微酸性電解水對采后西蘭花葉綠素降解的影響

韓 穎，孫 瑩，郭 峰，王馨渝，趙安琪，吳朝霞，李鵬霞,3，李國鋒,3，胡花麗,3,*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)設(shè)施與裝備研究所，江蘇 南京 210014；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210014）

西蘭花（Brassica oleraceaL.var.italica）又稱青花菜、嫩芽花椰菜等，屬十字花科，因富含硫代葡萄糖苷、蘿卜硫素等活性物質(zhì)而具有抗癌、防癌的功效[1]。但由于西蘭花采收后呼吸代謝旺盛，貯運過程中極易出現(xiàn)組織萎蔫、花蕾黃化現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其市場價值[2]。因此，研究有效的保鮮方法來延緩西蘭花黃化衰老至關(guān)重要。

微酸性電解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）是通過電解NaCl稀溶液或稀鹽酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成的產(chǎn)物[3]。與常用的含氯消毒劑相比較，SAEW不僅可以高效殺菌，還能保持食品的物理品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和感官特性，被廣泛應(yīng)用于果蔬、糧油和水產(chǎn)品等的殺菌保鮮中[4]。例如，Chen Guanwen等[5]證實SAEW能夠通過降低李斯特菌胞內(nèi)過氧化氫酶等酶的活力，打破細胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）平衡來破壞其細胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等物質(zhì)，從而達到殺菌效果；Liu Lin等[6]闡明了隨有效氯濃度（available chlorine concentration，ACC）的增加，SAEW產(chǎn)生的細胞內(nèi)ROS含量明顯升高，致使腐生希瓦氏菌和腐生葡萄球菌失活的殺菌機制。國內(nèi)外學(xué)者不僅針對SAEW的殺菌機制進行了大量研究，還將其應(yīng)用在果蔬保鮮中。唐志龍等[7]發(fā)現(xiàn)SAEW凝膠能抑制微生物的繁殖，延緩天麻切片品質(zhì)劣變；周然等[8]采用SAEW結(jié)合殼聚糖處理水蜜桃來減緩酚類的積累，進而延緩果肉的變色；也有研究發(fā)現(xiàn)將SAEW結(jié)合真空預(yù)冷可有效延緩采后雞毛菜黃化衰老進程，維持其營養(yǎng)品質(zhì)[9]；本課題組前期的研究結(jié)果也顯示，SAEW不僅能抑制采后西蘭花菌落總數(shù)的增加，且能有效抑制采后西蘭花花蕾中葉綠素的降解，延緩西蘭花花蕾的黃化進程[10]。

果蔬中黃化癥狀的發(fā)生與其組織內(nèi)葉綠素降解有關(guān)。果蔬中的葉綠素以葉綠素a和葉綠素b的形式存在，葉綠素b轉(zhuǎn)化為葉綠素a，葉綠素a受到葉綠素相關(guān)代謝酶和相關(guān)基因的調(diào)控，轉(zhuǎn)化為非綠色熒光物質(zhì)代謝物的形式，最終導(dǎo)致黃化[11]。據(jù)報道，葉綠素a在去鎂離子去植基生成脫鎂葉綠酸a的過程中有兩條途徑，作用于這兩條途徑的關(guān)鍵酶分別是葉綠素代謝酶、脫鎂螯合酶（Mg-dechelatase，MDCase）和脫鎂葉綠素酶（pheophytinase，PPH），生成的脫鎂葉綠酸a在脫鎂葉綠素a加氧酶（pheophorbide a oxygenase，PAO）作用下生成初代熒光葉綠素代謝產(chǎn)物[12]。近年來，大量研究證實了通過調(diào)控葉綠素代謝相關(guān)酶及其基因從而影響果蔬色澤的可行性。如李雪瑞等[13]采用1-甲基環(huán)丙烯結(jié)合低溫抑制葉菜中葉綠素代謝酶和PPH的活性，緩解組織中葉綠素的降解，延緩其黃化；曹婷婷等[14]通過藍光協(xié)同乙烯處理，對蜜橘果皮葉綠素代謝相關(guān)基因進行調(diào)控，促進果實中葉綠素衍生物的降解，從而加速果實轉(zhuǎn)色；任亞梅[15]通過多種方法處理獼猴桃，所得結(jié)果都證實了葉綠素相關(guān)代謝酶影響著其葉綠素衍生物的含量。然而截至目前，尚鮮見SAEW調(diào)控西蘭花葉綠素代謝的報道。

基于此，本研究以西蘭花為材料，詳細分析了SAEW對采后西蘭花葉綠素降解的影響，以期為SAEW處理調(diào)控采后果蔬的黃化機制提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花購自江蘇省南京市眾彩批發(fā)市場。采購后1 h內(nèi)送回江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院裝備所處理室。挑選體積、成熟度基本一致，顏色翠綠的西蘭花作為實驗材料。

葉綠素a、葉綠素b 美國Sigma公司；甲醇、乙酸乙酯（均為色譜純） 美國Avantor Performance Materials公司；丙酮、鹽酸、硫酸 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；無水乙醚 南京化學(xué)試劑股份有限公司；石油醚 成都市科龍化工試劑廠；氯化鉀、無水硫酸鈉、磷酸二氫鉀、正己烷 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Tris、Triton X-100 北京索萊寶科技有限公司；PAO酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 江蘇晶美生物科技有限公司；Plant Total RNA Isolation Kit Plus 成都福際生物技術(shù)有限公司；First Strand cDNA Synthesis Kit 美國Thermo Scientific Revert Aid公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，編號Q311-02）試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL202-L電子天平、Seven Multi pH計 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國Agilent公司；3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；UV-1102型紫外-可見分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司；A11 Basic型液氮研磨器 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；KY-II型水浴式氮吹儀 安簡（北京）科技有限公司；CR-400全自動測色色差儀 日本Konica Minolta公司；Epoch酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；Zqty-70振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；CFX connect型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative PCR，qPCR）儀 美國Bio-Rad公司；“賜綠得”微酸性次氯酸水生成器 南京氯盾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SAEW的制備

以氯化鈉溶液作為輔液，自來水為原水，用微酸性次氯酸水生成器電解生成SAEW。采用Seven Multi pH計對SAEW的pH值進行測定，碘量法測定其ACC。經(jīng)測定，所制備SAEW的pH值為6.5，ACC為85 mg/L。以ACC為85 mg/L的SAEW為母液，后續(xù)實驗所需不同質(zhì)量濃度SAEW用自來水進行稀釋。

1.3.2 采后西蘭花處理

通過前期的濃度篩選實驗發(fā)現(xiàn)[10]，SAEW對采后西蘭花葉綠素降解、丙二醛積累及組織黃化的影響呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)，其中50 mg/L SAEW處理的效果最好。因此本次實驗中選擇50 mg/L SAEW。將挑選的西蘭花隨機分成兩組，每組含約300 個花球，分別浸泡于自來水（CK）和50 mg/L SAEW中15 min，取出瀝干后裝入4.5 L帶孔樂扣盒中（共27 盒），然后置于（15±1）℃貯藏4 d，期間每天取樣1 次，每組隨機取3 盒，每盒20～25 個小花球（直徑約5.8 cm）。取花球周邊部位及中心部位的花蕾為材料，置于液氮中速凍并存放在－80 ℃冰箱中保存，用于測定相關(guān)指標(biāo)。測定指標(biāo)時用液氮研磨器粉碎混勻，以保證取樣具有代表性。

1.3.3 色差測定

參考紀(jì)淑娟等[16]的方法，利用CR-400全自動測色色差計（直徑1.1 cm）測定花球的色度，花球的大小和凸面基本可完全覆蓋色差計的鏡頭。分別在L*（亮度）、a*（紅綠度）、b*（黃藍度）和h°（色相角）模式下平行測定15 次。

1.3.4 總?cè)~綠素含量的測定

參考Hu Huali等[17]的方法并稍作修改。取0.5 g經(jīng)液氮研磨器研磨后的西蘭花粉末，加入5 mL 體積分?jǐn)?shù)80%丙酮溶液，避光常溫浸提6 h，過濾后取上清液，以體積分?jǐn)?shù)80%丙酮溶液為空白校零，分別測定在642 nm和665 nm波長處提取液的吸光度，重復(fù)測定3 次，按式（1）～（3）分別計算總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量。

式中：C表示總?cè)~綠素含量/（μg/g）；Ca表示葉綠素a含量/（μg/g）；Cb表示葉綠素b含量/（μg/g）；V表示提取液總體積/mL；m表示樣品質(zhì)量/g；1 000為轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.3.5 葉綠素衍生物含量的分析

葉綠素a、b標(biāo)準(zhǔn)品分別用－20 ℃預(yù)冷丙酮溶解。

脫鎂葉綠素的制備參照Gloria等[18]的方法。取3 mL葉綠素丙酮溶液（500 μg/mL），慢慢滴加30 μL鹽酸（1 mol/L），邊加邊振蕩。2 min后加入乙醚萃取，同時添加純凈水去除多余的酸（洗滌2～3 次）。氮吹儀吹干后溶于2 mL經(jīng)－20 ℃預(yù)冷的丙酮。

脫植基葉綠素的制備參考Chen Kewei等[19]的方法：稱取橙皮樣品10 g，充分研磨后用冷丙酮浸提脫色3 次，離心（10 000×g、4 ℃、20 min），殘渣在10 mL 5 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.24% Triton X-100和50 mmol/L KCl，pH 7.0）中4 ℃下浸提2 h，離心（10 000×g、4 ℃、10 min），上清液加無水硫酸銨析出蛋白后離心10 min（10 000×g、4 ℃），蛋白溶于3 mL磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L、pH 7.0）中。加入1 mL葉綠素丙酮溶液（150 μg/mL），再加入5 mL Tirs-HCl緩沖液（100 mmol/L、pH 8.0），37 ℃下于恒溫振蕩培養(yǎng)箱反應(yīng)1 h。乙醚萃取，氮吹儀吹干后溶于2 mL經(jīng)－20 ℃預(yù)冷的丙酮。

脫鎂葉綠酸的制備采用Sievers等[20]的方法：取500 μL脫植基葉綠素加入濃鹽酸30 μL，邊加邊振蕩。2 min后加入乙醚萃取，同時添加純凈水去除多余的酸（洗滌2～3 次）。氮吹儀吹干后溶于2 mL經(jīng)－20 ℃預(yù)冷的丙酮。

樣品處理參考Roca等[21]的方法并略作修改。取0.5 g經(jīng)液氮研磨器研磨后的西蘭花粉末，加入10 mL經(jīng)－20 ℃預(yù)冷的丙酮超聲浸提至組織無色，過濾。將上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，等體積加入NaCl溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%），再加入2 倍總體積的乙醚萃取，靜置分層后棄去下層，向上層的乙醚相加入15 mL超純水重復(fù)2 次。乙醚相用無水硫酸鈉干燥后氮氣吹干，溶于2 mL經(jīng)－20 ℃預(yù)冷的丙酮，過0.22 μm有機濾膜等待上樣。

HPLC條件參考An Ronghui等[22]的方法。流動相A為色譜級甲醇-超純水（3∶1，V/V），流動相B為色譜級乙酸乙酯；柱溫：35 ℃；檢測波長：430 nm；進樣量：20 μL；洗脫程序：0～10 min，80%～60% A；10～34 min，60%～20% A；34～38 min，20%～80% A；38～43 min，80% A，流速為1.0 mL/min。

1.3.6 葉綠素降解相關(guān)酶活力的測定

1.3.6.1 葉綠素酶活力的測定

葉綠素酶（chlorophyll metabolizing enzyme，Chlase）液提取參照Funamoto等[23]的方法，取0.5 g經(jīng)液氮研磨器研磨后的西蘭花粉末，加入10 mL經(jīng)－20 ℃預(yù)冷的丙酮浸提至組織變白。殘渣于4 ℃避光放置12 h后，加入2.5 mL 5 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（含2.4 g/L Triton X-100和50 mmol/l KCl，pH 7.0），4 ℃浸提1 h后離心（10 000×g、4 ℃、15 min），上清液為酶提取液。

酶活力的測定參照Aiamla等[24]的方法，取0.1 mL葉綠素a丙酮溶液（0.1 μmol/mL），加入0.5 mL Tris-HCl緩沖液（100 mmol/L）和0.5 mL Chlase提取液。30 ℃水浴避光浸提1 h后，加入4 mL經(jīng)－20 ℃預(yù)冷的丙酮結(jié)束反應(yīng)，再加入4 mL正己烷，劇烈搖動，分層后取丙酮層離心（10 000×g、4 ℃、10 min），測定667 nm波長處吸光度，以每分鐘OD667nm變化0.01表示1 個酶活力單位。

1.3.6.2 MDCase活力的測定

酶提取液制備方法同1.3.6.1節(jié)。

反應(yīng)底物的制備參考Kaewsuksaeng等[25]的方法：取4.5 mL 8.0 μg/mL的葉綠素a溶液，加1.12 mL蒸餾水，加入丙酮使其終體積分?jǐn)?shù)為80%，加入8.4 mL石油醚劇烈搖動。上層的醚相被分離，用4.2 mL蒸餾水洗滌3 次，然后加入50 μL甲醇（含30% KOH），此時脫鎂葉綠酸a開始沉淀，將脫鎂葉綠酸a沉淀物溶于10 mL蒸餾水得到脫鎂葉綠酸a溶液，將其用1 mol/L Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH值至9.0，即得到MDCase的底物溶液。

MDCase活力的測定參考Hornero等[26]的方法，取0.8 mL 50 mmol/L Tris-HCl溶液（含0.1% Triton X-100，pH 9.0）、100 μL葉綠酸a溶液和500 μL酶提取液，總體積為1.4 mL。將混合物于25 ℃培養(yǎng)30 min，在687 nm波長處測定吸光度，以每分鐘OD687nm變化0.01表示1 個酶活力單位。

1.3.6.3 PPH活力的測定

參考Aiamla等[24]的方法測定PPH活力。

底物的制備：取10 mL 89.29 μg/mL葉綠素a溶液加入一滴0.1 mol/L HCl，待反應(yīng)2 min后加入0.5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，作為PPH的底物溶液。

取0.5 g經(jīng)液氮研磨器研磨后的西蘭花粉末，加入8 mL經(jīng)－20 ℃預(yù)冷的丙酮浸提至組織變白。殘渣于4 ℃避光放置12 h后，加入5 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0），4 ℃條件下提取1 h后離心（10 000×g、4 ℃、15 min），上清液即為酶提取液。

酶活力的測定：將0.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 8.0）、150 μL脫鎂葉綠素a丙酮溶液和500 μL酶提取液混合?；旌衔镌?5 ℃反應(yīng)40 min，加入2 mL經(jīng)－20 ℃預(yù)冷的丙酮終止反應(yīng)。在667 nm波長處測定吸光度，以每分鐘OD667nm變化0.01表示1 個酶活力單位。

1.3.6.4 PAO活力的測定

按照植物PAO ELISA試劑盒說明書進行PAO活力測定。

1.3.7 RNA的提取和cDNA的合成

RNA的提取和cDNA的合成參照劉紅艷等[27]的方法，略作修改。西蘭花組織總RNA的提取按照Plant Total RNA Isolation Kit Plus說明書完成。西蘭花cDNA的合成按照First Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作?？傮w系20.00 μL，總RNA 500.00 ng，GoldenstarTMRandomer 1.00 μL，5×GoldenstarTMBuffer 4.00 μL，dNTP Mix 1.00 μL，DTT 1.00 μL，GoldenstarTMRT6 1.00 μL，用RNase-free water補足至20.00 μL。之后于25 ℃反應(yīng)10 min，55 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 min。產(chǎn)物置于－80 ℃冰箱備用。

1.3.8 實時熒光qPCR分析

以Actin為內(nèi)參基因，測定葉綠素b還原酶（chlorophyll b reductase，BoNYC1/BoNOL）、葉綠素酶1（chlorophyllase 1，BoCLH1）、葉綠素酶2（chlorophyllase 2，BoCLH2）、滯綠蛋白（chlorosis protein，BoSGR）、脫鎂葉綠素酶（pheophytinase，BoPPH）、脫鎂葉綠酸a氧化酶（pheophorbide a oxygenase，BoPAO）、紅色葉綠素降解產(chǎn)物還原酶（red chlorophyll catabolite reductase，BoRCCR）和衰老特異性半胱氨酸蛋白酶（aging specific cysteine protease，BoSAG12）編碼基因的表達量。

qPCR根據(jù)ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書完成?？偡磻?yīng)體系20.00 μL，包括2×SYBR Premix ExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）10.00 μL，PCR Forward Primer 0.60 μL，PCR Reverse Primer 0.60 μL，DNA模板1.00 μL，ddH2O（滅菌蒸餾水）7.80 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。詳細引物序列見表1，每個樣品設(shè)3 次重復(fù)。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)為3 次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。兩個處理之間的差異顯著性分析采用SPSS 26軟件進行t檢驗，以P＜0.05表示差異顯著，采用Duncan法進行多重比較，用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SAEW對采后西蘭花外觀品質(zhì)的影響

由圖1可知，采后西蘭花隨貯藏時間的延長而逐漸黃化。在貯藏第3天時，CK組西蘭花出現(xiàn)輕微黃化，在貯藏第4天時黃化嚴(yán)重。相比之下，經(jīng)SAEW處理的西蘭花在貯藏第3天時仍有較好的外觀品質(zhì)，貯藏至第4天時才出現(xiàn)輕微的黃化現(xiàn)象?？梢姡琒AEW處理可顯著延緩采后西蘭花的黃化進程，延長貨架期。

圖1 SAEW對采后西蘭花外觀品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of SAEW on the appearance quality of postharvest broccoli

2.2 SAEW對采后西蘭花色差的影響

色澤是果蔬質(zhì)量重要的衡量指標(biāo)。L*值代表西蘭花花蕾的亮度，在整個貯藏階段，SAEW對西蘭花的亮度影響較大，顯著低于CK組（第1、3、4天）（圖2A）。a*值代表西蘭花花蕾的紅綠度，隨著褪綠性的增加而升高，在貯藏后期（3～4 d）CK組西蘭花花蕾綠色衰減加劇，a*值顯著高于SAEW處理組（圖2B）。b*值代表西蘭花花蕾的黃藍度，隨西蘭花花蕾黃化程度加劇而升高，從圖2C可以看出，在貯藏初期CK組西蘭花花蕾b*值從14.57升高至33.57，而SAEW處理組第4天的b*值為24.75，極顯著低于CK組。h°值表示顏色飽和度，h°值越小說明西蘭花花蕾黃化越明顯，在貯藏后期（3～4 d），CK組西蘭花花蕾的h°值極顯著低于SAEW處理組（圖2D）。綜上，在整個在貯藏過程中，SAEW處理顯著抑制了西蘭花花蕾L*、a*、b*值的上升及h°值的下降，有效維持了西蘭花的色澤。

圖2 SAEW處理對采后西蘭花色差L*（A）、a*（B）、b*（C）和h°（D）值的影響Fig.2 Effect of SAEW treatment on the L* (A),a* (B), b* (C)和h° (D)values of postharvest broccoli

2.3 SAEW對采后西蘭花葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量的影響

通過分光光度法分析采后貯藏期間西蘭花葉綠素含量的變化情況，由圖3可以看出，在整個貯藏期間，西蘭花組織中的葉綠素a（圖3A）、葉綠素b（圖3B）和總?cè)~綠素（圖3C）含量均呈現(xiàn)逐漸減少的特點；而SAEW處理可有效減緩采后西蘭花中葉綠素含量的下降。在貯藏第1～4天，SAEW處理組西蘭花的總?cè)~綠素含量分別為434.39、404.39、394.15 μg/g和232.42 μg/g，分別是CK組的1.12、1.10、1.61 倍和1.40 倍?？梢?，SAEW處理能顯著抑制采后西蘭花在貯藏期間葉綠素的降解。

圖3 SAEW處理對采后西蘭花葉綠素a（A）、葉綠素b（B）和總?cè)~綠素（C）含量的影響Fig.3 Effect of SAEW treatment on the chlorophyll a (A),b (B) and total chlorophyll (C) contents in postharvest broccoli

2.4 SAEW對采后西蘭花葉綠素降解代謝產(chǎn)物的影響

采用HPLC法評估了葉綠素及其代謝產(chǎn)物的變化情況。

2.4.1 SAEW對采后西蘭花葉綠素a和葉綠素b含量的影響

由圖4可看出，在整個貯藏期，西蘭花組織中的葉綠素a（圖4A）和葉綠素b（圖4B）含量均呈下降趨勢，與分光光度法分析結(jié)果一致。在貯藏第1、3、4天，SAEW處理組西蘭花葉綠素a含量分別為342.63、263.76 μg/g和165.24 μg/g，分別是CK組的1.08、1.40 倍和1.72 倍；在貯藏第3、4天，SAEW處理組采后西蘭花葉綠素b含量分別為41.56 μg/g和20.24 μg/g，分別是CK組的1.67 倍和2.59 倍，極顯著高于CK組。可見，SAEW處理可以有效減緩采后西蘭花在貯藏期間葉綠素a和葉綠素b的降解，這與色差及總?cè)~綠素含量的分析結(jié)果一致。

圖4 SAEW處理對采后西蘭花葉綠素a（A）和葉綠素b（B）含量的影響Fig.4 Effect of SAEW treatment on the chlorophyll a (A) and chlorophyll b (B) contents in postharvest broccoli

2.4.2 SAEW對采后西蘭花脫植基葉綠素a和脫植基葉綠素b含量的影響

在整個貯藏期，西蘭花組織中脫植基葉綠素a和脫植基葉綠素b含量總體呈下降趨勢，在經(jīng)SAEW處理的采后西蘭花中呈下降-上升-下降的波動趨勢，但大部分時間均高于CK組（圖5）。在貯藏第2、3、4天，SAEW處理組西蘭花脫植基葉綠素a含量分別為246.98、162.72、83.31 μg/g，分別比CK組高33.1%、43.7%和37.6%；且SAEW處理組西蘭花脫植基葉綠素b含量在貯藏第3、4天有所上升，分別為110.40 μg/g和106.40 μg/g，其分別較CK組高34.0%和26.5%?？梢姡琒AEW處理可有效延緩采后西蘭花中脫植基葉綠素a和脫植基葉綠素b的降解。

圖5 SAEW處理對采后西蘭花脫植基葉綠素a（A）和脫植基葉綠素b（B）含量的影響Fig.5 Effect of SAEW treatment on the chlorophyllide a (A) and chlorophyllide b (B) contents in postharvest broccoli

2.4.3 SAEW對采后西蘭花脫鎂葉綠酸a和脫鎂葉綠素a含量的影響

如圖6A所示，在整個貯藏期間采后西蘭花組織中脫鎂葉綠酸a含量呈下降趨勢。SAEW處理組西蘭花脫鎂葉綠酸a含量在貯藏第3、4天分別為0.83 mg/g和0.26 mg/g，分別是CK組的1.61 倍和2.99 倍，極顯著高于CK組。如圖6B所示，在貯藏第1～4天，采后西蘭花組織中脫鎂葉綠素a含量整體呈下降趨勢，而SAEW處理有效延緩了西蘭花中脫鎂葉綠素a的降解速率。尤其在貯藏第3、4天，SAEW處理組西蘭花組織中脫鎂葉綠素a含量分別為104.20 μg/g和101.87 μg/g，分別是CK組的1.53 倍和1.41 倍?？梢?，SAEW處理在貯藏后期（3～4 d）可大幅延緩采后西蘭花組織中脫鎂葉綠酸a和脫鎂葉綠素a的降解。

圖6 SAEW處理對采后西蘭花脫鎂葉綠酸a（A）和脫鎂葉綠素a（B）含量的影響Fig.6 Effect of SAEW treatment on the pheophorbide a (A) and pheophytin a (B) contents in postharvest broccoli

2.5 SAEW對采后西蘭花葉綠素降解酶活力的影響

采后西蘭花中相關(guān)葉綠素降解酶活力影響著其葉綠素的降解速度。如圖7A所示，兩組西蘭花在貯藏前期（1～2 d）組織中Chlase活力無明顯差異。在貯藏第3天時，CK組與SAEW處理組西蘭花組織中Chlase活力達到峰值，分別為2.98 U/g和2.38 U/g，CK組極顯著高于SAEW處理組；在貯藏第4天時，雖兩組Chlase活力都有所下降，但SAEW處理組出現(xiàn)大幅下降，較CK組（2.77 U/g）低60.6%。可見，SAEW處理能較好地抑制西蘭花在貯藏期間Chlase活力的升高。

圖7 SAEW處理對采后西蘭花Chlase（A）、MDCase（B）、PPH（C）和PAO（D）活力的影響Fig.7 Effect of SAEW on the activities of Chlase (A),MDCase (B),PPH (C) and PAO (D) in postharvest broccoli

隨著貯藏時間的延長，CK組采后西蘭花組織中MDCase活力呈先上升后下降的變化趨勢，雖然經(jīng)SAEW處理的采后西蘭花組織中MDCase活力呈緩慢上升趨勢，但顯著低于CK組（圖7B）。在貯藏期第1～4天，SAEW處理組西蘭花中MDCase活力分別為1.09、1.09、1.15 U/g和1.25 U/g，分別較CK組低50.2%、51.3%、36.8%和27.3%，且在貯藏第1～3天時SAEW處理組西蘭花中MDCase活力極顯著低于CK組?？梢?，SAEW處理能較好地抑制西蘭花在貯藏期間MDCase活力的升高。

如圖7C所示，兩組西蘭花組織中PPH活力均呈上升-下降-上升的變化趨勢。與CK組相比，SAEW處理明顯抑制了西蘭花中PPH活力的上升。在貯藏期第1～4天，SAEW處理組西蘭花的PPH活力分別為0.98、0.56、0.59 U/g和1.50 U/g，分別比同期CK組低61.9%、86.9%、74.0%和46.4%（P＜0.01）。綜上，SAEW處理對抑制西蘭花貯藏期間PPH活力的升高有顯著效果。

如圖7D所示，CK組西蘭花中PAO活力顯著高于SAEW處理組。在貯藏1、2、3 d和4 d時，SAEW處理組西蘭花中PAO活力分別為0.13、0.15、0.15 U/g和0.17 U/g，分別比同期CK組低27.8%、16.7%、34.8%和29.2%，且在貯藏第1、3、4天時有極顯著差異。可見，SAEW處理能較好地抑制西蘭花在貯藏期間PAO活力的升高。

2.6 SAEW對采后西蘭花葉綠素代謝相關(guān)基因表達的影響

BoNYC1和BoNOL在葉片衰老過程中對調(diào)控葉綠素b降解和捕光復(fù)合體II降解發(fā)揮重要作用。由圖8A、B可知，SAEW處理抑制了西蘭花中BoNYC1和BoNOL的表達，使其在貯藏第3、4天時與CK組出現(xiàn)極顯著差異；且在第3天時達到峰值，SAEW處理組西蘭花BoNYC1和BoNOL的表達量極顯著低于CK組。說明SAEW處理可顯著抑制采后西蘭花中BoNYC1和BoNOL的表達。

圖8 SAEW處理對采后西蘭花葉綠素代謝相關(guān)基因表達的影響Fig.8 Effect of SAEW on the expression of chlorophyll metabolismrelated genes in postharvest broccoli

BoCLH1和BoCLH2可催化葉綠素生成脫植基葉綠素和植醇。在整個貯藏期間，兩組西蘭花中BoCLH1的表達量均呈先下降后上升的趨勢，且CK組顯著高于SAEW處理組（圖8C）。CK組與SAEW處理組西蘭花中BoCLH2的表達呈上升-下降-上升的趨勢（圖8D）。在貯藏第3、4天時，SAEW處理極顯著地抑制了西蘭花中BoCLH1和BoCLH2的表達。

在整個貯藏期間，兩組西蘭花中BoSGR的表達量均呈先上升后下降的趨勢，在貯藏第3天達到峰值（圖8E）。在貯藏第1～4天時，CK組西蘭花中BoSGR基因表達量分別是SAEW處理組西蘭花的1.45、1.20、1.91 倍和1.89 倍?？梢?，SAEW處理可極顯著抑制西蘭花中BoSGR的表達。

BoPPH在西蘭花衰老過程中參與葉綠素降解。如圖8F所示，西蘭花在貯藏過程中BoPPH表達量呈下降-上升-下降的趨勢，在貯藏第1～3天時，SAEW處理組西蘭花中BoPPH表達量分別較CK組低35.5%、24.8%和39.7%（P＜0.05，P＜0.01）。可見，SAEW處理極顯著地抑制了西蘭花中BoPPH的表達。

BoPAO與西蘭花衰老密切相關(guān)。在整個貯藏期內(nèi)，兩組西蘭花中BoPAO的表達量呈先上升后下降的趨勢（圖8G），在貯藏第1～3天時，CK組西蘭花中BoPAO基因表達量分別是SAEW處理組的1.51、1.40 倍和1.41 倍。可見，SAEW處理極顯著地抑制了西蘭花中BoPAO的表達。

BoRCCR在葉綠素降解與植物綠色細胞死亡過程中起關(guān)鍵性的作用。西蘭花中BoRCCR表達量在貯藏過程中呈下降-上升-下降的趨勢，在貯藏第3天達到峰值（圖8H）。SAEW處理組西蘭花中BoRCCR表達量不僅峰值極顯著低于CK組，在貯藏第1、4天時也極顯著低于CK組?？梢?，SAEW處理組可極顯著地抑制西蘭花中BoRCCR的表達。

BoSAG12是西蘭花中具有代表性的衰老基因。西蘭花貯藏過程中BoSAG12的表達量急劇上升，而SAEW處理顯著抑制了其升高速率（圖8I）。在貯藏后期（第3、4天），SAEW處理組西蘭花中BoSAG12表達量較CK組分別低47.1%和59.0%（P＜0.01）。綜上，SAEW處理可以顯著抑制衰老基因BoSAG12的表達。

2.7 相關(guān)性分析

由圖9可看出，葉綠素含量與色差a*、h°值及葉綠素衍生物含量呈顯著正相關(guān)；與色差L*、b*值、葉綠素相關(guān)代謝酶Chlase、MDCase、PPH、PAO活力及葉綠素代謝相關(guān)基因BoNYC1、BoNOL、BoPAO、BoRCCR和衰老基因BoSAG12表達量呈負相關(guān)。綜上，SAEW處理可減緩葉綠素及其衍生物的降解，抑制葉綠素相關(guān)代謝酶活力，抑制葉綠素代謝相關(guān)基因及其衰老基因的表達，使采后西蘭花維持較好的色澤，推遲其黃化衰老進程，達到延長貨架期的目的。

圖9 采后西蘭花色澤與葉綠素代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.9 Correlation analysis between color and chlorophyll metabolism indexes of postharvest broccoli

3 討論

采后西蘭花在貯藏期間花蕾極易黃化，葉綠素降解是引起黃化的直接原因。因此，如何通過有效維持西蘭花中葉綠素含量來延緩黃化是其采后保鮮的關(guān)鍵。

綠色蔬菜的黃化程度是衡量其商品價值的重要標(biāo)志。由外觀品質(zhì)（圖1）、色差（圖2）和總?cè)~綠素含量（圖3）分析結(jié)果可知，隨著貯藏時間的延長，兩組采后西蘭花花蕾的亮度和褪綠程度升高，顏色飽和度降低，但與CK組相比，SAEW處理可顯著抑制顯著西蘭花花蕾L*、a*、b*值的上升及h°值的下降，并且有效延緩葉綠素降解，從而延緩其黃化衰老進程。近年來的研究也證實了抑制西蘭花葉綠素的降解可達到延緩黃化的效果。例如，Techavuthiporn等[28]的實驗結(jié)果表明缺氧處理可通過延緩葉綠素在貯藏期間的降解來維持西蘭花的色澤；刁春英等[29]研究發(fā)現(xiàn)真空減壓技術(shù)可有效延緩西蘭花中葉綠素的降解，從而達到護色保鮮的效果；且本課題組前期探索SAEW對采后西蘭花貯藏品質(zhì)的影響時發(fā)現(xiàn)，SAEW可有效抑制采后西蘭花組織中VC、可溶性糖、可滴定酸和可溶性蛋白含量的降低，并且有助于延緩其葉綠素的降解[10]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，說明SAEW處理可顯著延緩采后西蘭花中總?cè)~綠素的降解，從而有效延緩其黃化衰老進程。

葉綠素代謝包括葉綠素合成和葉綠素分解兩方面。葉綠素合成與植物葉色變化和光合特性密切相關(guān)，其合成途徑包括15 步酶促反應(yīng)，其中涉及的酶由27 個相關(guān)基因編碼[30]，葉綠素合成需要光的參與。在本研究中，處理后的西蘭花在黑暗條件下進行貯藏，因此在采后西蘭花的葉綠素代謝中以分解代謝為主?；赟AEW對采后西蘭花葉綠素降解的有效抑制作用，隨后的實驗進一步分析了SAEW對采后西蘭花葉綠素降解代謝的影響。葉綠素的降解代謝可分解為兩個階段，第一個階段在葉綠體中完成，首先是葉綠素被Chlase催化形成脫植基葉綠素，然后由一個金屬螯合物脫去鎂離子形成脫鎂葉綠酸a，脫鎂葉綠酸a經(jīng)過由PAO和紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶催化的兩步反應(yīng)轉(zhuǎn)化成初生熒光葉綠素代謝產(chǎn)物，初生熒光葉綠素代謝產(chǎn)物經(jīng)過幾次修飾之后運輸至液泡中。第二個階段是經(jīng)修飾的初生熒光葉綠素代謝產(chǎn)物被液泡中酸性的pH值環(huán)境所誘導(dǎo)而發(fā)生非酶學(xué)的異構(gòu)化，形成非熒光葉綠素代謝產(chǎn)物，最后轉(zhuǎn)化形成單吡咯降解產(chǎn)物[31]?？梢姡~綠素代謝的降解階段是由多種代謝酶共同作用的過程，在此過程中產(chǎn)生的衍生物前期為綠色，后期轉(zhuǎn)化為無色物質(zhì)，說明前期衍生物的含量影響著果蔬的褪綠程度，參與這一過程的主要代謝酶有Chlase、MDCase、PPH和PAO，其中PPH是葉綠素代謝的關(guān)鍵酶，PAO是褪綠過程中的關(guān)鍵酶[32]。該機制在大量的果蔬研究中已得到證明，例如，安容慧[33]采用富氫水結(jié)合真空預(yù)冷處理上海青、朱玲玲[34]通過褪黑素處理西蘭花，皆發(fā)現(xiàn)在葉綠素代謝過程中有效抑制了葉綠素代謝酶活性，延緩了葉綠素衍生物的降解。類似的研究也證實通過抑制葉綠素代謝酶活力可有效延緩葉綠素的降解[35]。同樣，在本研究中，SAEW處理有效抑制了采后西蘭花中Chlase、MDCase、PPH和PAO的活性，延緩了葉綠素衍生物脫植基葉綠素a、脫植基葉綠素b、脫鎂葉綠素a和脫鎂葉綠酸a含量的下降。

近年來，許多研究也分析了影響葉綠素降解的相關(guān)代謝途徑。比如，才佳卉[36]發(fā)現(xiàn)乙烯代謝對葉綠素降解相關(guān)酶活性及基因表達具有顯著影響；劉紅艷等[37]采用6-芐氨基嘌呤處理鮮切西蘭花，結(jié)果顯示6-芐氨基嘌呤有效抑制了采后西蘭花中葉綠素的降解；Hu Huali等[17]采用褪黑素處理青花菜，發(fā)現(xiàn)褪黑素不僅調(diào)控了青花菜的呼吸代謝，而且下調(diào)了葉綠素降解相關(guān)基因的表達，從而有效延緩了組織的黃化衰老進程。Aghdam等[38]研究發(fā)現(xiàn)，八肽NOP-1通過下調(diào)BoPAO和BoPPH基因的表達延緩了組織的黃化。這些研究表明，相關(guān)前體物質(zhì)和激素類物質(zhì)的代謝可影響組織中葉綠素的降解過程。在小白菜[22]中的研究也表明，二氫槲皮素處理顯著下調(diào)了葉綠素代謝酶及其相關(guān)基因和衰老基因的表達，延緩了組織的黃化衰老。本研究分析了西蘭花中葉綠素代謝相關(guān)基因BoNYC1、BoNOL、BoCLH1、BoCLH2、BoSGR、BoPPH、BoPAO、BoRCCR和衰老基因BoSAG12的表達情況，結(jié)果表明，除貯藏第2天的BoCLH2基因外，在整個貯藏期間，SAEW處理組各基因的表達水平均顯著低于CK組?？梢姡琒AEW處理組西蘭花中較高的葉綠素及其衍生物含量可能與其BoNYC1、BoNOL、BoCLH1、BoCLH2、BoSGR、BoPPH、BoPAO和BoRCCR和BoSAG12基因的表達下調(diào)有關(guān)。

綜上，采后西蘭花經(jīng)50 mg/L SAEW處理可以顯著延緩其黃化衰老進程。進一步研究顯示，SAEW處理能顯著抑制采后西蘭花中葉綠素代謝酶Chlase、MDCase、PPH和PAO活性及其相關(guān)基因的表達量，延緩采后西蘭花中葉綠素及其衍生物的降解，從而有效延緩黃化以達到延長貨架期的目的。