超聲波—發(fā)酵輔助提取玉竹黃酮的研究

李志清 王殿奎 張李莉 蔣曉蕊 孫 琛 孫金旭

（1 衡水市綜合檢驗檢測中心 河北 衡水 053000；2 衡水市質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化研究院 河北 衡水 053000； 3 衡水學(xué)院 河北 衡水 053000）

玉竹為多年生草本植物，百合科黃精屬，2002 年3 月被國家衛(wèi)生部列為藥食同源植物，其入藥部位為根莖，經(jīng)研究其活性成分為黃酮、多糖、糖蛋白、皂甙等，目前已經(jīng)報道的玉竹活性成分的功效有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等[1～2]。

超聲波輔助提取具有省事、省力、高效、環(huán)保的特點，在現(xiàn)代提取技術(shù)中應(yīng)用廣泛[3]；發(fā)酵提取法利用的是菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物和酶系對植物細(xì)胞壁破壞效果明顯的特點[4]。本文研究超聲波—發(fā)酵輔助提取玉竹活性物質(zhì)黃酮優(yōu)化提取工藝，為玉竹黃酮工業(yè)化提取提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料。玉竹(購自北京同仁堂衡水分店)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng))，菌種(衡水學(xué)院生命科學(xué)系菌種室保藏)。

1.2 儀器設(shè)備。破壁機(jī)(深圳市凈品環(huán)?？萍加邢薰?，電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，分光光度計(722G 可見分光光度計，廣州廣一科學(xué)儀器有限公司)，超聲波提取儀(MHY-25045，北京美華儀科技有限公司)。

1.3 黃酮提取方法

1.3.1 普通提取法。玉竹破壁機(jī)粉碎后，過60 目篩，按照1∶5 的料液比例進(jìn)行配比，混勻后，逐漸加熱升溫至80 ℃，保溫提取2 h。

1.3.2 超聲提取法。玉竹破壁機(jī)粉碎后，過60 目篩，按照1∶5 的料液比例進(jìn)行配比，混勻后，進(jìn)行超聲提取，提取功率200 W，時間15 min。

1.3.3 發(fā)酵提取法。玉竹破壁機(jī)粉碎后，過60 目篩，按照1∶5 的料液比例進(jìn)行配比，混勻后，按1%添加葡萄糖，煮沸滅菌20min，接種按工藝接種目標(biāo)菌發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.4 超聲—發(fā)酵輔助提取法。玉竹破壁機(jī)粉碎后，過60 目篩，按照1∶5 的料液比例進(jìn)行配比，混勻后，按1%添加葡萄糖，進(jìn)行超聲提取，提取功率200 W，時間15 min，煮沸滅菌20 min，接種按工藝接種目標(biāo)菌發(fā)酵培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波—發(fā)酵輔助提取玉竹黃酮發(fā)酵菌種的選擇。經(jīng)粉碎處理后的玉竹，按照1∶15 的料液比例配成渾濁液，超聲提取20 min 后，分裝于4 個1 L 的三角瓶中，每個瓶中裝液量600 ml，滅菌20 min 后，冷卻至室溫，分別無菌接種枯草芽孢桿菌、酵母菌、保加利亞乳桿菌、木醋桿菌，活化后菌液接種量占料液體積的1%，分別發(fā)酵培養(yǎng)36 h，發(fā)酵結(jié)束后過濾取液體，測定黃酮提取量，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，雖然相對于普通提取和超聲提取，各菌株發(fā)酵后對玉竹黃酮的提取都有不同程度的提高，但相對來說枯草芽孢桿菌發(fā)酵下，玉竹黃酮提取量最高，因此選擇枯草芽孢桿菌作為超聲—發(fā)酵輔助提取玉竹黃

圖1 超聲波— 發(fā)酵輔助提取菌種選擇

酮的發(fā)酵菌株。

2.2 接種量對超聲—發(fā)酵輔助提取玉竹黃酮的影響。經(jīng)超聲處理后的玉竹，分別分裝于8 個1 L 的三角瓶中，裝液量600 ml，滅菌冷卻至室溫，按照不同接種量無菌接種經(jīng)活化好的枯草芽孢桿菌，發(fā)酵36 h 后，測定玉竹黃酮提取量。由圖2 可知，枯草芽孢桿菌接種量對玉竹黃酮提取量有一定的影響，低比例接種量條件下，玉竹黃酮提取量較低，隨著接種量的增大，玉竹黃酮提取量隨之增加，枯草芽孢桿菌接種量為2.5%時，玉竹黃酮提取量最高，之后隨著接種量的增加，玉竹黃酮提取量呈現(xiàn)降低的趨勢，因此，確定接種量為2.5%較為適宜。

圖2 接種量對超聲— 發(fā)酵輔助提取的影響

2.3 發(fā)酵溫度對超聲—發(fā)酵輔助玉竹黃酮提取量的影響。經(jīng)超聲處理后的玉竹，分裝于6 個1 L 的大三角瓶中，裝液量600 ml，滅菌后冷卻至室溫，按照2.5%的比例無菌接種，分別在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)36 h，之后過濾出液體，測定玉竹黃酮提取量。由圖3 可知，不同發(fā)酵溫度下，枯草芽孢桿菌對玉竹黃酮提取量不同，低溫不利于玉竹黃酮的提取，隨發(fā)酵溫度的提高，玉竹黃酮提取量增加，當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時，玉竹黃酮提取量最高，之后隨溫度升高，玉竹黃酮提取量降低，分析原因可能是28 ℃為該培養(yǎng)條件下枯草芽孢桿菌的適宜發(fā)酵生長溫度，菌體大量快速地繁殖后，代謝產(chǎn)物增多，產(chǎn)生的酶等物質(zhì)豐富，有利于破壁，因此確定28 ℃為發(fā)酵提取溫度。

圖3 發(fā)酵溫度對玉竹黃酮提取量的影響

2.4 發(fā)酵時間對超聲—發(fā)酵輔助玉竹黃酮提取量的影響。經(jīng)超聲處理好的玉竹黃酮，裝于3 L 的三角瓶中，裝液量1.8 L，滅菌后，冷卻至28 ℃，按2.5%的接種量無菌接種枯草芽孢桿菌，發(fā)酵培養(yǎng)，每8 h 取樣測定玉竹黃酮提取量。由圖4 可知，玉竹黃酮提取量隨發(fā)酵時間的增加而增大，這也與枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)繁殖有關(guān)，培養(yǎng)到48 h，玉竹黃酮提取量最高，之后降低，表明48 h 菌體生長繁殖達(dá)到最旺盛期，代謝產(chǎn)物及酶系最為豐富，破壁效果最好。

圖4 發(fā)酵時間對玉竹 黃酮的影響

2.5 幾種玉竹黃酮提取方法對比分析。根據(jù)玉竹黃酮提取量，對比分析普通提取、超聲提取、發(fā)酵提取、超聲—發(fā)酵輔助提取玉竹黃酮方法，發(fā)現(xiàn)超聲—發(fā)酵輔助提取＞發(fā)酵提?。境曁崛。酒胀ㄌ崛?，優(yōu)化后測得超聲—發(fā)酵輔助提取玉竹黃酮提取量達(dá)到47.29 mg/g，相對于普通熱水浸提(13.21 mg/g)提高2.58 倍，相對于發(fā)酵提取(34.28 mg/g)提高37.95%，相對于超聲提取(22.35 mg/g)提高1.12 倍，表明超聲—發(fā)酵輔助提取玉竹黃酮是非常行之有效的方法。

圖5 不同提取方式對比分析

3 結(jié)論與討論

利用超聲波—發(fā)酵輔助提取玉竹黃酮，對菌種、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的超聲波—發(fā)酵輔助提取玉竹黃酮的工藝條件為：玉竹渾濁液先進(jìn)行超聲處理再進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵菌種為枯草芽孢桿菌，發(fā)酵溫度28 ℃，接種量2.5%，發(fā)酵時間48 h，此條件下，玉竹黃酮提取量達(dá)到47.29 mg/g，相對于普通熱水浸提(13.21 mg/g)提高2.58 倍，相對于發(fā)酵提取(34.28 mg/g)提高37.95%，相對于超聲提取(22.35 mg/g)提高1.12 倍，表明超聲—發(fā)酵輔助提取玉竹黃酮是非常行之有效的方法。