的糖萼、高?nèi)吞活性且其基底外側(cè)區(qū)室與局部單核吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞相鄰[84]。腸道相關(guān)淋巴組織是M細(xì)胞富集區(qū)域，可采樣和攝取抗原并將其輸送到潛在的免疫系統(tǒng)，因而也成為靶標(biāo)的主要區(qū)域[85]。與上述方法相似的策略是開發(fā)基于M細(xì)胞的靶向配體，如具有環(huán)狀構(gòu)象的靶向肽CKS9，其不僅能夠與抗原融合表達(dá)，也可與細(xì)胞因子如IL-6融合表達(dá)充當(dāng)免疫佐劑以增強(qiáng)黏膜免疫反應(yīng)[32,86]。Zhang Fudong等[87]將M細(xì)胞靶向配體Co1耦合到口蹄疫病毒的多抗原表位TB1上構(gòu)建重組乳酸乳球菌疫苗，可調(diào)節(jié)特異性T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，而TB1-Co1的組合相比TB1可誘導(dǎo)更強(qiáng)的黏膜和體液免疫反應(yīng)，其中體液免疫占主導(dǎo)地位。呼腸孤病毒蛋白σ1與M細(xì)胞表面糖蛋白2的特異性分子FIMH蛋白等配體在其他細(xì)菌載體中也有涉及[88]，后續(xù)可研究其在乳酸菌疫苗中的應(yīng)用。

3.2 炎癥性腸病

由于乳酸菌已被證明能夠調(diào)控腸道的微生態(tài)平衡，開發(fā)表達(dá)治療分子的重組乳酸菌并遞送到腸道已成為作為針對(duì)炎癥性腸病的替代療法[89]。炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）主要包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，克羅恩病會(huì)引起透壁炎癥，且伴隨有膿腫、瘺管等并發(fā)癥，而潰瘍性結(jié)腸炎的特征是結(jié)腸的黏膜炎癥[90]。潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病共同的炎癥和組織損傷癥狀使抗炎細(xì)胞因子如IL-10、IL-27和IL-35等成為目標(biāo)治療蛋白，其中最早投入研究的是IL-10[91-92]。事實(shí)上，分泌IL-10的重組乳酸菌已用于開展治療克羅恩病的臨床試驗(yàn)，但由于分泌于胃腸道內(nèi)的IL-10濃度較低，臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想[2]。因此，一些研究將目標(biāo)轉(zhuǎn)移到其他抗炎細(xì)胞因子，以期其發(fā)揮免疫抑制作用并誘導(dǎo)機(jī)體自身生產(chǎn)IL-10。Hanson等[93]使用乳酸乳球菌遞送免疫抑制細(xì)胞因子IL-27治療結(jié)腸炎，小腸結(jié)腸炎的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型中IL-27二聚體減輕了結(jié)腸和小腸的病理變化并降低了結(jié)腸中促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)，其治療效果依賴于T細(xì)胞分泌的IL-10。在此基礎(chǔ)上，McLean等[94]發(fā)現(xiàn)分泌表達(dá)IL-27的重組乳酸乳球菌LL-IL-27在急性結(jié)腸炎中改善了黏膜潰瘍，顯著降低了促炎細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平并使結(jié)腸黏膜中性粒細(xì)胞浸潤減少。Wang Jianyong等[95]使用乳酸乳球菌遞送小鼠IL-35預(yù)防硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化得到顯著緩解，固有層中Th17與Treg細(xì)胞比例降低，結(jié)腸組織和血清中細(xì)胞因子IL-10水平增加。此外，Aubry等[96]構(gòu)建產(chǎn)生胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的乳酸乳球菌菌株LL-TSLP，該物質(zhì)是一種多效的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，LL-TSLP的治療通過在結(jié)腸炎早期階段誘導(dǎo)Treg增殖延緩了疾病活動(dòng)指數(shù)的增加。

除表達(dá)抗炎蛋白外，其他治療策略還包括遞送中和促炎因子的抗體、干擾炎癥信號(hào)通路傳導(dǎo)等[97]。例如，絲氨酸蛋白酶抑制劑Elafin和分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑，在通過重組乳球菌給藥時(shí)均表現(xiàn)出較IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β兩種抗炎細(xì)胞因子更好的保護(hù)作用[98]。Plavec等[99]在乳酸乳球菌表面成功展示了IL-23受體拮抗劑REX蛋白，其可以與IL-23R-IgG嵌合體相互作用并抑制促炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)中細(xì)胞因子IL-17A的分泌，具有作為IBD治療分子的潛力。

3.3 糖尿病

1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）和2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是臨床上最常見的兩種糖尿病分型，重組乳酸菌已被認(rèn)為是糖尿病現(xiàn)有療法的潛在替代方案。T1DM是一種內(nèi)分泌疾病，通常是由于自身免疫性遭到破壞且胰腺β細(xì)胞停止產(chǎn)生胰島素[100]。Mao Ruifeng等[101]通過抗原特異性療法設(shè)計(jì)表達(dá)的單鏈胰島素SCI-59類似物具有在3T3-L1脂肪細(xì)胞表面結(jié)合和激活胰島素受體的能力，通過乳酸菌載體口服遞送后可以增強(qiáng)非肥胖糖尿病（non-obese diabetes，NOD）小鼠的葡萄糖耐量，顯著減輕胰島炎癥并恢復(fù)小鼠的胰島素分泌能力。Cook等[102]將胰島素原和IL-10在乳酸乳球菌中共表達(dá)并口服遞送，結(jié)合低劑量抗CD3治療成功恢復(fù)了NOD小鼠的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。特別的是，Lang Junchao等[103]將中性粒細(xì)胞胞外陷阱作為T1DM胰腺早期病理性損傷的靶標(biāo)，使用重組乳球菌分泌葡萄球菌核酸酶靶向干預(yù)，有效調(diào)節(jié)NOD小鼠的血糖水平并延緩T1DM的發(fā)展。T2DM表現(xiàn)的高血糖水平癥狀主要由慢性炎癥引起的胰腺β細(xì)胞損傷后胰島素分泌不足引起[104]。同樣，目前已開發(fā)了多種針對(duì)T2DM的重組乳酸菌。例如，口服分泌胰高血糖素樣肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）的重組植物乳桿菌7 周后，自發(fā)型T2DM模型猴的空腹血糖濃度可以降至正常水平[105]。Exendin-4作為一種GLP-1的受體激動(dòng)劑，也被認(rèn)為是T2DM的良好治療藥物[106]。Zeng Zhu等[107]開發(fā)了基于乳酸菌NICE系統(tǒng)的Exendin-4肽原位口服遞送系統(tǒng)，該遞送系統(tǒng)顯著增強(qiáng)了INS-1細(xì)胞的胰島素分泌并激活了PI3K/AKT信號(hào)通路，具有良好的應(yīng)用潛力。

3.4 癌癥

癌癥是一種以異常細(xì)胞不受控制增殖為特征的疾病，這些異常細(xì)胞具有侵襲性并且能夠從原發(fā)部位擴(kuò)散到機(jī)體健康組織[108]。腫瘤微環(huán)境的一個(gè)重要特征是缺氧。乳酸菌作為一種兼性厭氧細(xì)菌，具有靶向缺氧區(qū)域的能力，同時(shí)其益生特性規(guī)避了其他減毒菌株逆轉(zhuǎn)或突變的風(fēng)險(xiǎn)[109]。

使用重組乳酸菌預(yù)防或治療癌癥有許多種策略，通過免疫調(diào)節(jié)防治腫瘤最為常見。16型人乳頭瘤病毒多見于宮頸癌的早期病變組織，其抗原靶標(biāo)E6、E7已由乳酸菌成功表達(dá)并于近期投入臨床試驗(yàn)[110]。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4是一種免疫檢查點(diǎn)分子，在T細(xì)胞上表達(dá)并抑制腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫，其單鏈可變抗體已在乳酸乳球菌載體中表達(dá)并證明具有生物活性，有望作為一種癌癥治療方案[111]。另外一種常見策略是通過細(xì)胞毒性蛋白攻擊腫瘤細(xì)胞以產(chǎn)生抗腫瘤作用。P8蛋白是一種由鼠李糖乳桿菌分泌的治療性蛋白，在先前的研究中，研究人員證明P8可以特異性易位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，通過p53-p21信號(hào)通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2期阻滯，發(fā)揮抗增殖活性[112]。Chung等[25]使用戊糖片球菌作為載體分泌治療蛋白P8治療結(jié)直腸癌，當(dāng)口服工程細(xì)菌后，小鼠的結(jié)腸癌細(xì)胞異種移植模型與化學(xué)誘導(dǎo)模型中的腫瘤生長(zhǎng)均被顯著抑制。其他相關(guān)的重組蛋白，如腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體[113]、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制肽Kiss-1[114]等，均已通過乳酸菌載體成功表達(dá)并在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證明具有特異性腫瘤殺傷性，還需進(jìn)一步研究它們?cè)隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的作用效果。

3.5 其他

除以上幾種常見疾病外，重組乳酸菌可以利用口服耐受機(jī)制，預(yù)防或治療多種自身免疫性疾病以及過敏癥狀?？诜褪苄酝ǔＶ竿ㄟ^口服途徑預(yù)先給予抗原，通過特異性抑制抗原的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)以防止超敏反應(yīng)[115]。研究表明，通過重組乳酸菌持續(xù)遞送熱休克蛋白65——一種可誘導(dǎo)T細(xì)胞的高免疫原性抗原，可以防止或減輕小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腦脊髓炎等多種自身免疫疾病的發(fā)生或發(fā)展[116-118]。在上述實(shí)驗(yàn)中均觀察到IL-10水平的升高與干擾素γ的降低。Kasare??o等[119]通過重組乳酸乳球菌遞送髓鞘蛋白的腦源性抗原片段，減少了實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎大鼠的組織病理學(xué)變化，可以作為口服耐受多發(fā)性硬化癥的一種替代策略。同樣，在過敏性疾病的治療中，經(jīng)重組乳酸菌遞送的樺樹花粉、雪松花粉、塵螨、牛奶等過敏原均可抑制小鼠特異性IgE反應(yīng)，有效減輕過敏癥狀[120]。

4 結(jié)語

近年來，隨著對(duì)乳酸菌益生特性機(jī)制研究的不斷深入以及遺傳工具箱的擴(kuò)展，乳酸菌成為活體細(xì)菌療法的理想底盤。但相較于模式菌株乳酸乳球菌，片球菌、鏈球菌、乳桿菌等菌株的基因組與表型具有高度的多樣性，仍需要投入大量精力開發(fā)其遺傳操作工具與基因表達(dá)系統(tǒng)。并且，由于乳酸菌影響宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制具有菌株特異性，受宿主與微生物之間的復(fù)雜相互作用影響，不同菌株的效應(yīng)分子與宿主機(jī)體的免疫反應(yīng)機(jī)理仍需闡明，這將決定該宿主菌株的適用性。

乳酸菌作為活性分子的遞送載體在動(dòng)物模型中顯示出高功效。然而，在這些乳酸菌載體進(jìn)入臨床轉(zhuǎn)化之前需要確保其符合各種健康監(jiān)管機(jī)構(gòu)制定的指導(dǎo)方針，如抗生素耐藥基因不能出現(xiàn)在工程菌株中以防止基因轉(zhuǎn)移帶來的健康問題[121]?；贑RISPR的基因組編輯技術(shù)為包括乳酸菌在內(nèi)的下一代細(xì)胞工廠開辟了道路。正如之前有關(guān)大腸桿菌的報(bào)道[122]一樣，未來利用乳酸菌也可構(gòu)建復(fù)雜的遺傳邏輯電路，通過感知和響應(yīng)環(huán)境信號(hào)提高生物治療分子的作用效果。