鹿血生物活性肽體外抗菌研究

◎ 付 慧，李紅瑩，高倩倩

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132000)

1 前言

生物活性肽是一類對動(dòng)植物機(jī)體的生理活動(dòng)有益的肽類化合物，被廣泛應(yīng)用在食品及藥品等領(lǐng)域，其他領(lǐng)域還有待開發(fā)[1]。一直以來，在人的認(rèn)知當(dāng)中，鹿血都具有非常神奇的功效，它不僅可以益壽延年、活筋健骨、緩解疲勞，而且能夠提高機(jī)體免疫力，抵抗疾病入侵。微量元素、維生素是人體不可或缺的成分，而鹿血當(dāng)中恰恰蘊(yùn)含著豐富的對人體有益處的微量元素，如氨基酸、多肽、血紅蛋白等[2]。其中，血紅蛋白是大分子化合物，人體無法對其直接吸收利用，小分子的多肽則可以。鹿血制備的生物活性肽對人體有益的優(yōu)點(diǎn)有很多，比如可以降膽固醇和血壓、調(diào)節(jié)免疫力和腸道菌群，保護(hù)心腦血管，還具有抗氧化作用[3-4]。隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，現(xiàn)如今，利用酶解技術(shù)可以將鹿血水解成小分子的生物活性肽，其具有抗炎抗菌、抗癌降壓、治療骨質(zhì)疏松等功效[5]。

本試驗(yàn)通過藥敏紙片法和MIC 法，測定鹿血生物活性肽抗菌效果，結(jié)果表明，生物活性肽對抑制菌群生長具有非常顯著的效果。因此，為充分挖掘生物活性肽的抑菌活性，對其進(jìn)行深入性研究勢在必行。目前，我國研究生物活性肽的動(dòng)物血液種類有很多，最為常見的是羊血和驢血。但是對鹿血中的生物活性肽的研究則少之又少，其體系也差強(qiáng)人意[6]。希望通過本次試驗(yàn)，能夠突破對鹿血生物活性肽的研究，促進(jìn)鹿血生物活性肽的進(jìn)一步發(fā)展，以創(chuàng)造更多的市場。

2 材料和方法

2.1 試驗(yàn)材料

鹿血生物活性肽純化液：前期研究成果；大腸桿菌與金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌：實(shí)驗(yàn)室冰箱保存；牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1 mo1/L Na0H 溶液、1 mo1/L HC1 溶液、胰蛋白胨、乳糖、K2HPO4、KH2PO4、三號(hào)膽鹽；硫酸紙、燒杯、乳糖膽管、三角瓶、吸量管、培養(yǎng)皿、玻璃棒、報(bào)紙、棉線、酒精燈、煮鍋、接種針、涂布棒、游標(biāo)卡尺、麥?zhǔn)媳葷峁堋?6 孔板。以上菌種、藥品及小件物品，均由食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

2.2 主要儀器

ZY-75MA 型高壓蒸汽滅菌鍋:浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；JC-100A 型生化培養(yǎng)箱：青島誠瑞信德環(huán)境科技有限公司；JA2003 型分析天平：上海析牛萊伯儀器有限公司；10-100 μL 移液槍:南京烔創(chuàng)科技有限公司；C21-QH2133 型電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司；PB-10 型酸度計(jì)：金博仕生物技術(shù)有限公司；GB/T17623 全自動(dòng)多功能振蕩儀：得利特科技有限公司。

3 試驗(yàn)方法

3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備

3.1.1 操作流程

藥品稱量→溶解→加瓊脂融化→調(diào)pH 值→分裝→包扎標(biāo)記→滅菌→擺斜面或倒平板→無菌檢查

3.1.2 操作步驟

①藥品稱量：稱取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂30 g，放到硫酸紙上備用。②溶解：用量簡取1 L 蒸餾水倒入煮鍋中，在電磁爐上小火加熱，添加藥品順序?yàn)榕Ｈ飧?、蛋白胨和氯化鈉，并用玻璃棒攪拌均勻，以防液體溢出或燒焦，直至藥品完全溶解。③融化瓊脂:瓊脂在95 ℃融化，40 ℃凝固，所以向溶液中加瓊脂要一邊攪拌一邊分多次加入，直至瓊脂完全溶化變粘稠并且無顆粒，停止加熱，補(bǔ)足蒸發(fā)的水分（水需預(yù)熱）。④調(diào)節(jié)pH:根據(jù)培養(yǎng)基對pH 的要求，用1 mo1/L Na0H和1 mo1/L HC1溶液調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。用酸度計(jì)測定溶液pH 值。⑤分裝：根據(jù)需要分裝入試管或三角瓶。分裝量要均勻一致，試管一般為高度的1/5-1/4，三角瓶一般為其體積的1/3-1/2 為宜。⑥包扎、記號(hào):分裝后的試管配好棉塞，7 支試管為一組，包上報(bào)紙，用棉繩系好，并標(biāo)明培養(yǎng)基名稱及日期。⑦滅菌：將所有需要滅菌的物品放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌(121 ℃，20 min)。⑧擺斜面、倒平板：擺斜面時(shí)注意斜面的長度不要超過試管總長的1/2-2/3，趁熱倒平板，倒入培養(yǎng)基的量約為15 mL 左右，蓋上上蓋后輕輕晃動(dòng)，使培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿底部分布均勻，凝固之后成為平板，并貼好標(biāo)簽，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。此步需在無菌條件下操作。⑨無菌檢查:將平板倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置為37 ℃，培養(yǎng)24 h，檢查滅菌是否徹底，無雜菌生成，冷卻保藏備用。

3.2 菌種活化

3.2.1 操作流程

滅菌操作→分離培養(yǎng)→LB 培養(yǎng)基配制→滅菌→擴(kuò)大培養(yǎng)→保存

3.2.2 操作步驟

①操作前準(zhǔn)備。將接種針、酒精燈、打火機(jī)、無菌平板、酒精棉球、鑷子、潔凈燒杯、平板和斜面培養(yǎng)基、菌種等，置于超凈工作臺(tái)，打開紫外燈，滅菌20 min。點(diǎn)燃酒精燈,用鑷子取酒精棉球擦拭雙手和臺(tái)面。②斜面接種、平板劃線分離。菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對齊，斜持呈45°角，將灼燒滅菌的接種針插入菌種管內(nèi)，先與無菌落生長培養(yǎng)基接觸，冷卻后，從斜面刮取少量細(xì)菌苔，迅速插入接種管。在試管中從下向上做S 形劃線。接種后，立即塞上棉塞，再次灼燒接種環(huán)并將其恢復(fù)到原來的位置。按種管貼好標(biāo)簽后放入試管架，即可進(jìn)行培養(yǎng)。在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種針，挑取菌苔在平板上Z 字形劃線，其目的是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋分離，獲得足夠的單個(gè)菌落。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，封口膜封口。37 ℃倒置培養(yǎng)。③LB培養(yǎng)基的配制。成分：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)pH 至7.2，分裝至50 mL 錐形瓶中，制備150 mL 液體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min。④擴(kuò)大培養(yǎng)。用接種針挑平板內(nèi)單個(gè)菌落（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌），移至LB 培養(yǎng)液中，在振蕩器內(nèi)220 rmp/min 振蕩12 h,使細(xì)菌分散在培養(yǎng)液中。培養(yǎng)后的菌液放置于4 ℃冰箱保存,不超過一周，為接下來實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

3.3 抑菌圈直徑的測定

本試驗(yàn)供樣菌分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草亞芽孢桿菌，并且通過藥敏紙片法來推斷出鹿血生物活性肽的抗菌效果[7]。用打孔器在定性濾紙上面打出6 mm圓片若干個(gè)，用于浸蘸不同濃度的生物活性肽溶液。取鹿血生物活性肽純化溶液33 mL 和五支20 mL 比色管，將33 mL 鹿血生物活性肽純化溶液配成不同濃度梯度（0.0、0.05、0.25、0.35、0.45、0.55 mg/mL）的六個(gè)樣品溶液。方法如下：在第一支比色管中加入鹿血生物活性肽純化溶液1 mL；在第二支比色管中加入活性肽純化液5 mL；在第三支比色管中加入活性肽純化液7 mL；在第四支比色管中加入活性肽純化液9 mL；在第五支比色管中加入活性肽純化液11 mL。再向這五支比色管中分別加入蒸餾水進(jìn)行稀釋，稀釋至比色管20 mL 刻度線處。第六支比色管中不加樣品，加入無菌水至20 mL 刻度線處即可，作為空白對照組。

用無菌涂布棒輕輕蘸取三種菌液少量多次均勻涂抹在固體培養(yǎng)基表面，再用無菌鑷子輕輕夾取6 mm濾紙片浸入不同濃度稀釋液試管中，使濾紙片完全浸在試管內(nèi)至少10 s，濾紙片應(yīng)全部浸有溶液以便保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。每個(gè)菌液培養(yǎng)基中放入不同濃度的三片濾紙片，且均勻分布在培養(yǎng)基內(nèi)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，重復(fù)試驗(yàn)3 次后，將平板倒置在生化培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。接著，觀察抑菌結(jié)果，并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小。

3.4 最低抑菌濃度的測定

3.4.1 EC 肉湯的制備

成分組成：胰蛋白胨20 g/L、乳糖5 g/L、氯化鈉5 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、磷酸氫二鉀4 g/L、三號(hào)膽鹽1.5 g/L。

3.4.2 分光光度法測定菌液OD 值

本試驗(yàn)選用上述實(shí)驗(yàn)室活化好的大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于滅菌后的試管內(nèi)，加入生理鹽水進(jìn)行稀釋，稀釋至與0.5 麥?zhǔn)媳葷峁軠啙岢潭认嗤?，其作為后面所需的菌懸液。配置好的菌懸液置于振蕩器振蕩?nèi)，220 rmp/min 振蕩12 h。然后，將這三種菌懸液分別倒入三支分光光度計(jì)比色管內(nèi)，波長固定在515 nm 處，分別測量出三種菌懸液的OD 值。

3.4.3 最小抑菌濃度測定步驟

方法采用微量肉湯二倍稀釋法[8]，測定鹿血生物活性肽對三種細(xì)菌的最小抑菌濃度。在超凈臺(tái)內(nèi)操作，所用儀器均已完全消毒，取96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板留34 孔作為接下來的試驗(yàn)，該產(chǎn)品是以伽瑪射線滅菌處理后的，無需再次滅菌。大腸桿菌（A）、金黃色葡萄球菌（B）、枯草芽孢桿菌（C）各11 孔，共A、B、C 三排。在細(xì)菌培養(yǎng)板第一排（A）1 到11 孔內(nèi)用量程最大為100 μL 的移液槍分別加入100 μL EC 肉湯，再向第1 孔中加100 μL 生物活性肽原溶液，濃度為512 μg/mL,用槍頭混勻，然后從1孔內(nèi)吸取100 μL至第2 孔混勻，混勻后吸取100 μL 至第3 孔，以此連續(xù)倍比稀釋至第11 孔，從第11 孔混勻后吸取100 μL棄去，此時(shí)，每孔溶液濃度依次為：256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。然后在1 到11 孔依次添加濃度為1×108 CFU/mL 的菌懸液，剩下兩排均重復(fù)上述操作。另取一孔只加100 μL EC 肉湯和100 μL濃度為1×108 CFU/mL 菌懸液作為空白對照。以上操作結(jié)束后，將96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板用保鮮膜蓋住防止液體蒸干，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察細(xì)菌生長情況。

4 結(jié)果與討論

本次實(shí)驗(yàn)測定了不同濃度的鹿血生物活性肽溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌的抑菌效果，結(jié)果如表1、表2 所示。

表1 生物活性肽純化液對3 種細(xì)菌的抑菌效果表

由表1 可知，當(dāng)鹿血生物活性肽濃度低于0.25 mg/mL 時(shí)，對3 種細(xì)菌的生長均無抑制效果；當(dāng)鹿血生物活性肽濃度在0.35～0.55 mg/mL 時(shí)，對3 種細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制效果。通過觀察發(fā)現(xiàn)，在鹿血生物肽濃度為0.55 mg/mL 時(shí)，各菌種的抑菌圈最大。通過游標(biāo)卡尺測定，實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌的最大抑菌圈直徑為20 mm，金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑為18.30 mm，枯草芽孢桿菌的最大抑菌圈直徑為19.50 mm。即實(shí)驗(yàn)所用鹿血活性肽在0.55 mg/mL 濃度下抑菌效果最佳，對大腸桿菌的生長抑制作用最強(qiáng)。

3 種菌懸液的OD 值分別為0.65、0.08、0.11。鹿血生物活性肽對3 種菌的最小濃度測定結(jié)果如下：大腸桿菌所測得的最小濃度為0.52 mg/mL，金黃色葡萄球菌的最小濃度為0.97 mg/mL，枯草芽孢桿菌最小濃度為1.36 mg/mL。

5 結(jié)語

在一定濃度范圍內(nèi)，鹿血生物活性肽抑菌效果隨其濃度含量的增大而增強(qiáng)。最小抑菌濃度為0.52 mg/mL，抑菌強(qiáng)度順序依次為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。當(dāng)鹿血生物活性肽濃度為0.55 mg/mL 時(shí)，培養(yǎng)基中大腸桿菌的抑菌圈最大，其直徑為20.00 mm，即本實(shí)驗(yàn)中所用的鹿血生物活性肽溶液在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌3 種細(xì)菌中，對大腸桿菌的生長抑制效果最強(qiáng)。