葉面噴施S-烯丙基-L-半胱氨酸對水稻砷轉運影響機制

郎耀臻，劉斌，王常榮，劉仲齊，孔維勇，劉月敏，黃永春*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2.天津城建大學環(huán)境與市政工程學院，天津 300384；3.廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南寧 530007）

As 是一種在自然界廣泛分布并對人和動、植物都具有較高毒性的非金屬元素[1]。土壤As 含量超標不僅與地質(zhì)因素有關，還受含As金屬礦藏開采、含As肥料和農(nóng)藥的施用以及工業(yè)生產(chǎn)等多種因素影響[2-3]。目前，As 污染影響涉及全球70 個國家的2 億人口[4]。我國土壤As 污染點位超標率達到2.7%，僅次于重金屬Cd、Ni。不同形態(tài)的As毒性差異較大，其中以無機As（iAs）毒性最高。早在2004 年，國際癌癥研究協(xié)會就把iAs 列為一類致癌物[5]。已有研究表明，食用稻米大約占我國人群iAs 平均攝入量的60%[6-7]。目前水稻已經(jīng)成為我國第一大糧食作物，全國有2/3人口以稻米為主糧[8]。水稻對As的富集能力遠超其他禾本科谷物，因此開發(fā)降低稻米As 污染生產(chǎn)措施并探討其潛在機制對保護人體健康具有重要意義。

在稻田淹水條件下土壤As 主要以亞砷酸（AsⅢ）形態(tài)存在[9]，通常占As 總量的70%~90%，其余部分為五價As（AsⅤ）以及少量的有機胂[6]。As是植物的非必需元素，在水稻體內(nèi)主要借助與其化學性質(zhì)相似的磷酸或硅酸通道完成轉運。AsⅤ的吸收主要由磷酸轉運蛋白OsPT8 介導[10]，進入細胞后AsⅤ可被還原成AsⅢ[11-13]繼續(xù)向頂端運輸。AsⅢ在化學性質(zhì)上更加接近于硅酸，因此在水稻體內(nèi)AsⅢ的吸收和轉運主要由硅轉運子完成[14]。水稻根系主要通過Lsi1 和Lsi2 兩種轉運子接力完成對AsⅢ的吸收和轉運。Lsi1 主要在水稻根系外皮層和內(nèi)皮層細胞膜的向外一側表達，它可以讓AsⅢ滲透通過[14-15]。此外，還有研究表明在AsⅤ脅迫下Lsi1 轉運子可向外部介質(zhì)中排出AsⅢ，表明它在一定條件下還具有雙向運輸功能[16]。進入根細胞的AsⅢ在Lsi2 轉運子的外排作用下繼續(xù)向中柱方向的質(zhì)外體運輸[17]。但是AsⅢ如何向根部木質(zhì)部導管裝載以及怎樣在地上部的節(jié)中從木質(zhì)部導管中卸載下來并向葉中分布目前尚未見確切報道。Huang等[18]的最新研究表明Lsi3 轉運子負責向根系木質(zhì)部裝載硅，Yamaji 等[19]的研究指出進入木質(zhì)部導管的硅被Lsi6轉運子卸載并被分配進葉鞘、葉片等營養(yǎng)器官中。這些研究為AsⅢ在水稻體內(nèi)的可能轉運通道提供了重要線索。到目前為止，已經(jīng)有多篇報道支持Lsi3 和Lsi6 轉運子在AsⅢ的轉運過程中發(fā)揮作用[20-21]。水稻OsABCC1 轉運子則與AsⅢ的解毒作用密切相關。該轉運子定位于細胞液泡膜上，可以將與植物螯合素（PCs）結合態(tài)AsⅢ區(qū)隔進液泡中儲存起來[22]。水稻PCs 合成酶（OsPCS）是一種誘導，酶同時也是PCs 的生物合成限速酶，在As 誘導下水稻主要產(chǎn)生OsPCS1 型合成酶[23]。OsABCC1 轉運子可以在水稻的根、葉、節(jié)、花序梗和穗軸等多種器官中表達[20]，該轉運子不僅可與PCs 合成酶OsPCS1 協(xié)同起到降低水稻組織As 脅迫作用，還可以通過將AsⅢ區(qū)隔進液泡限制AsⅢ向籽粒中轉運起到降低籽?？侫s含量的作用。

S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）是一種由半胱氨酸衍生的水溶性化合物，在成熟期大蒜中含量較豐富，是大蒜素的主要成分之一[24]。有報道表明SAC 具有多種生物活性，對重金屬中毒有一定的緩解作用，在醫(yī)療上具有較好應用前景[25]。已有研究表明，通過葉面噴施SAC 可有效緩解水稻Cd 脅迫[25]。但通過噴施SAC 降低水稻籽粒中As 含量，緩解水稻As 脅迫的研究尚未見報道。本文于水稻開花期葉面噴施SAC 主要探究其對水稻籽粒及其他營養(yǎng)器官中As含量的影響和對水稻As 脅迫的影響及降低水稻籽粒中As 含量的潛在機制，有望為降As 葉面調(diào)理劑的研發(fā)提供理論基礎和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以我國南方主栽水稻品種“中早35”為試驗材料，盆栽土壤取自廣西壯族自治區(qū)桂平市重金屬As 污染稻田（表層10~15 cm），過篩混勻后備用，土壤pH 為4.95、有機質(zhì)含量為24.54 g·kg-1、陽離子交換量為7.64 cmol·kg-1、總As含量為50 mg·kg-1。試驗中采用的SAC為分析純，購于中國醫(yī)藥集團有限公司。盆栽試驗在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所玻璃溫室中開展。

1.2 水稻盆栽試驗

將水稻種子浸泡在含有5%過氧化氫的水溶液中消毒30 min，撈出漂浮在水面的癟籽以及病籽，選取下沉的飽滿種子，用去離子水反復清洗4~5遍。將沖洗干凈種子均勻分散在育苗盤上，放置在生化培養(yǎng)箱中黑暗條件下28 ℃恒溫催芽36 h 后轉移到人工氣候室進行培養(yǎng)。待水稻幼苗長至兩葉一心時，選取長勢一致的水稻幼苗移至裝有1/10 Hoagland 營養(yǎng)液的8 L水培箱中進行培養(yǎng)。待水稻幼苗長至四葉一心期時，選取長勢一致的幼苗移栽至裝有4 kg 稻田As 污染土壤的土培盆中。每盆移栽水稻幼苗3 株。生長期間定期進行防病、防蟲處理并保持盆中水深3 cm左右。

1.3 盆栽試驗設計

盆栽試驗共設置4個SAC噴施試驗處理組和1個不噴SAC 的對照處理組（CK），每個處理設置5 盆重復。4 個噴 施處理 組分 別 噴施0.05、0.1、0.2、0.4 mmol·L-1的SAC，CK只噴施蒸餾水。在水稻開花灌漿初期，將不同濃度SAC溶液用手動噴霧器均勻噴至水稻植株表面。第一次噴施后，間隔24 h進行第二次噴施。每盆每次噴施40 mL。于第二次噴施SAC后間隔72 h收取水稻旗葉、頂端第一節(jié)（穗下節(jié)）鮮樣，同步采集水稻新鮮幼嫩根尖樣品。待水稻成熟后，收取水稻完整植株在70 ℃烘箱中烘干，備用。

1.4 測定方法

1.4.1 水稻植株總As含量測定

將烘干的成熟水稻分為籽粒、穗軸、第一節(jié)間（穗軸與頂端第一節(jié)之間部分，穗頸）、旗葉、頂端第一節(jié)和根，共計6 個部分。將水稻籽粒在礱谷機上脫殼后用萬能粉碎機粉碎，其余水稻營養(yǎng)器官樣品用剪刀剪碎后用萬能粉碎機粉碎。稱取粉碎后的樣品各0.5 g于消解管中，加入7 mL MOS（Metal oxide semiconduc?tor）級濃硝酸浸泡隔夜。在恒溫電熱消解爐上110 ℃高溫消解至澄清，冷卻后用蒸餾水轉移至容量瓶中并準確定容至25.0 mL，用原子熒光光度計（AFS-9760）測定樣品中As含量。

1.4.2 水稻植株AsⅢ轉運基因相對表達水平的測定

向收獲的水稻新鮮樣品（旗葉、頂端第一節(jié)、根）中加入液氮充分研磨，采用OMEGA 植物總RNA 試劑盒提取樣品總RNA，獲得的總RNA 樣品經(jīng)HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）R223 試劑盒預處理后，在經(jīng)BIO-RAD CFX96反轉錄獲得cDNA樣品。樣品在經(jīng)ChamQTM Universal SUBR?qPCR Master Mix Q711 試劑盒進行處理后進行實時定量聚合酶鏈式反應。采用Actin1做內(nèi)參基因，利用2???Ct法計算基因相對表達水平。實時熒光定量PCR 引物由中科合成（天津）生物科技有限公司設計合成（表1）。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers for real-time PCR

1.4.3 抗氧化酶活性測定

采用SOD 和CAT 試劑盒法測定旗葉中抗氧化酶活性[26]，試劑盒購自索萊寶（北京）公司。

1.4.4 旗葉H2O2含量測定及顯微觀察

剪取新鮮旗葉樣品浸泡在10 μmol·L-1的H2DCF?DA（2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯）溶液中，在黑暗處避光孵育2 h后取出，用無菌去離子水反復清洗去除染液。將染色后的旗葉固定在載玻片上，用倒置熒光顯微鏡在激發(fā)波長488 nm條件下觀察熒光強度。

1.5 數(shù)據(jù)處理及計算方法

轉移系數(shù)（TFa/b）=a器官As積累量/b器官As積累量。采用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)計算和繪制柱狀圖，采用SPSS 22 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（ANOVA）、Duncan多重比較以及差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 對水稻籽粒和營養(yǎng)器官As含量的影響

由圖1A 可見，葉面噴施SAC 可顯著降低水稻籽粒和穗軸中總As 含量。隨著SAC 噴施濃度增加，籽粒中總As 含量呈顯著降低趨勢，當噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，籽粒中的總As 含量達到最低值，與CK相比顯著降低42.3%。隨著SAC 噴施濃度增加到0.4 mmol·L-1時，籽粒中總As 含量反而出現(xiàn)顯著增加，表明SAC的最佳噴施濃度為0.2 mmol·L-1。

圖1 噴施SAC對水稻器官中As含量的影響Figure 1 Effects of foliar application SAC on As content in rice organs

水稻葉面噴施SAC 后，與CK 相比，穗軸中的總As 含量呈顯著下降趨勢（圖1B），但不同SAC 噴施處理間穗軸總As含量未出現(xiàn)顯著差異。當SAC 噴施濃度為0.2 mmol·L-1時，穗軸總As 含量與CK 相比顯著降低約15.7%。

由圖1C、圖1E 可見，水稻第一節(jié)間和頂端第一節(jié)的總As 含量變化趨勢與籽粒大致相同，隨著SAC噴施濃度的增加第一節(jié)間和頂端第一節(jié)中總As含量均出現(xiàn)顯著降低趨勢。與CK 相比，當SAC 噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，第一節(jié)間和頂端第一節(jié)中總As含量均降至最低值，其中第一節(jié)間總As含量與CK 相比顯著降低61.9%，頂端第一節(jié)總As 含量與CK 相比顯著降低31.0%。可見，開花期葉面噴施SAC 顯著降低了水稻第一節(jié)間和頂端第一節(jié)中的總As含量。

噴施SAC 后旗葉中總As 含量變化趨勢如圖1D所示。隨著SAC 噴施濃度增加，與CK 相比，旗葉中的總As 含量呈顯著上升趨勢。當噴施濃度為0.2 mmol·L-1時，旗葉中的總As 含量達到最高值，與CK相比顯著增加了72.4%。

水稻根部總As含量遠高于其他營養(yǎng)器官和籽粒中總As 含量（圖1F）。噴施SAC 后水稻根部總As 含量隨著噴施濃度的增加呈現(xiàn)顯著降低趨勢。當SAC噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，根部總As 含量降到最低值，與CK相比顯著降低20.6%。

2.2 對水稻不同營養(yǎng)器官間As轉移系數(shù)的影響

轉移系數(shù)（TF）可以直觀地體現(xiàn)出As從一個營養(yǎng)器官向另一個營養(yǎng)器官的遷移能力。由圖2 可見，噴施SAC 后As由穗軸向籽粒的轉移系數(shù)（TF籽粒/穗軸）、由頂端第一節(jié)向第一節(jié)間的轉移系數(shù)（TF第一節(jié)間/第一節(jié)）都呈現(xiàn)出顯著降低趨勢。隨著噴施濃度的增加，當SAC噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，TF 達到最低值。與對照處理相比，TF籽粒/穗軸顯著降低52.1%，TF第一節(jié)間/第一節(jié)顯著降低45.0%。然而，經(jīng)不同濃度SAC處理后As由頂端第一節(jié)向旗葉的轉移系數(shù)（TF旗葉/第一節(jié)）呈現(xiàn)出逐漸增加趨勢。當噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，TF旗葉/第一節(jié)達到最大值，與對照處理相比，顯著增加了148.7%。綜上可見，開花期在葉面噴施SAC顯著降低了As由穗軸向籽粒和由頂端第一節(jié)向第一節(jié)間中的遷移，顯著增加了As由頂端第一節(jié)向旗葉中的遷移。

圖2 噴施SAC對不同器官間As的轉移系數(shù)的影響Figure 2 Effects of foliar application SAC on the As transfer factors between rice organs

2.3 對頂端第一節(jié)、旗葉、根中AsⅢ相關轉運基因表達水平的影響

試驗過程中測定了噴施SAC 對水稻頂端第一節(jié)中AsⅢ相關轉運子編碼基因Lsi3、Lsi6 以及旗葉中與解除As 脅迫有關的OsABCC1、OsPCS1 基因相對表達水平的影響，結果如圖3 所示。隨著SAC 噴施濃度的增加頂端第一節(jié)中Lsi3 和Lsi6 基因相對表達水平與CK 相比呈現(xiàn)出顯著下調(diào)趨勢（圖3A）。當噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，頂端第一節(jié)中Lsi3 和Lsi6 基因相對表達水平下調(diào)至最低值，與CK 相比分別下調(diào)36.3%和59.8%。

圖3 噴施SAC對水稻基因相對表達水平的影響Figure 3 Effects of foliar application SAC on relative expression levels of genes in rice

隨著SAC 噴施濃度的增加，旗葉中OsPCS1 和OsABCC1 基因相對表達水平出現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢（圖3B）。當SAC 噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，旗葉中OsPCS1和OsABCC1的基因相對表達水平上調(diào)至最高值，與CK相比分別上調(diào)57.6%和61.0%。

試驗過程中測定了噴施0.2 mmol·L-1SAC 對水稻根尖中三個AsⅢ吸收、轉運基因表達水平的影響。由圖3C 可見，葉面噴施0.2 mmol·L-1SAC 處理顯著下調(diào)了根中OsLsi1、OsLsi2、OsLsi3 基因相對表達水平，與CK 相比三個基因的表達水平分別下調(diào)27.2%、23.8%和29.5%。

2.4 對水稻旗葉As脅迫的影響

由圖4 可見，隨著SAC 噴施濃度的增加，水稻旗葉中超氧化物歧化酶（SOD）與過氧化氫酶（CAT）活性（以鮮質(zhì)量計）與CK相比均出現(xiàn)顯著增強趨勢。當SAC 噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，旗葉中SOD 和CAT 活性最強，與CK 相比分別顯著升高61.8%和105.3%。

圖4 噴施SAC對水稻旗葉SOD、CAT酶活性的影響Figure 4 Effects of foliar application SAC on SOD and CAT activities of rice flag leaves

葉片組織中H2O2經(jīng)染色后在488 nm 激發(fā)波長下發(fā)出綠色熒光，其強度與H2O2含量呈正相關。由圖5可見，不噴施SAC 的CK 旗葉中的綠色熒光強度最強，表明葉片中H2O2含量最高，受As 脅迫程度最嚴重。隨著SAC噴施濃度的增加，旗葉葉片熒光強度逐漸減弱，表明細胞中H2O2含量出現(xiàn)逐漸降低趨勢。當噴施濃度為0.2 mmol·L-1時，旗葉葉片熒光強度最弱，表明此時旗葉葉片受As脅迫程度最輕。

圖5 噴施SAC對水稻旗葉As脅迫的影響Figure 5 Effects of foliar application SAC on As stress in rice flag leaves

3 討論

全球大約有50%人口以稻米為主糧[27]，這一數(shù)字在我國進一步擴大到2/3[8]。稻米中As 主要以iAs 和二甲基胂酸（DMA）形態(tài)存在[6]，因此膳食稻米是我國人群攝入iAs 的主要途徑，占到總平均攝入量的60%[7]。葉面噴施技術是一種成本較低且易于大面積推廣應用的降低稻米中重金屬含量的農(nóng)藝措施，目前開發(fā)出了硅肥[28]、鋅肥[29]、小分子酸類[30]等多種類型重金屬葉面阻控劑。SAC是蒜素的主要成分之一，有研究表明水培試驗噴施SAC 可以顯著降低鎘對水稻幼苗的脅迫作用，在田間噴施可降低籽粒中Cd 含量[25]。但是噴施SAC 是否會降低水稻籽粒中總As含量及其潛在降低機制尚無報道。

禾本科植物的節(jié)具有復雜、有序的維管束結構，在礦質(zhì)元素的轉運、分配中起到關鍵作用[31-32]。水稻頂端第一節(jié)連接著旗葉和稻穗，從下層節(jié)間運輸上來的礦質(zhì)元素在頂端第一節(jié)中通過木質(zhì)部維管束間的轉運分配給旗葉和稻穗。水稻灌漿期，在頂端第一節(jié)中高效表達的Lsi6 轉運子從通向旗葉的木質(zhì)部膨大維管束流中高效卸載硅，在Lsi3轉運子接力作用下把硅裝載進連通稻穗的木質(zhì)部彌散維管束中并繼續(xù)向稻穗中轉運[33]。有報道表明，當敲除Lsi6 轉運子后水稻旗葉中的硅含量將顯著增加，同時稻殼中硅含量顯著降低[34]，說明敲除Lsi6 轉運子后顯著降低了頂端第一節(jié)中硅從旗葉向稻穗中的分配，導致旗葉中硅含量增加而稻殼中含量降低。本研究中，噴施0.2 mmol·L-1的SAC后頂端第一節(jié)中Lsi3、Lsi6轉運子編碼基因表達水平與對照處理相比分別顯著下調(diào)了36.3%和59.8%，水稻籽粒中總As 含量顯著降低42.3%，旗葉中總As含量顯著增加72.4%。據(jù)這一結果推測，噴施SAC 下調(diào)Lsi3、Lsi6 轉運子編碼基因表達水平可能同時降低了AsⅢ從通向旗葉的膨大維管束卸載能力以及向連接稻穗的彌散維管束裝載能力，導致水稻籽粒中總As 含量出現(xiàn)顯著降低而旗葉中總As 含量出現(xiàn)顯著增加。同時由圖3A 和圖1A 中可見，當SAC 噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，Lsi3、Lsi6 基因下調(diào)幅度最大，當進一步升高SAC噴施濃度時兩基因下調(diào)幅度反而出現(xiàn)顯著減小趨勢。與之對應籽粒中總As含量也在噴施0.2 mmol·L-1SAC 時達到最低值，說明0.2 mmol·L-1為最佳噴施濃度。

水稻吸收及向中柱運輸硅和AsⅢ主要通過Lsi1、Lsi2 轉運子。Lsi1 轉運子屬于NIP 亞支水通道蛋白，可以允許硅酸和AsⅢ滲透通過，抑制Lsi1 的表達將導致AsⅢ吸收的減少[14]。一般認為Lsi1是一種單向被動吸收轉運子，但也有研究表明當水稻根在AsⅤ脅迫下Lsi1 可以向外部介質(zhì)中排出AsⅢ，由此證實Lsi1 是一種雙向AsⅢ轉運子[16]。Lsi2 是一種內(nèi)排性硅和AsⅢ轉運子[17]。Lsi1 和Lsi2 都定位于水稻根系的內(nèi)皮層和外皮層，但是Lsi1 位于遠端 而Lsi2 位 于 近端[15，17]。Lsi2 通過消耗ATP 主動將AsⅢ向中柱方向運輸，一方面在內(nèi)皮層和外皮層中維持一種低AsⅢ濃度，另一方面形成的濃度差可驅動AsⅢ向內(nèi)流過Lsi1 轉運子。Lsi3 也是一個內(nèi)排轉運子，主要負責向木質(zhì)部裝載硅，該轉運子主要在根部中柱鞘表達且沒有極性，敲除Lsi3 導致水稻在低硅條件下吸收量減少[18]。在本研究中，當SAC 噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，Lsi1、Lsi2、Lsi3 轉運子編碼基因表達水平與CK 相比分別顯著下調(diào)27.2%、23.8%和29.5%。這一結果表明，水稻根部對AsⅢ的吸收、向中柱方向的運輸能力出現(xiàn)顯著降低。同時Lsi3 基因顯著下調(diào)可能預示著AsⅢ向根部木質(zhì)部導管的裝載能力也出現(xiàn)顯著降低。在此情況下，水稻根部總As 含量與對照處理相比顯著降低20.6%。

在重金屬脅迫作用下，植物會啟動自身抗氧化系統(tǒng)大量合成抗氧化酶消除體內(nèi)超氧自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧等造成植物氧化損傷的物質(zhì)[35]。在本研究中，噴施SAC 后水稻旗葉中SOD 與CAT 活性與CK相比均出現(xiàn)顯著增加趨勢。當SAC 噴施濃度達到0.2 mmol·L-1時，旗葉中SOD和CAT與CK相比分別顯著升高61.8%和105.3%，表明噴施SAC 增強了水稻自身抗氧化損傷能力，有助于解除As 脅迫。熒光顯微觀察也表明隨著SAC 噴施濃度增加葉片中過氧化氫熒光強度顯著減弱，表明過氧化氫含量顯著減少。此外，將As 區(qū)隔進液泡中也是一種重要的植物解毒機制，該過程依賴PCs。在水稻細胞中，PCs巰基與As螯合形成的復合物被位于液泡膜上的OsABCC1 轉運子區(qū)隔進液泡中儲存起來，該過程是植物解毒的終極步驟[22]。PCs是一種由谷胱甘肽聚合而成富含巰基的多肽，由PCs 介導的重金屬脫毒是植物和少數(shù)產(chǎn)生PCs生物體所特有的解毒機制。水稻中存在兩種PCs合成酶即OsPCS1 和OsPCS2，其中OsPCS1 對As 具有較高的響應活性，而OsPCS2 則對鎘等重金屬的響應活性更高[24]。在本研究中，噴施0.2 mmol·L-1SAC 后，水稻旗葉中編碼OsPCS1 和OsABCC1 的基因表達水平分別顯著上調(diào)57.6%和61.0%，表明葉片中PCs 的合成量顯著增加，同時向液泡中轉運的PCs 結合態(tài)AsⅢ含量也顯著增加。上述這些結果表明，噴施SAC可通過增加抗氧化酶活性和向液泡中儲存AsⅢ達到降低As脅迫作用。

4 結論

（1）開花期噴施S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）可以顯著降低水稻籽粒中總As 含量，當噴施濃度為0.2 mmol·L-1時效果最佳。

（2）開花期葉面噴施SAC 可以顯著緩解水稻As脅迫。

（3）開花期噴施SAC 顯著下調(diào)了AsⅢ吸收和轉運關鍵基因的表達水平，但是增加了向液泡中區(qū)隔As的基因表達水平，最終導致籽粒中總As含量顯著降低。