土茯苓復(fù)方治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用機(jī)制研究

劉淑艷 王偉榮 葉凌赟 高金星

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔惡性腫瘤中最常見的類型，患者5 年總生存率不足60%[1-2]。近年來，中藥在抗腫瘤治療中的重要性逐漸被發(fā)現(xiàn)。土茯苓復(fù)方由土茯苓、銀花、甘草、連翹、大黃和馬齒莧等中藥組成，其中的土茯苓苷、茯苓醇等不僅可以抑制癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)散，還可提高機(jī)體的抗癌能力[3-6]；銀花提取物具有增強(qiáng)免疫功能的作用[7-8]；甘草提取物具有抗氧化和抗腫瘤的特性[9-10]；連翹、大黃和馬齒莧等提取物也展現(xiàn)出抗氧化、抗炎的功效，并對(duì)多種癌細(xì)胞具有抑制增殖和擴(kuò)散的能力[11-18]?？梢娡淋蜍邚?fù)方中的各種成分均具有一定的抗腫瘤活性，但是其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)土茯苓復(fù)方的有效成分和靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)探究土茯苓復(fù)方的OSCC 治療靶點(diǎn)及其相互作用關(guān)系，對(duì)潛在疾病治療靶點(diǎn)的生物學(xué)過程和途徑進(jìn)行富集分析，并對(duì)疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，以揭示土茯苓復(fù)方治療OSCC 的作用機(jī)制，為尋找OSCC 新的治療靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 土茯苓復(fù)方潛在活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測 登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以“dahuang”“gancao”“l(fā)ianqiao”“machixian”“tufulin”“yinhua”為關(guān)鍵詞，以化合物的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，篩選土茯苓復(fù)方主要活性成分及關(guān)聯(lián)這些活性成分的相應(yīng)靶點(diǎn)。通過通用蛋白質(zhì)資源（universal protein resource，UniProt）數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）搜索靶點(diǎn)的UniProt ID，并將物種定義為“Homo sapiens”，以便后續(xù)獲得治療靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)。

1.2 OSCC 相關(guān)靶點(diǎn)篩選 從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中下載OSCC 的mRNA 表達(dá)譜和患者臨床資料。表達(dá)譜數(shù)據(jù)的單位由每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped，F(xiàn)PKM）轉(zhuǎn)化為每百萬轉(zhuǎn)錄本（transcripts per million，TPM）[19]。利用limma R 包篩選OSCC 組織與正常組織之間的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）[20]。DEGs 的篩選條件定義為P＜0.05。在Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）數(shù)據(jù)庫（https://omim.org）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）中搜索關(guān)鍵詞“口腔鱗狀細(xì)胞癌”，獲取疾病靶點(diǎn)。將DEGs 和數(shù)據(jù)中獲得的疾病靶點(diǎn)取交集，篩選得到OSCC 相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 潛在治療靶點(diǎn)與主要活性成分的獲取 將1.1中潛在活性成分相應(yīng)靶點(diǎn)與1.2 中OSCC 相關(guān)靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，獲得土茯苓復(fù)方抗OSCC 的潛在治療靶點(diǎn)。隨后獲得這些靶向潛在治療靶點(diǎn)的活性成分，即土茯苓復(fù)方抗OSCC 的主要活性成分。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將土茯苓復(fù)方抗OSCC的潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，參數(shù)設(shè)置為最高置信度0.700，去除無連接的靶蛋白，進(jìn)行PPI 分析。將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化處理，獲得“OSCC 靶點(diǎn)-藥物活性成分”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。通過拓?fù)鋵W(xué)分析，即使用Cytoscape 軟件中的CytoNCA 工具模塊，計(jì)算PPI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的參數(shù)，包括度數(shù)、接近中心性、介數(shù)中心性、特征向量、局部平均連接系數(shù)和網(wǎng)絡(luò)[21]。并以這6 個(gè)參數(shù)的中位數(shù)為閾值，治療靶點(diǎn)的6 個(gè)參數(shù)均大于其相應(yīng)中位值的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。上述拓?fù)鋵W(xué)分析進(jìn)行兩次，獲得的靶點(diǎn)確定為土茯苓復(fù)方抗OSCC 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。按照度值大小進(jìn)行排序，前3 個(gè)靶點(diǎn)被視為最關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1.5 土茯苓復(fù)方抗OSCC 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的功能與通路的基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組百科全書（K yo to encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 利用Cluster Profiler R 包對(duì)土茯苓復(fù)方抗OSCC 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG通路富集分析。利用Metascape（https://metascape.org）在線數(shù)據(jù)庫對(duì)上述拓?fù)鋵W(xué)首次分析的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，P＜0.05 為數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 TCGA-OSCC 低表達(dá)組患者和高表達(dá)組患者的生存分析 根據(jù)3 個(gè)最關(guān)鍵作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因的中位表達(dá)值將TCGA-OSCC 患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，繪制Kaplan-Meier 曲線，比較兩組的OS 和無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）。log-rank 檢驗(yàn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HR＜1 說明該基因是保護(hù)因素，HR＞1 說明該基因是危險(xiǎn)因素。

1.7 分子對(duì)接 采用Autodock Vina（http://autodock.scripps.edu/）進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接流程：（1）從Pub-Chem 化合物數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)鍵的藥物活性化合物的結(jié)構(gòu)文件（mol2 格式），利用ChemOffice 軟件2019（Chem-Draw Professional 2019）將其轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)，利用AutoDockTools 1.5.6 軟件將三維結(jié)構(gòu)氫化計(jì)算并保存為PDBQT 文件。（2）從RCSB PDB 蛋白庫（https://www.pdb.org/）中獲取治療疾病的最關(guān)鍵作用靶點(diǎn)晶體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PyMOL 1.7.2.1（https://pymol.org/2/）中，脫水、氫化，用于配體分離。 隨后在AutoDockTools 1.5.6 中對(duì)每個(gè)目標(biāo)蛋白的活性位點(diǎn)構(gòu)建對(duì)接口袋，以PDBQT 格式保存。（3）使用AutoDock Vina 4.2 對(duì)假定的最關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和藥物活性化合物進(jìn)行分子對(duì)接，并評(píng)估自由結(jié)合能。對(duì)接分?jǐn)?shù)的絕對(duì)值反映了組分與目標(biāo)的親和度和構(gòu)象的穩(wěn)定性。絕對(duì)值＞4.25 表示有一定的結(jié)合活性，＞5.00表示結(jié)合活性較好，＞7.00 表示結(jié)合活性較強(qiáng)。（4）利用PyMOL 和Discovery Studio 2022 可視化軟件分析活性化合物的相互作用和結(jié)合模式。

2 結(jié)果

2.1 土茯苓復(fù)方和OSCC 交集靶點(diǎn)的獲取 TCMSP數(shù)據(jù)庫中共獲得6 種中藥中179 個(gè)化合物，其中大黃、甘草、連翹、馬齒莧、土茯苓和銀花分別包含16、92、23、10、15 和23 個(gè)化合物。核心預(yù)測靶標(biāo)634 個(gè)，其中大黃70 個(gè)，甘草237 個(gè)，連翹229 個(gè)，馬齒莧224個(gè)，土茯苓214 個(gè)，銀花220 個(gè)。在OMIM 和GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到與OSCC 密切相關(guān)的疾病靶點(diǎn)6 842個(gè)。TCGA 中共篩選到OSCC 相關(guān)的差異基因18 119個(gè)，取交集后最終得到3 079 個(gè)OSCC 相關(guān)靶點(diǎn)，見圖1A。對(duì)土茯苓復(fù)方的靶標(biāo)和OSCC 相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得潛在治療靶點(diǎn)141 個(gè)，見圖1B。與15 個(gè)以上靶點(diǎn)連接的成分有8 個(gè)，分別為槲皮素（81 個(gè)）、山奈酚（33 個(gè)）、木犀草素（33 個(gè)）、漢黃芩素（24 個(gè)）、花生四烯酸（22 個(gè)）、7 甲氧基-2 甲基異黃酮（19 個(gè)）、異鼠李素（16 個(gè)）和柚皮素（16 個(gè)）。這些成分可能在OSCC的發(fā)病機(jī)制和治療中發(fā)揮重要作用。靶向藥物種類＞50 的靶點(diǎn)有11 個(gè)，說明土茯苓復(fù)方治療OSCC 的機(jī)制比較復(fù)雜。

圖1 土茯苓復(fù)方和OSCC交集靶點(diǎn)的獲?。ˋ：數(shù)據(jù)庫OSCC相關(guān)基因與差異表達(dá)基因的Venn圖；B：藥物與疾病靶點(diǎn)的Venn圖）

2.2 潛在治療靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)獲取 將141 個(gè)潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖2。利用Cytoscape 3.9.1 軟件繪制土茯苓復(fù)方抗OSCC 的“OSCC 靶點(diǎn)-藥物活性成分”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖3（插頁）。CytoNCA 計(jì)算兩次后得到13個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，分別為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）14、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、窩蛋白-1（caveolin 1，CAV1）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1α）、IL-1B、MAPK8、NF-κB 抑制劑α（NF-κB inhibitor-alpha，NFκBIA）、MAPK3、絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、V-Rel 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（RELA proto-oncogene，RELA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3，CASP3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 “OSCC 靶點(diǎn)-藥物活性成分”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

對(duì)141 個(gè)潛在治療靶點(diǎn)的GO 分析結(jié)果顯示，這些基因共參與了2 016 個(gè)生物學(xué)過程、44 個(gè)細(xì)胞成分組成、175 個(gè)分子功能。其中生物學(xué)過程包括對(duì)脂多糖、細(xì)菌源分子、外來刺激、營養(yǎng)水平、類固醇激素和金屬離子的反應(yīng)；涉及的細(xì)胞成分包括膜筏、膜微域、囊泡腔、分泌顆粒腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔；參與的分子功能包括DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶特異性DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性、抗氧化活性和類固醇激素受體活性，見圖4A）。KEGG 結(jié)果顯示，這些基因主要參與了162 個(gè)信號(hào)通路，包括糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體信號(hào)通路、化學(xué)致癌-受體激活、TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、凋亡、NF-κB 信號(hào)通路和HIF-1α 信號(hào)通路等，見圖4B）。

圖4 GO 分析和KEGG 通路富集分析（A：GO 分析結(jié)果；B：KEGG 通路富集分析結(jié)果）

2.3 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)與OSCC 患者預(yù)后的關(guān)系分析單因素Cox 回歸結(jié)果顯示，13 個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)中與OS 有關(guān)的共9 個(gè)，分別為AKT1、CASP3、CAV1、EGF、EGFR、MAPK8、MAPK14、RELA 和VEGFA，這些基因的高表達(dá)與較低的OS 顯著相關(guān)，見圖5。13個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)中與PFS 有關(guān)的有7 個(gè)，分別為AKT1、CASP3、CAV1、EGF、HIF-1α、MAPK8 和VEGFA。除HIF-1α 外，其余基因高表達(dá)與較短的PFS 顯著相關(guān)，見圖6。提示上述預(yù)后相關(guān)基因是疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素，靶向這些基因可能有助于疾病的治療。

圖5 基因表達(dá)量與患者總生存期的關(guān)系（A：AKT1；B：CASP3；C：CAV1；D：EGF；E：EGFR；F：MAPK8；G：MAPK14；H：RELA；I：VEGFA）

圖6 基因表達(dá)量與患者無進(jìn)展生存狀態(tài)的關(guān)系（A：AKT1；B：CASP3；C：CAV1；D：EGF；E：HIF-1α；F：MAPK8；G：VEGFA）

2.4 最關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和有效成分的分子對(duì)接驗(yàn)證 按照度值大小進(jìn)行排序，被視為最關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的前3 個(gè)靶點(diǎn)依次為MAPK3、AKT1 和CASP3。作用于MAPK3 的有效成分為柚皮素；作用于AKT1 的有效成分有柚皮素、漢黃芩素、薯蕷皂苷元、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素和槲皮素；作用于CASP3 的有效成分有柚皮素、漢黃芩素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、槲皮素和蘆薈大黃素。分子對(duì)接結(jié)果顯示，柚皮素與MAPK3 的對(duì)接分?jǐn)?shù)為-7.3，β-胡蘿卜素與CASP3 的對(duì)接分?jǐn)?shù)為-8.0，山奈酚與CASP3 的對(duì)接分?jǐn)?shù)為-8.1，顯示出較強(qiáng)的結(jié)合活性，見圖7（插頁）。

圖7 最關(guān)鍵作用靶點(diǎn)與有效成分的分子對(duì)接圖（A：柚皮素與MAPK3 的分子對(duì)接圖；B：β-胡蘿卜素與CASP3 的分子對(duì)接圖；C：山奈酚與CASP3 的分子對(duì)接圖）

3 討論

最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)提示，全球每年約有35 萬例新的OSCC 確診病例和17 萬死亡病例[1]。尋找有效的治療藥物對(duì)于OSCC 患者至關(guān)重要。中藥土茯苓復(fù)方成分復(fù)雜，可通過多靶點(diǎn)、多途徑、多層次整合調(diào)控產(chǎn)生協(xié)同功效，對(duì)腫瘤治療有效。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土茯苓復(fù)方的有效成分中，與15 個(gè)以上靶點(diǎn)連接的成分有8 個(gè)，分別是槲皮素、山奈酚、木犀草素、漢黃芩素、花生四烯酸、7 甲氧基-2 甲基異黃酮、異鼠李素和柚皮素。其中柚皮素作用于MAPK3；柚皮素、漢黃芩素、薯蕷皂苷元、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素和槲皮素作用于AKT1；柚皮素、漢黃芩素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、槲皮素和蘆薈大黃素作用于CASP3?？梢奜SCC 中的MAPK3、AKT1 和CASP3 等3 個(gè)最關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，分別被土茯苓復(fù)方中不同的有效成分靶向作用。

土茯苓復(fù)方包含土茯苓、銀花、生甘草、連翹、大黃、馬齒莧等6 種中藥，其中土茯苓的主要活性成分槲皮素，具有調(diào)節(jié)表皮生長因子/熱激蛋白27 通路的作用，通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的血管生成擬態(tài)進(jìn)而減輕乳腺癌的惡性程度[22]；此外，柚皮素和β-谷甾醇能夠癌細(xì)胞停滯G0/G1期，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來抑制癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)散[23-24]。銀花中的山奈酚具有抗氧化和抗腫瘤活性，能夠通過干擾癌細(xì)胞的生物學(xué)行為來抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[25]。甘草中的甘草酸具有抗炎和抗腫瘤作用，可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和抑制腫瘤細(xì)胞增殖來抑制腫瘤的發(fā)展[26]。馬錢子堿是來自連翹的一種有效的抗腫瘤化合物，能夠通過干擾細(xì)胞凋亡途徑和抑制腫瘤細(xì)胞的生長來抑制腫瘤的發(fā)展[27-29]。大黃中的大黃素具有抗炎和抗腫瘤活性，能夠通過抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑來抑制腫瘤的生長和擴(kuò)散[30-32]。馬齒莧素是馬齒莧的一種有效的抗腫瘤成分，能夠通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移來抑制腫瘤的發(fā)展[33]。這些中藥成分的多靶點(diǎn)調(diào)控作用可能是中藥治療OSCC 的有效機(jī)制之一。它們通過作用于多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，影響腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移、凋亡等多個(gè)生物學(xué)過程，從而抑制OSCC 的發(fā)展。這種多靶點(diǎn)調(diào)控的特性有助于提高治療的有效性，并減少患者對(duì)單一藥物的耐藥性。

本研究還存在一定的局限性。土茯苓復(fù)方的有效活性成分在體內(nèi)發(fā)揮抗OSCC 中的有效性和潛在機(jī)制還尚不明確，生物活性成分治療OSCC 的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的體外和體內(nèi)研究，此外中藥有效成分的濃度、劑量、劑型、作用時(shí)間等一系列問題還尚未被探究。

綜上所述，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法，系統(tǒng)探索了土茯苓復(fù)方治療OSCC 的藥理學(xué)和分子作用機(jī)制，可為臨床應(yīng)用提供參考。