miR-210-3p通過自噬調(diào)控MC3T3-E1細胞成骨分化的機制研究*

楊玉梅， 林青， 李小云，3， 葉倩云， 張志芬， 朱曉峰，3， 楊麗， 張榮華，3△

miR-210-3p通過自噬調(diào)控MC3T3-E1細胞成骨分化的機制研究*

楊玉梅1， 林青2， 李小云1，3， 葉倩云2， 張志芬1， 朱曉峰2，3， 楊麗1， 張榮華1，3△

（1暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632；2暨南大學中醫(yī)學院，廣東 廣州 510632；3廣東省中醫(yī)藥信息化重點實驗室，廣東 廣州 510632）

探討微小RNA-210-3p（microRNA-210-3p， miR-210-3p）通過自噬對小鼠成骨細胞系MC3T3-E1成骨分化的影響。（1）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建miR-210-3p過表達或沉默的MC3T3-E1細胞模型，設置陰性對照（negative control， NC） mimic組、miR-210-3p mimic組、NC inhibitor組和miR-210-3p inhibitor組，Western blot、RT-qPCR和免疫熒光法檢測MC3T3-E1細胞成骨分化相關指標及自噬相關指標的變化，茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。（2）用雷帕霉素（rapamycin， RAPA）和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine， 3-MA）分別構(gòu)建自噬激活和抑制模型，設置control組、RAPA組和3-MA組，Western blot、RT-qPCR和免疫熒光法檢測自噬激活或抑制后MC3T3-E1細胞成骨分化相關指標的變化，茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。（3）設置NC mimic組、NC mimic+RAPA組和miR-210-3p mimic+RAPA組，Western blot和RT-qPCR檢測各組MC3T3-E1細胞成骨分化相關指標的變化。（1）與NC mimic組相比，miR-210-3p mimic組細胞成骨分化指標的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（<0.05），細胞內(nèi)Runx2免疫熒光強度升高，礦化結(jié)節(jié)數(shù)目增加，細胞自噬水平顯著降低（<0.05）。與NC inhibitor組相比，miR-210-3p inhibitor組細胞成骨分化指標的mRNA和蛋白表達水平顯著降低（<0.05），細胞內(nèi)Runx2疫熒光強度降低，礦化結(jié)節(jié)數(shù)目減少，細胞自噬水平顯著升高（<0.05）。（2）與control組相比，3-MA組細胞成骨分化指標的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（<0.05），細胞內(nèi)Runx2免疫熒光強度升高，而RAPA組細胞成骨分化指標的mRNA和蛋白表達水平顯著降低（<0.05），細胞內(nèi)Runx2免疫熒光強度降低。（3）miR-210-3p過表達可逆轉(zhuǎn)RAPA對MC3T3-E1細胞成骨分化的抑制作用（<0.01）。miR-210-3p可通過降低自噬水平促進MC3T3-E1細胞的成骨分化。

骨質(zhì)疏松癥；微小RNA-210-3p；自噬；MC3T3-E1細胞；成骨分化

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis， OP）是臨床常見的骨代謝疾病，其特征表現(xiàn)為骨量降低、骨組織受損和骨微結(jié)構(gòu)破壞［1］?，F(xiàn)有的研究顯示，OP的發(fā)生與性激素水平的改變、年齡的增長、遺傳因素、營養(yǎng)狀況、生活習慣等密切相關［2-4］，但其根本原因在于成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收動態(tài)失衡。成骨細胞是骨形成、骨骼發(fā)育和生長的關鍵功能細胞，主要通過合成、分泌和礦化骨基質(zhì)進行骨重建，其細胞增殖和分化活性是影響骨形成的關鍵因素［5］。因此，如何促進骨形成來提高骨量對于開展OP的防治研究具有重要意義。

微小RNA（microRNA， miRNA， miR）是一類長約22個核苷酸的高度保守單鏈非編碼小分子RNA，主要通過抑制靶基因蛋白質(zhì)翻譯或促進其mRNA降解，進而調(diào)控靶基因表達［6］。研究發(fā)現(xiàn)，諸多miRNA通過各種信號傳導途徑調(diào)節(jié)干細胞的成骨分化和骨重建過程。miR-196a被證實可通過靶向HDAC9促進小鼠成骨細胞系MC3T3-E1的成骨分化［7］。miR-216a能調(diào)節(jié)c-Cbl介導的PI3K/AKT通路以增強成骨細胞分化和骨形成［8］。miR-381-3p通過下調(diào)MC3T3-E1細胞中的ERK1/2/ETS1信號通路表達水平進而抑制成骨分化［9］。本課題組前期篩查了OP大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）外泌體miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)介導自噬信號通路的miR-210-3p能明顯促進BMSCs的成骨分化［10-11］。但miR-210-3p對成骨細胞的作用尚未見深入的相關研究。

自噬水平的變化與成骨細胞的功能和活性息息相關。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)自噬相關基因7（autophagy-related gene 7，）敲除導致小鼠骨體積分數(shù)、骨皮質(zhì)厚度和骨密度明顯下降，提示了自噬可能參與了骨代謝的調(diào)控［12］。維生素K2能通過自噬誘導刺激MC3T3-E1成骨細胞分化和礦化［13］。Gavali等［14］發(fā)現(xiàn)，雌激素能促進成骨細胞分化過程中的自噬，從而提高成骨細胞的活性和礦化能力，證明成骨細胞的功能與自噬有關。同時，miRNA也是一類重要的自噬調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控自噬的不同階段［15］。且miRBase及TargetScan靶基因分析顯示，miR-210-3p與自噬相關蛋白Atg5、Atg7和Atg13的3'非翻譯區(qū)都存在結(jié)合位點，因此miR-210-3p可能調(diào)節(jié)成骨細胞的自噬。鑒于此，本研究以MC3T3-E1細胞為研究對象，探討miR-210-3p通過自噬調(diào)控MC3T3-E1細胞成骨分化的作用機制。

材料和方法

1　主要試劑

miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒（B532451-0020）、RT-qPCR引物及miR-210-3p的模擬物（mimic）和抑制物（inhibitor）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Lipofectamine 2000（52887）購自Invitrogen；Opti-MEM培養(yǎng)液購自Gibco；抗Beclin-1抗體（ab62557）、抗p62抗體（ab91526）和抗微管相關蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B， LC3B）抗體（ab48394）均購自Abcam；抗堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， Alp）抗體（ab83259）和抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2， Bmp2）抗體（ab214821）均購自Abpromise；抗Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2， Runx2）抗體（12556S）和抗β-actin抗體（4970S）均購自Cell Signaling Technology；雷帕霉素（rapamycin， RAPA； HY-10219）購自MedChemExpress；茜素紅染液（G1450）購于北京索萊寶科技有限公司；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine， 3-MA； S24823）購自上海源葉生物公司；BCA定量試劑盒（23227）購自Thermo Fisher；RIPA裂解液（P0013B）、免疫染色Ⅰ抗稀釋液（P0103）、免疫染色洗滌液（P0106C）、免疫染色封閉液（P0102）、免疫熒光染色試劑盒-抗兔Alexa Fluor 488（P0176）、DAPI染色液（C1006）和抗熒光淬滅劑（P0126）均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2　主要方法

2.1細胞培養(yǎng)和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞購自中科院上海細胞庫，在含10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）和1%青霉素-鏈霉素的Opti-MEM中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前1 d，將細胞接種于6孔板中，次日當細胞密度達到60%左右時進行轉(zhuǎn)染實驗，使用Lipofectamine 2000將miR-210-3p mimic、NC mimic、miR-210-3p inhibitor和NC inhibitor分別轉(zhuǎn)入MC3T3-E1細胞中，轉(zhuǎn)染8 h后，將無血清培養(yǎng)液更換為含10% FBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后檢查各指標變化。

2.2實驗分組干預（1）miR-210-3p mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染細胞的分組如下：NC mimic組和miR-210-3p mimic組；NC inhibitor 組和miR-210-3p inhibitor組。（2）加入自噬抑制劑或自噬激活劑干預細胞的分組如下：control組（正常細胞）、3-MA組（5 mmol/L 3-MA干預24 h）和RAPA組（10 μmol/L RAPA干預24 h）。（3）自噬激活后再過表達miR-210-3p的分組如下：NC mimic組（正常細胞培養(yǎng)24 h后，再轉(zhuǎn)染NC mimic）、RAPA+NC mimic組（10 μmol/L RAPA干預24 h后，再轉(zhuǎn)染NC mimic）和RAPA+miR-210-3p mimic組（10 μmol/L RAPA干預24 h后，再轉(zhuǎn)染miR-210-3p mimic）。

2.3RT-qPCR胰酶消化各組細胞后，使用Trizol試劑提取總RNA。針對mRNA的RT-qPCR檢測，取各組細胞1 600 ng總RNA，然后使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，把它逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算分析各組細胞的骨形成指標Alp、Bgp、Col1a1和Runx2，以及自噬指標p62、Beclin-1和Map1lc3b的mRNA表達。針對miRNA的RT-qPCR檢測，采用miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒，將500～1 000 ng的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算分析各組細胞miR-210-3p的表達。引物序列見表1。

表1　引物序列

F： forward； R： reverse； Alp： alkaline phosphatase； Col1a1： collagen type I alpha 1 chain； Runx2： Runt-related transcription factor 2； Bgp： bone γ-carboxyglutamic acid protein； Map1lc3b： microtubule-associated protein 1 light chain 3B.

2.4Western blot實驗使用RIPA裂解液裂解各組細胞，然后提取總蛋白，BCA法檢測并調(diào)整蛋白濃度，進行SDS-PAGE。依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，4 ℃孵育一抗（1∶1 000稀釋）過夜，洗滌后，加入ECL發(fā)光液，曝光顯影，使用ImageJ軟件分析顯影條帶的灰度值，并對蛋白表達定量。

2.5免疫熒光法將細胞接種于24孔板，按照上述分組及處理后，各組去除培養(yǎng)液，加入PBS洗滌3次，然后加入免疫染色固定液10 min后棄去，免疫染色洗滌液洗滌3次；用免疫染色封閉液封閉1 h后去除，4 ℃孵育一抗過夜；次日，用洗滌液清洗3次，每次5 min；熒光標記二抗避光孵育1 h；取出，并用洗滌液清洗3次，每次5 min，期間注意避光操作；滴加100 μL DAPI染色液10 min，然后用洗滌液清洗3次，每次5 min；加入少量抗熒光淬滅劑，用熒光顯微鏡觀察、拍照。

2.6茜素紅染色在α-MEM成骨誘導完全培養(yǎng)液（含10% FBS）條件下培養(yǎng)細胞，每隔3 d換液一次，各組干預28 d，棄培養(yǎng)液，PBS清洗2～3次，10%中性福爾馬林固定液固定細胞10 min，PBS清洗2～3次，加入適量的茜素紅染液浸沒細胞，置于室溫放置2 h。PBS洗3次，顯微鏡下觀察并拍照。

3　統(tǒng)計學處理

使用軟件GraphPad Prism 8.0分析實驗數(shù)據(jù)。結(jié)果用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較采用檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1　轉(zhuǎn)染模型的構(gòu)建

MC3T3-E1細胞轉(zhuǎn)染48 h后，RT-qPCR檢測其miR-210-3p表達的變化。結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-210-3p mimic組的miR-210-3p表達顯著上調(diào)（<0.01），見圖1A；與NC inhibitor組相比，miR-210-3p inhibitor組的miR-210-3p表達顯著下調(diào)（<0.01），見圖1B。

Figure 1.　The expression level of miR-210-3p after miR-210-3p mimic （A） or inhibitor （B） transfection. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC mimic or inhibitor group.

2　miR-210-3p對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-210-3p mimic組Col1a1、Alp和Bgp的mRNA表達水平顯著升高（<0.01），Runx2的mRNA表達無顯著變化（>0.05），見圖2A；與NC inhibitor組相比，miR-210-3p inhibitor組Col1a1、Alp、Bgp和Runx2的mRNA表達水平顯著降低（<0.05），見圖2B。

Figure 2.　The mRNA expression of osteogenic differentiation factors in MC3T3-E1 cells after miR-210-3p mimic （A） or inhibitor （B） transfection. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NC mimic or inhibitor group.

Western blot結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-210-3p mimic組Bmp2和Runx2蛋白表達水平顯著升高（<0.01），Alp蛋白無顯著變化（>0.05），見圖3A；與NC inhibitor組相比，miR-210-3p inhibitor組Alp、Bmp2和Runx2蛋白表達水平顯著降低（<0.01），見圖3B。

Figure 3.　The protein expression of osteogenic differentiation factors in MC3T3-E1 cells after miR-210-3p mimic （A） or inhibitor （B） transfection. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC mimic or inhibitor group.

免疫熒光檢測miR-210-3p過表達或沉默后MC3T3-E1細胞中Runx2的表達及分布，結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-210-3p mimic組Runx2免疫熒光強度明顯增強；與NC inhibitor組相比，miR-210-3p inhibitor組Runx2免疫熒光強度明顯降低，見圖4。

Figure 4.　Immunofluorescence detection of Runx2 in MC3T3-E1 cells after miR-210-3p mimic or inhibitor transfection.

茜素紅染色結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-210-3p mimic組礦化結(jié)節(jié)數(shù)目明顯增加；與NC inhibitor組相比，miR-210-3p inhibitor組礦化結(jié)節(jié)數(shù)目明顯減少，見圖5。

Figure 5.　Effect of miR-210-3p on mineralized nodules of MC3T3-E1 cells.

3　miR-210-3p對MC3T3-E1細胞自噬的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-210-3p mimic組Beclin-1的mRNA表達水平顯著降低（<0.01），p62的mRNA表達水平顯著升高（<0.05），Map1lc3b的mRNA表達顯著降低（<0.01），見圖6A；與NC inhibitor組相比，miR-210-3p inhibitor組Map1lc3b和Beclin-1的mRNA表達水平均顯著升高（<0.05），p62的mRNA表達水平顯著降低（<0.01），見圖6B。

Figure 6.　The mRNA expression of autophagy-related factors in MC3T3-E1 cells after miR-210-3p mimic （A） or inhibitor （B） transfection. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NC mimic or inhibitor group.

Western blot結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-210-3p mimic組Beclin-1蛋白表達水平顯著降低（<0.01），p62蛋白表達水平顯著升高（<0.05），LC3-II/LC3-I比值無顯著變化（>0.05），見圖7A；與NC inhibitior組相比，miR-210-3p inhibitor組LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白表達水平顯著升高（<0.05），p62蛋白表達水平顯著降低（<0.01），見圖7B。

Figure 7.　The protein expression of autophagy-related factors in MC3T3-E1 cells after miR-210-3p mimic （A） or inhibitor （B） transfection. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NC mimic or inhibitor group.

免疫熒光檢測miR-210-3p過表達或沉默后MC3T3-E1細胞中LC3B、Beclin-1和p62的表達和分布，結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-210-3p mimic組p62免疫熒光強度明顯增強，Beclin-1和LC3B免疫熒光強度明顯降低；與NC inhibitor組相比，miR-210-3p inhibitor組p62免疫熒光強度明顯降低，Beclin-1和LC3B免疫熒光強度明顯增強，見圖8。

Figure 8.　Immunofluorescence detection of autophagy-related factors in MC3T3-E1 cells after miR-210-3p mimic or inhibitor transfection. A： LC3B； B： p62； C： Beclin-1.

4　自噬抑制劑3-MA和自噬激活劑RAPA濃度的選擇

用不同濃度的自噬抑制劑和自噬激活劑干預MC3T3-E1細胞后，Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，5 mmol/L 3-MA組Beclin-1蛋白表達水平明顯降低，p62蛋白表達水平明顯升高，而10 μmol/L RAPA組Beclin-1蛋白表達水平明顯升高，p62蛋白表達水平明顯降低，見圖9。因此，選擇5 mmol/L 3-MA和10 μmol/L RAPA進行后續(xù)實驗。

Figure 9.　Selection of concentrations of autophagy inhibitor 3-MA （A） and autophagy activator RAPA （B）.

5　自噬抑制或激活對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與control組相比，3-MA組Alp、Col1a1和Runx2的mRNA表達水平顯著升高（<0.01），而PAPA組Alp、Col1a1和Runx2的mRNA表達水平顯著降低（<0.01），見圖10。

Figure 10.　Effect of autophagy on the mRNA expression of osteogenic differentiation factors in MC3T3-E1 cells. A： Alp； B： Runx2； C： Col1a1. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，3-MA組Alp、Runx2和Bmp2蛋白表達水平顯著升高（<0.05），而RAPA組Alp和Runx2蛋白表達水平顯著降低（<0.01），Bmp2蛋白表達則無顯著變化（>0.05），見圖11。

Figure 11.　Effect of autophagy on the protein expression levels of osteogenic differentiation factors in MC3T3-E1 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

免疫熒光檢測3-MA或RAPA干預后MC3T3-E1細胞中Runx2的表達和分布，結(jié)果顯示，與control組相比，3-MA組Runx2免疫熒光強度明顯增加，而RAPA組Runx2免疫熒光強度明顯降低，見圖12。

Figure 12.　Immunofluorescence detection of Runx2 in MC3T3-E1 cells after autophagy inhibition or activation.

6　miR-210-3p過表達對自噬激活后MC3T3-E1細胞成骨分化的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，RAPA+NC mimic組Alp、Runx2和Col1a1的mRNA表達水平顯著降低（<0.01）；與RAPA+NC mimic組相比，RAPA+miR-210-3p mimic組Alp和Runx2的mRNA表達水平顯著升高（<0.005），Col1a1的mRNA表達無顯著變化（>0.05），見圖13。

Figure 13.　Effect of miR-210-3p overexpression on the mRNA expression of osteogenic differentiation factors in MC3T3-E1 cells after autophagy activation. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC mimic group； ##P<0.01 vs RAPA+NC mimic group.

Western blot結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，RAPA+NC mimic組Alp、Runx2和Bmp2蛋白表達水平顯著降低（<0.01）；與RAPA+NC mimic組相比，RAPA+miR-210-3p mimic組Alp、Runx2和Bmp2蛋白表達水平顯著升高（<0.01），見圖14。

Figure 14.　Effect of miR-210-3p overexpression on the protein expression of osteogenic differentiation factors in MC3T3-E1 cells after autophagy activation. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC mimic group； ##P<0.01 vs RAPA+NC mimic group.

討論

OP是一種常見的慢性疾病，主要特點為骨量減少，骨脆性增加，易發(fā)生骨折。臨床上OP患者主要表現(xiàn)為腰背疼痛和活動受限，往往伴隨有變矮和駝背等并發(fā)癥。隨著人口老齡化趨勢的迅速發(fā)展，OP的發(fā)病率逐年上升，在我國的患病人數(shù)已達9 000萬，其女性約7 000萬［16］。目前臨床上治療OP的藥物以雙膦酸鹽類抗骨吸收抑制劑為主等，這些藥物雖然對OP具有一定的治療作用，但是也存在許多副作用，如引發(fā)非典型股骨骨折、下頜骨壞死、心腦血管疾病等不良反應［17-18］。因此，探索相關的骨形成藥物可能是一重要突破口。在本研究中，將調(diào)節(jié)骨形成作為出發(fā)點來探尋OP的防治手段。近年來，miRNA作為骨代謝相關靶點的調(diào)節(jié)劑而被重點關注。隨著表觀遺傳學的深入研究，越來越多的證據(jù)表明miRNA在骨骼發(fā)育和細胞的成骨分化過程中扮演著重要角色［19］。研究證實miR-1260a下調(diào)HDAC7和COL4A2的表達促進BMMSCs成骨分化［20］。miR-135-5p通過靶向HIF1AN促進MC3T3-E1細胞成骨分化［21］。金絲桃苷（hyperin）通過上調(diào)MC3T3-E1細胞中的miR-7031-5p而促進成骨分化［22］。本實驗室前期篩查OP大鼠BMSCs外泌體miRNA表達譜發(fā)現(xiàn)，miR-210-3p能明顯促進成骨分化。另外，本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-210-3p過表達后MC3T3-E1細胞成骨分化能力增加，miR-210-3p沉默后MC3T3-E1細胞成骨分化能力降低，提示miR-210-3p與MC3T3-E1細胞成骨分化正相關。所以，miR-210-3p能提高骨形成能力可作為其能防止OP發(fā)生發(fā)展的重要手段。

自噬是細胞質(zhì)成分（如功能失調(diào)的細胞器）被包裹形成自噬體的過程，然后將后者轉(zhuǎn)運到溶酶體進行降解，以便營養(yǎng)物質(zhì)可以再利用［23］，這種分解代謝過程在所有細胞中都處于基本水平，以促進細胞在營養(yǎng)剝奪或缺氧下的存活［24］。近年來大量文獻證實，自噬信號通路介導了成骨細胞的分化，從而維持骨穩(wěn)態(tài)。Cai等［25］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過促進自噬誘導MC3T3-E1細胞的增殖和分化。山柰酚通過誘導自噬促進MC3T3-E1細胞分化和礦化［26］。Weng等［27］發(fā)現(xiàn)，敲除了的成骨細胞，不僅其增殖和分化受到了抑制，且更容易受到氧化應激而導致細胞凋亡。所以，針對自噬信號途徑可能是診治OP疾病的有效策略。緊接著，我們通過補充驗證自噬對MC3T3-E1細胞的成骨分化作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬抑制對MC3T3-E1細胞的成骨分化有促進作用，自噬激活則抑制MC3T3-E1細胞成骨分化。

此外，miRNA參與自噬調(diào)控的不同階段，自噬的發(fā)生受miRNA的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-20a可以顯著下調(diào)自噬相關因子LC3及p62等表達［28］。在退化的髓核細胞中，miR-210通過沉默來抑制自噬，從而促進細胞外基質(zhì)降解［29］。miR-27a通過PI3K/AKT/mTOR信號傳導促進骨關節(jié)炎中IL-1β處理關節(jié)軟骨細胞的自噬和凋亡［30］。且前期實驗篩查出的miR-210-3p在參與調(diào)控成骨分化過程中也證實與自噬調(diào)節(jié)有關，所以這里進一步體外探究miR-210-3p與自噬之間的關系。RT-qPCR、Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示，miR-210-3p和自噬相關指標表達呈負相關關系。因此我們猜測，miR-210-3p對成骨細胞的調(diào)控可能與自噬有關。進一步探究miR-210-3p對自噬激活狀態(tài)下MC3T3-E1細胞的影響，發(fā)現(xiàn)miR-210-3p能逆轉(zhuǎn)自噬激活狀態(tài)下MC3T3-E1細胞成骨分化抑制的趨勢。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-210-3p可通過降低自噬水平促進MC3T3-E1細胞的成骨分化，挖掘了MC3T3-E1細胞成骨分化的新機制，可為OP的研究提供參考。

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miR-210-3p regulates osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells through autophagy

YANG Yumei1， LIN Qing2， LI Xiaoyun1，3， YE Qianyun2， ZHANG Zhifen1， ZHU Xiaofeng2，3， YANG Li1， ZHANG Ronghua1，3△

（1，，510632，；2，，510632，；3，510632，）

To investigate the effect of microRNA-210-3p （miR-210-3p） on osteogenic differentiation of mouse osteoblastic cell line MC3T3-E1， and to explore its mechanism related to autophagy.（1） Lipofection was used to construct MC3T3-E1 cell model with overexpression or silencing of miR-210-3p， and negative control （NC） mimic group， miR-210-3p mimic group， NC inhibitor group and miR-210-3p inhibitor group were set up， Western blot， RT-qPCR and immunofluorescence were used to detect the changes of osteogenic differentiation- and autophagy-related factors in MC3T3-E1 cells， and alizarin red staining was used to observe the mineralized nodules. （2） Rapamycin （RAPA） or 3-methyladenine （3-MA） was used to construct autophagy activation or inhibition model， and control group， RAPA group and 3-MA group were set up. Western blot， RT-qPCR and immunofluorescence were used to detect the changes of osteogenic differentiation factors in MC3T3-E1 cells after autophagy activation or inhibition， and alizarin red staining was used to observe the mineralized nodules. （3） The cells were divided into NC mimic group， NC mimic+RAPA group and miR-210-3p mimic+RAPA group， and Western blot and RT-qPCR were used to detect the changes of osteogenic differentiation factors in each group.（1） Compared with NC mimic group， the mRNA and protein expression levels of osteogenic differentiation factors were increased in miR-210-3p mimic group （<0.05）， the immunofluorescence intensity of Runx2 was increased in the cells， the number of mineralized nodules was increased， and the level of autophagy was decreased （<0.05）. Compared with NC inhibitor group， the mRNA and protein expression levels of osteogenic differentiation factors were decreased in miR-210-3p inhibitor group （<0.05）， the immunofluorescent intensity of Runx2 was decreased in the cells， the number of mineralized nodules was reduced， and the level of autophagy was increased in the miR-210-3p inhibitor group （<0.05）. （2） Compared with control group， the mRNA and protein expression levels of osteogenic differentiation factors were increased in 3-MA group （<0.05）， and the immunofluorescence intensity of Runx2 was increased in the cells. By contrast， the mRNA and protein expression levels of osteogenic differentiation factors were decreased in RAPA group （<0.05）， and the immunofluorescence intensity of Runx2 was decreased in the cells. （3） Overexpression of miR-210-3p reversed the inhibitory effect of RAPA on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells （<0.01）.miR-210-3p promotes osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells by inhibiting autophagy.

osteoporosis； microRNA-210-3p； autophagy； MC3T3-E1 cells； osteogenic differentiation

1000-4718（2023）07-1253-12

2023-05-08

2023-06-26

020-85220007； E-mail： tzrh@jnu.edu.cn

R363.2； R681

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.07.012

［基金項目］國家自然科學基金項目（No. 82074287； No. 82274232）；國家重點研發(fā)計劃項目（No. 2018YFC2002501）；廣東省中醫(yī)藥信息化重點實驗室（No. 2021B1212040007）

（責任編輯：盧萍，羅森）