MAPK8、AR、RARA和FGF13是骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變過程中的潛在生物標(biāo)志物

楊明義 蘇亞妮 許珂 彭侃 劉林 魯超 侯衛(wèi)坤 井文森 馮磊 許鵬

(1西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)外科,陜西 西安 710054;2延安大學(xué))

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的與年齡相關(guān)的致殘疾病,會引起疼痛、腫脹、僵硬和活動受限,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,其病理通常包括關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊和關(guān)節(jié)周圍肌肉的結(jié)構(gòu)改變〔1〕。OA患者會經(jīng)歷關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退變、軟骨骨贅形成、軟骨下骨重塑(硬化)、滑膜炎和關(guān)節(jié)囊內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤〔2～5〕。軟骨退行性變是OA的主要問題,導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙。隨著年齡的增大,軟骨磨損日益加重并進(jìn)行性退化,引起并促進(jìn)了OA的進(jìn)展。對于OA的治療,目前并沒有有效的藥物〔6,7〕,這主要是因為對OA起始階段驅(qū)動病理過程的機(jī)制了解有限〔8〕。目前OA的發(fā)病機(jī)制尚不明確,軟骨退化作為OA的始發(fā)因素,在OA的發(fā)病機(jī)制及病變進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。

微陣列在基因表達(dá)分析中發(fā)揮著重要作用,是醫(yī)學(xué)研究的重要工具,具有重要的臨床應(yīng)用價值〔9〕。近年來,利用微陣列技術(shù)和生物信息學(xué)分析進(jìn)行了大量的基因表達(dá)譜的研究,為研究疾病的分子機(jī)制提供了一定的依據(jù)。本研究通過微陣列基因表達(dá)譜和生物信息學(xué)分析來識別OA軟骨退變過程中的生物標(biāo)志物和相關(guān)通路。從生物學(xué)功能和通路的結(jié)果來看,這些參與OA軟骨退變的潛在生物標(biāo)志物和通路在OA軟骨進(jìn)行性退變的過程中發(fā)揮著重要的作用,對OA的發(fā)病機(jī)制和治療研究具有一定的生物學(xué)指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1微陣列數(shù)據(jù) 從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載GSE16464和GSE10575基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。GSE16464數(shù)據(jù)集中包含有3例OA軟骨組織樣本和3例正常軟骨組織樣本,其平臺文件為GPL570。GSE10575數(shù)據(jù)集中包含有6例OA軟骨組織樣本和2例正常軟骨組織樣本,其平臺文件為GPL570。

1.2鑒定差異表達(dá)基因(DEGs) GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)是一個交互式的網(wǎng)絡(luò)工具,它允許用戶比較GEO系列中的兩組或兩組以上的樣本,以便識別在不同實驗條件下表達(dá)的不同基因。GEO2R篩選OA軟骨組織樣本和正常軟骨組織樣本之間的DEGs,篩選標(biāo)準(zhǔn):P<0.05、|log差異倍數(shù)(FC)|≥1。

1.3DEGs的基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 用于標(biāo)注、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(DAVID,http://david.ncifcrf.gov,version6.8)是一個整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具的生物信息數(shù)據(jù)庫〔10〕。Cytoscape(version3.8.0)是一個專注于開源網(wǎng)絡(luò)可視化和分析的軟件,其插件ClueGO支持多個數(shù)據(jù)集注釋,可以多集合富集結(jié)果比較。基因集富集分析(GSEA)根據(jù)對基因的定位、功能和生物學(xué)意義構(gòu)建一個分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫,數(shù)據(jù)庫中包含了多個功能基因集,通過分析基因表達(dá)數(shù)據(jù),得到表達(dá)狀況是否在某種功能上顯著富集。GO是一個主要的生物信息學(xué)工具,用于注釋基因和分析這些基因的生物學(xué)過程〔11〕。KEGG是一個整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫。分別用DAVID和Cytoscape對DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析,GSEA對兩個芯片中的全部基因信息做富集分析。DAVID選取標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。Cytoscape選取標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。GSEA選取標(biāo)準(zhǔn)為錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.25,P≤0.05。

1.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建 檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)的搜索工具(STRING,http://string-db.org,version11.0)數(shù)據(jù)庫可以對互作基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測,為了解疾病產(chǎn)生或發(fā)展的機(jī)制提供更加深入的科學(xué)依據(jù)。利用STRING構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò),綜合評分>0.4的交互作用被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5Hub基因的選擇和分析 Cytoscape的插件Cytohubba(Degree算法)篩選在PPI中網(wǎng)絡(luò)連接度最高的前10個基因為Hub基因,并對其進(jìn)行可視化。對10個Hub基因利用Cytoscape的BINGO插件進(jìn)行GO富集分析,FDR<0.000 1被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6Hub基因-miRNAs相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵miRNAs的預(yù)測 TargetScan、miRDB和miRWalk三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測Hub基因的靶向miRNAs,預(yù)測結(jié)果取交集。Cytoscape構(gòu)建Hub基因-miRNAs的相互作用網(wǎng)絡(luò),針對兩個以上Hub基因的miRNAs被認(rèn)為是關(guān)鍵miRNAs〔12〕。

2 結(jié) 果

2.1DEGs的鑒定 GEO2R在線分析后,GSE16464鑒定出1 091個上調(diào)DEGs和1 539個下調(diào)DEGs,GSE10575鑒定出604個上調(diào)DEGs和849個下調(diào)DEGs。對兩個數(shù)據(jù)集的上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs分別取交集,GSE16464和GSE10575以P<0.05,logFC≥1為選取標(biāo)準(zhǔn),得到53個上調(diào)DEGs;GSE16464和GSE10575以P<0.05,logFC≤-1為選取標(biāo)準(zhǔn),得到119個下調(diào)DEGs,最終得到172個DEGs。

2.2DEGs的GO和KEGG富集分析 DAVID對DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析,生物途徑(BP)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和凝血顯著富集;細(xì)胞定位(CC)在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞外泌體和胞外區(qū)顯著富集;分子功能(MF)在蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚體活性、鈣黏著蛋白結(jié)合參與細(xì)胞與細(xì)胞的黏附和核小體DNA結(jié)合顯著富集(表1)。KEGG顯著富集于癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、酗酒、cAMP信號通路和細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用(表2)。Cytoscape對DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析,GO主要富集于類固醇激素的生物合成過程、吞噬作用、器官生長、核苷二磷酸生物合成過程、蛋白質(zhì)解聚的負(fù)調(diào)控、上皮細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、白細(xì)胞介素7介導(dǎo)的信號通路和免疫受體活性(圖1A);KEGG主要富集于膽固醇代謝、FcεRI信號通路、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、酗酒和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(圖1B)。GSEA對兩個芯片中的全部基因做富集分析,發(fā)現(xiàn)也顯著富集于蛋白質(zhì)的生物合成、RNA聚合酶、類固醇激素的生物合成和核苷酸的生物合成。

表1 DEGs 的GO富集分析

表2 DEGs的KEGG富集分析

2.3PPI構(gòu)建 利用STRING對DEGs進(jìn)行PPI分析,并對其可視化紅色為上調(diào)基因,綠色為下調(diào)基因。見圖2。

圖2 STRING構(gòu)建DEGs的PPI

2.4Hub基因的選擇和分析 在PPI中,用Cyto-scape的插件Cytohubba(Degree算法)篩選前10個網(wǎng)絡(luò)連接度最高的基因為Hub基因,10個Hub基因在PPI中的網(wǎng)絡(luò)連接度由高到低依次為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)8、雄激素受體(AR)、SRY-box轉(zhuǎn)錄因子(SOX)9、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2、視黃酸受體α(RARA)、RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子(RUNX)1、細(xì)胞色素P450家族19亞家族A成員(CYP19A1)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)13、維生素D受體(VDR)和超氧化物歧化酶(SOD)2,見圖3A。10個Hub基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖見圖3B。利用Cytoscape的BINGO插件對10個Hub基因進(jìn)一步GO富集分析,顯著富集于RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、氮化合物代謝過程的正調(diào)控、多細(xì)胞生物發(fā)展、骨骼發(fā)育、類固醇激素受體活性、配體依賴性核受體活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞生物合成過程的正調(diào)控和轉(zhuǎn)錄激活子活性。見圖4。

深色為Hub基因,顏色越深,排名越靠前圖3 從PPI中篩選的Hub基因

每一個圓圈代表一個GO Term,顏色越深,顯著性越高,圓圈越大圖4 Cytoscape的BINGO插件對Hub基因進(jìn)行GO富集分析

2.5Hub基因-miRNAs相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的構(gòu)建和關(guān)鍵miRNAs的預(yù)測 TargetScan、miRDB和miRWalk三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測Hub基因的靶向miRNAs,Cytoscape構(gòu)建Hub基因和miRNAs的相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖5。同時針對兩個以上Hub基因的miRNAs被定義為關(guān)鍵miRNAs,共得到23個關(guān)鍵miRNAs:miR-1185-1-3p、miR-1185-2-3p(靶基因均為CYP19A1和FGF13),miR-125a-5p、miR-125b-5p(靶基因均為VDR和SOD2),miR-138-5p(靶基因為SOX9和RARA),miR-139-5p(靶基因為MAPK8和RUNX1),miR-27a-3p、miR-27b-3p(靶基因均為RARA和RUNX1),miR-302a-3p、miR-302d-3p、miR-302e(靶基因均為RUNX1和VDR),miR-3153、miR-3159(靶基因均為CYP19A1和SOD2),miR-3169(靶基因為FGF13和SOD2),miR-3675-5p(靶基因為CYP19A1和FGF13),miR-373-3p(靶基因為RUNX1和VDR),miR-4319(靶基因為VDR,SOD2),miR-432-3p、miR-512-5p(靶基因均為CYP19A1和SOD2),miR-520c-3p、miR-520d-3p(靶基因均為RUNX1和VDR),miR-6733-5p、miR-6744-5p(靶基因均為CYP19A1和SOD2)。

3 討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),GSE16464和GSE10575兩個芯片中的OA軟骨組織樣本大多富集于RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、類固醇激素的生物合成和細(xì)胞的增殖。對這10個Hub基因進(jìn)行了更深層次的miRNAs挖掘,共得到23個關(guān)鍵miRNAs,通過對Hub基因-關(guān)鍵miRNAs相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析我們發(fā)現(xiàn)這23個關(guān)鍵miRNAs大多靶向于SOD2、CYP19A1、RUNX1和VDR這4個Hub基因?？梢奡OD2、CYP19A1、RUNX1和VDR這4個Hub基因是OA軟骨退變的過程中的重要生物標(biāo)志物。

SOD2是鐵/錳超氧化物歧化酶家族的成員。該基因的突變與特發(fā)性心肌病(IDC)、過早衰老、偶發(fā)性運(yùn)動神經(jīng)元疾病和癌癥有關(guān)。人OA軟骨中SOD1、SOD2和SOD3顯著降低〔13〕。三種超氧化物歧化酶均在人軟骨中大量表達(dá),而在終末期OA軟骨中,尤其是SOD2表達(dá)明顯下調(diào),SOD2啟動子在OA軟骨組織中有明顯的DNA甲基化改變,軟骨細(xì)胞中SOD2的缺失不但增加活性氧(ROS)和降低膠原酶的表達(dá)〔14〕,而且導(dǎo)致氧化損傷和線粒體功能障礙〔15〕,提示SOD2下調(diào)可能是OA發(fā)病機(jī)制的一個潛在因素。研究發(fā)現(xiàn)?；撬酇通過增加SOD2含量并抑制丙二醛(MDA)和ROS在OA的治療中具有很強(qiáng)的抗氧化活性〔16〕。本研究發(fā)現(xiàn),SOD2在OA軟骨細(xì)胞中下調(diào),與上述研究結(jié)論相一致,可見SOD2是OA軟骨退變過程中的重要生物標(biāo)志物。

CYP19A1編碼酶是細(xì)胞色素P450超家族的成員。細(xì)胞色素P450蛋白是單加氧酶,可催化涉及藥物代謝和膽固醇、類固醇和其他脂質(zhì)合成的許多反應(yīng),該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并催化雌激素生物合成的最后步驟。性激素特別是雌激素,與關(guān)節(jié)軟骨代謝和絕經(jīng)后OA的發(fā)病機(jī)制有關(guān),可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的活性及涉及軟骨基質(zhì)合成代謝和分解代謝的多種因素的合成,包括金屬蛋白酶一氧化氮和活性氧〔17～20〕。在絕經(jīng)后的女性和男性中,周圍組織中的雄激素前體是雌激素的主要來源,該反應(yīng)由位于15號染色體上的CYP19A1基因產(chǎn)物芳香化酶催化〔21〕。通過CYP19A1將雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌酮(E1),將睪酮轉(zhuǎn)化為17β雌二醇(E2),在組織內(nèi)源性合成雌激素中起關(guān)鍵作用〔22〕?？梢奀YP19A1與OA軟骨退變密切相關(guān),這與本研究結(jié)論相一致。

RUNX1編碼的蛋白質(zhì)代表核心結(jié)合因子(CBF)的α亞基,被認(rèn)為與正常造血過程有關(guān)。CBF是一種異二聚體轉(zhuǎn)錄因子,可與許多增強(qiáng)子和啟動子的核心元件結(jié)合。Runx1是決定造血功能的轉(zhuǎn)錄因子,存在于軟骨膜和軟骨細(xì)胞中。Runx1能夠像潤滑蛋白一樣對機(jī)械負(fù)荷和軟骨損傷作出反應(yīng),Runx1在淺層細(xì)胞中與其他因子一起具有通過刺激增殖或促進(jìn)表面蛋白表達(dá)來維持組織表面完整性的潛在功能〔23〕。有研究表明針對RUNX1的靶向治療為開發(fā)針對OA的疾病改良藥物提供了希望〔24〕。本研究發(fā)現(xiàn),RUNX1與OA軟骨退變密切相關(guān),其在OA軟骨退變過程中的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

VDR編碼維生素D3受體,它是配體誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子的核激素受體超家族的成員。維生素D3受體調(diào)節(jié)多種代謝途徑,如參與免疫應(yīng)答和癌癥反應(yīng),但其下游靶標(biāo)主要參與礦物質(zhì)代謝。VDR被認(rèn)為參與軟骨和骨代謝,VDR基因多態(tài)性已被鑒定和分析,其與多種疾病相關(guān),包括OA、癌癥、糖尿病、心血管疾病、病毒感染、結(jié)核病、牙周炎、尿石和自身免疫性疾病〔25〕。有報道表明,VDR多態(tài)性與OA易感性相關(guān)〔26〕。這與本研究結(jié)論VDR是OA軟骨退變過程中的潛在生物標(biāo)志物相一致。

MAPK8在PPI中網(wǎng)絡(luò)連接度最高,在10個Hub基因中排名第一。MAPK8編碼的蛋白質(zhì)是絲裂原活化蛋白(MAP)激酶家族的成員。MAP激酶充當(dāng)多種生化信號的整合點(diǎn),并參與多種細(xì)胞過程,例如增殖,分化,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和發(fā)育。該激酶被各種細(xì)胞刺激激活,并靶向特定的轉(zhuǎn)錄因子,從而響應(yīng)細(xì)胞刺激介導(dǎo)早期的基因表達(dá)。Rabl3的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者M(jìn)APK8/9/10介導(dǎo)的自噬抑制的低生存率相關(guān)〔27〕。miR-190通過靶向MAPK8和調(diào)節(jié)MAPK8/ERK信號通路保護(hù)心肌細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的凋亡〔28〕。MAPK8通過MAPK信號通路介導(dǎo)對替莫唑胺的抗性和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞凋亡〔29〕。研究發(fā)現(xiàn)他莫昔芬通過MAPK8/叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)途徑誘導(dǎo)乳腺癌的脂肪肝疾病〔30〕。然而目前尚無報道MAPK8與OA相關(guān),本研究發(fā)現(xiàn)MAPK8在OA軟骨退變過程中上調(diào),是OA軟骨退變的潛在生物標(biāo)志物,具有較大的研究價值。

SOX9編碼的蛋白質(zhì)與HMG-box類DNA結(jié)合蛋白的其他成員一起識別CCTTGAG序列。 它在軟骨細(xì)胞分化過程中起作用,缺乏可導(dǎo)致骨骼畸形綜合征。據(jù)報道,OA軟骨中SOX9表達(dá)降低〔31〕,SOX9過表達(dá)可減輕人類OA的進(jìn)展〔32〕,microRNA-384-5p通過靶向SOX9經(jīng)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路抑制軟骨細(xì)胞的凋亡而減輕OA〔33〕。本研究發(fā)現(xiàn),SOX9在OA軟骨退變中下調(diào)。

BMP2編碼蛋白質(zhì)的(TGF)-β超家族的分泌配體。 編碼的前蛋白經(jīng)過蛋白水解生成二硫鍵連接的同型二聚體的每個亞基,后者在骨骼和軟骨發(fā)育中發(fā)揮作用。幼鼠中誘導(dǎo)BMP2過表達(dá)可導(dǎo)致實驗性O(shè)A中骨贅形成加重,但不改變軟骨損傷〔34〕。OA病變周圍的軟骨細(xì)胞中BMP2水平升高〔34〕,本研究發(fā)現(xiàn),BMP2在OA軟骨退變中下調(diào),可見BMP2與OA軟骨具有密切的關(guān)系。

AR編碼具有3個主要功能域的蛋白質(zhì):N末端域、DNA結(jié)合域和雄激素結(jié)合域。該蛋白質(zhì)起類固醇激素激活的轉(zhuǎn)錄因子的作用。AR與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的多種途徑相互作用。RARA以配體依賴性方式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。該基因座和其他幾個基因座之間的易位與急性早幼粒細(xì)胞白血病有關(guān)。FGF13編碼的蛋白質(zhì)是FGF家族的成員。FGF家族成員具有廣泛的促有絲分裂和細(xì)胞存活活性,并參與多種生物學(xué)過程,包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長、形態(tài)發(fā)生、組織修復(fù)、腫瘤生長和侵襲。研究發(fā)現(xiàn),FGF13在局灶性皮質(zhì)異常病變中的表達(dá)增加〔35〕;FGF13是一種新的NF-κB調(diào)節(jié)因子,可增強(qiáng)病理性心肌肥厚〔36〕。AR、RARA和FGF13與OA的相關(guān)性目前尚無報道,本研究發(fā)現(xiàn)AR、RARA和FGF13在OA軟骨退變中下調(diào),是OA軟骨退變中的潛在作用因子。