酸性蛋白復(fù)合酶提取大棗多糖方法研究

鄭靜美，閆婧怡，王軍華，王 蓓，孫博研

（河北瑞龍生物科技有限公司，河北 石家莊 050000）

0 引 言

棗為薔薇目鼠李科棗屬植物，在中國(guó)已有長(zhǎng)達(dá)8000 多年的種植歷史，被列為“五果”之一，棗中富含多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、胡蘿卜素、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，現(xiàn)已廣泛種植。近年來我國(guó)對(duì)多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用研究很快，研究范圍廣，涉及理化性質(zhì)、應(yīng)用等。大棗多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有重要的生理保健功能和生物活性，可有效的清除體內(nèi)的自由基，具有抗衰老、抗癌癥、抗病毒等多種生理活性。

對(duì)于大棗多糖的提取研究較多,包括傳統(tǒng)的水提法、溶劑萃取法等，均存在一些問題，水提法由于溫度較高會(huì)導(dǎo)致大棗多糖活性變差，且需要多次反復(fù)操作，需要較長(zhǎng)的操作周期，溶劑萃取法雖應(yīng)用廣泛，但每次提取均需新鮮溶劑用于提供較大的溶解能力，每次循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，不適于高沸點(diǎn)溶劑，且存在溶劑回收難、有殘留等問題。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來也出現(xiàn)了一些新的提取方法和設(shè)備，包括：超臨界CO2萃取、分子篩分離法，膜分離集成技術(shù)等，但存在設(shè)備成本高等缺點(diǎn)。目前，有研究采用酶法提取大棗多糖。酶制劑的品種繁多，且功效不一，由于酶制劑具有專一性、催化效率高，不發(fā)生副反應(yīng)，且不需要高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等條件，反應(yīng)溫和，且反應(yīng)產(chǎn)物無毒。針對(duì)大棗多糖細(xì)胞壁厚、細(xì)胞粗大，且含有一定量的蛋白質(zhì)的情況，需有針對(duì)性的選取合適的酶制劑，加速大棗多糖從細(xì)胞中的擴(kuò)散速率，縮短大棗多糖的提取時(shí)間。石奇等人研究了中性蛋白酶提取大棗多糖，楊輝等人研究了果膠酶提取大棗多糖的工藝。本研究選用復(fù)合酶做為提取大棗多糖的酶制劑，相較于單一的酶制劑減低了成本，并能發(fā)揮復(fù)合酶的協(xié)同作用。通過對(duì)酶制劑的篩選，確定了酸性蛋白復(fù)合酶做為大棗多糖提取的酶制劑，并通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化了酸性蛋白復(fù)合酶液提取大棗多糖的工藝，為大棗多糖的加工及應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

大棗購于石家莊農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，將大棗篩選后去核、干燥后粉碎，得到干燥棗粉。果膠復(fù)合酶液、纖維素復(fù)合酶液、酸性蛋白酶液均購自廣西南寧東恒華道生物科技有限公司，其中果膠復(fù)合酶液中含有少量半纖維素酶及淀粉酶，纖維素復(fù)合酶液中含有少量半纖維素酶及果膠酶，酸性蛋白酶液中含有少量果膠酶及淀粉酶。

1.2 試 劑

試驗(yàn)中所用試劑見表1。

表1 試驗(yàn)中所用試劑Table 1 Reagents used in the experiment

1.3 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)中所用儀器設(shè)備見表2。

表2 試驗(yàn)中所用儀器Table 2 Instruments used in the test

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 復(fù)合酶制劑篩選

稱量干燥棗粉4 份100 克，分別加入1000g水，分別添加底物濃度為1%的果膠酶復(fù)合酶液、1%的酸性蛋白復(fù)合酶液、1%的纖維素復(fù)合酶液，調(diào)節(jié)溶液pH，將添加果膠酶復(fù)合酶液及纖維素復(fù)合酶液的溶液pH 調(diào)節(jié)至7，將添加酸性蛋白復(fù)合酶液的溶液pH 調(diào)節(jié)至4.2，于40 ℃下提取120 min。離心后取上清液，濃縮，加入無水乙醇進(jìn)行醇沉，離心后去上清液，將沉淀層多糖進(jìn)行干燥，干燥后復(fù)溶，采用三氯乙酸脫蛋白，向脫蛋白后的溶液中加入雙氧水進(jìn)行脫色反應(yīng)。脫色后濃縮，醇沉后離心去上清，將沉淀層多糖干燥后得到多糖。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次取平均值，篩選出適宜的復(fù)合酶制劑。

1.4.2 加酶濃度對(duì)大棗多糖提取含量和得率的影響

稱量干燥棗粉5 份各100 克，分別加入1000g水，分別添加底物濃度為0.2%、0.5%、1.0%、1.2%、1.5%的酸性蛋白復(fù)合酶液，調(diào)節(jié)溶液pH 值至4.2，于40 攝氏度下提取120min。后續(xù)步驟與1.4.1 相同。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次取平均值，篩選出適宜的酸性蛋白復(fù)合酶添加濃度。

1.4.3 提取時(shí)間對(duì)大棗多糖提取含量及得率的影響

稱量干燥棗粉6 份各100 克，分別加入1000g 水，添加底物濃度為1.0%的酸性蛋白復(fù)合酶液。調(diào)節(jié)溶液pH 值至4.2，溶液溫度40℃，提取時(shí)間分別設(shè)置40min、 60min、 100min、120min、140min、160min。后續(xù)步驟與1.4.1 相同。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次取平均值，篩選出適宜的提取時(shí)間。

1.4.4 提取溫度對(duì)大棗多糖含量和得率的的影響

稱量干燥棗粉5 份各100 克，分別入1000g水，添加底物濃度為1.0%的酸性蛋白復(fù)合酶液。調(diào)節(jié)溶液pH 值為4.2，溶液溫度分別設(shè)置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，提取時(shí)間120min。后續(xù)步驟與1.4.1 相同。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次取平均值，篩選出適宜的提取溫度。

1.4.5 溶液pH 值對(duì)大棗多糖提取含量和得率的影響

稱量干燥棗粉5 份各100 克，分別入1000g水，酸性蛋白復(fù)合酶液添加量為濃度1%。溶液pH 值分別調(diào)節(jié)至2.2、3.2、4.2、5.2、7.0，溶液溫度50℃，提取時(shí)間120min。后續(xù)步驟與1.4.1相同。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次取平均值，篩選出適宜的反應(yīng)pH 值。

1.4.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素篩選出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用正交分析法設(shè)計(jì)酸性蛋白復(fù)合酶提取大棗多糖的實(shí)驗(yàn)方法，選取pH 值、酶添加量、溫度、提取時(shí)間作為影響大棗多糖提取優(yōu)化因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交表，優(yōu)化工藝參數(shù)，評(píng)估各單因素對(duì)發(fā)酵物中李子多酚含量影響的主次作用，確認(rèn)最佳工藝條件。

自變量選用pH 值、酶添加量、溫度、提取時(shí)間，分別用A、B、C 和D 表示，用1、2、3 分別代表3 個(gè)水平，正交試驗(yàn)因素水平表見表3。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factor level table of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶制劑對(duì)大棗多糖得率、含量影響

不同復(fù)合酶制劑處理后大棗多糖的得率和含量如圖1 所示。以去離子水組為參照，采用果膠復(fù)合酶液處理后大棗多糖含量均較去離子水組有所下降，經(jīng)纖維素復(fù)合酶、酸性蛋白復(fù)合酶液處理后大棗多糖含量均較去離子水組有所增加；采用纖維素復(fù)合酶液處理后大棗多糖提取率較去離子水組有所下降，果膠復(fù)合酶液、酸性蛋白復(fù)合酶液處理后大棗多糖提取率有所增加；以大棗多糖的得率和含量為條件進(jìn)行綜合判定，得出酸性蛋白復(fù)合酶液參與提取大棗多糖效果較好。因此，選取酸性蛋白復(fù)合酶液用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同酶制劑對(duì)大棗多糖得率、含量影響Fig.1 Effect of different enzyme preparations on the yield and content of jujube polysaccharides

2.2 酸性蛋白復(fù)合酶提取大棗多糖單因素試驗(yàn)研究

2.2.1 酸性蛋白復(fù)合酶液的添加量對(duì)大棗多糖提取含量和得率的影響

酸性蛋白復(fù)合酶液的添加量對(duì)大棗多糖提取含量和得率的影響如圖2 所示，分析不同酸性蛋白復(fù)合酶液添加量下大棗多糖得率，可得當(dāng)其添加量在0.2%～0.5%之間，大棗多糖得率有明顯增加，但隨著酸性蛋白復(fù)合酶液添加量的增加，大棗多糖得率急劇下降，達(dá)到1.5%時(shí)，得率幾乎為零，因此，為了得到較多的大棗多糖，酸性蛋白復(fù)合酶液的在添加量為1.0%～1.2%時(shí)較為適宜。同時(shí)大棗多糖的含量隨著酶添加量的增加有所增加，但當(dāng)添加量超過1.2%以后，大棗多糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論，再結(jié)合成本，可以得出，酶制劑的添加量在1.0%～1.2%之間獲得的大棗多糖無論是含量還是得率均最佳且成本最低。

圖2 酶制劑添加量對(duì)多糖含量和多糖得率的影響實(shí)驗(yàn)圖Fig.2 Experimental diagram of the effect of enzyme addition on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)大棗多糖提取含量及得率的影響

提取時(shí)間對(duì)大棗多糖提取含量和得率的影響如圖3 所示。隨著提取時(shí)間的增加，大棗多糖得率呈上升的趨勢(shì)，且在60 min 時(shí)大棗多糖得率增長(zhǎng)速率最大。當(dāng)提取時(shí)間超過120 min，大棗多糖得率隨著時(shí)間變化不明顯。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，大棗多糖含量也呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)提取時(shí)間超過140 min 后，大棗多糖的含量下降很快。綜合大棗多糖得率和含量的試驗(yàn)結(jié)果，得出提取時(shí)間在120 min左右時(shí)最為合適。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖含量和多糖得率的影響實(shí)驗(yàn)圖Fig.3 Experimental graph of the effect of extraction time on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.2.3 提取溫度對(duì)大棗多糖含量和得率的的影響

提取溫度對(duì)大棗多糖提取含量和得率的影響如圖4 所示。隨著提取溫度的升高，大棗多糖得率和含量都呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，且在50 ℃時(shí)，大棗多糖得率和含量的增長(zhǎng)速率均最大，50 ℃以后，不論是大棗多糖的含量還是得率都呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，因此，50 ℃為酸性蛋白復(fù)合酶制劑最適宜的反應(yīng)溫度。

圖4 提取溫度對(duì)多糖含量和多糖得率的影響實(shí)驗(yàn)圖Fig.4 Experimental graph of the effect of extraction temperature on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.2.4 溶液pH 值對(duì)大棗多糖提取含量和得率的影響

溶液pH 對(duì)大棗多糖提取含量和得率的影響如圖5 所示，當(dāng)溶液pH 在2.2-3.2 之間時(shí)，大棗多糖得率和含量都呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)溶液pH 值超過3.2 后，大棗多糖得率和含量都呈下降的趨勢(shì)，因此，當(dāng)溶液pH 為3.2 時(shí)為酸性蛋白復(fù)合酶液最佳反應(yīng)pH。

圖5 溶液pH對(duì)多糖含量和多糖得率的影響實(shí)驗(yàn)圖Fig.5 Experimental graph of the effect of solution pH on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.3 酸性蛋白復(fù)合酶提取大棗最佳提取條件正交試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出的試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析Table 4 Orthogonal experimental design and data analysis

通過表4 的正交試驗(yàn)結(jié)果，綜合大棗多糖含量及多糖得率綜合評(píng)估，可以得出酸性蛋白復(fù)合酶液提取大棗多糖最佳工藝條件是：酸性蛋白復(fù)合酶液的添加量為1.0%，反應(yīng)溫度40℃，溶液pH 值為3.2，提取時(shí)間為120min，在此條件下，大棗多糖的含量為41.93%，得率為4.9%。

3 結(jié) 語

本研究以大棗做為試驗(yàn)原料，充分利用生物酶技術(shù)，通過添加復(fù)合酶制劑有效分解大棗組織，加速大棗多糖釋放，提高提取率，保證大棗多糖提取率及得率的最大化地的同時(shí)不破壞大棗多糖的生物活性；充分總結(jié)傳統(tǒng)大棗多糖的提取利用單一酶源成本高、提取率低、不適宜大規(guī)模工藝生產(chǎn)的弊端，通過比較果膠酶復(fù)合酶液、酸性蛋白復(fù)合酶液及纖維素復(fù)合酶液，篩選出適宜大棗多糖提取的酸性蛋白復(fù)合酶液做為大棗多糖提取的酶制劑，利用單因素試驗(yàn)，通過優(yōu)化酸性蛋白復(fù)合酶液的添加量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及溶液pH 提高酸性蛋白復(fù)合酶液提取大棗多糖的含量，進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)結(jié)果,得到了酸性蛋白復(fù)合酶液提取大棗多糖的最佳工藝條件：在40℃的條件下，調(diào)節(jié)溶液pH 至3.2，酸性蛋白的添加量為1%，在此條件下提取2 h 后，大棗多糖的含量可達(dá)41.93%，得率可達(dá)4.9%。