慢性應(yīng)激通過增加齒狀回的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子減輕阿爾茨海默病樣大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷*

徐銘振， 馮慧， 李盛輝， 卿培， 吳喜悅， 肖斌

慢性應(yīng)激通過增加齒狀回的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子減輕阿爾茨海默病樣大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷*

徐銘振， 馮慧， 李盛輝， 卿培， 吳喜悅， 肖斌△

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

觀察慢性應(yīng)激（CS）對阿爾茨海默?。ˋD）樣學(xué)習(xí)記憶損傷模型大鼠海馬齒狀回（DG）的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）及其1型受體（CRFR1）的影響，并探討CRFR1在CS引起的AD樣模型大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力改變中的作用。雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照（CON）組、AD模型（AD）組和AD給予CS（AD+CS）組，每組7只。用側(cè)腦室單次注射鏈脲佐菌素聯(lián)合長期腹腔注射D-半乳糖（每天1次，共6周）的方法制備AD樣學(xué)習(xí)記憶損傷模型大鼠；AD+CS組大鼠在D-半乳糖注射的后4周，每天隨機(jī)給予一種應(yīng)激原刺激。Morris水迷宮評估大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力；免疫組織化學(xué)染色觀察海馬Aβ1-42的表達(dá)；ELISA檢測DG區(qū)CRF的水平；Western blot法觀察DG區(qū)CRFR1表達(dá)。之后，AD大鼠DG區(qū)注射CRFR1阻斷劑R121919，觀察其對CS條件下的AD樣模型大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。與CON組比較，AD樣模型大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力顯著下降，且海馬區(qū)Aβ1-42沉積增多；而給予CS可緩解AD樣模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙，減少海馬Aβ1-42沉積。與CON組比較，AD組大鼠DG區(qū)CRF水平和CRFR1表達(dá)均顯著降低（<0.05），而AD+CS大鼠DG區(qū)的CRF水平和CRFR1表達(dá)均顯著高于AD組（<0.05）。大鼠DG區(qū)微量注射R121919顯著損傷CS條件下AD大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力（<0.05）。CS增加AD樣模型大鼠DG區(qū)CRF水平，后者通過激活CRFR1減輕AD樣模型大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能損傷。

慢性應(yīng)激；阿爾茨海默??；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子；海馬齒狀回；空間學(xué)習(xí)和記憶

應(yīng)激是指機(jī)體在受到內(nèi)、外環(huán)境的有害刺激時所做出的非特異性適應(yīng)反應(yīng)，利于機(jī)體在變動的環(huán)境中維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)，提高機(jī)體應(yīng)對有害刺激的能力。應(yīng)激時機(jī)體最關(guān)鍵的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)之一是下丘腦-腺垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamus-pituitary-adrenal cortex， HPA）軸的激活，即應(yīng)激原觸發(fā)下丘腦室旁核的神經(jīng)元釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropin-releasing facter， CRF），后者通過促進(jìn)垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素，引起腎上腺皮質(zhì)合成和釋放大量的糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid， GC）［1］。由上述過程可知，CRF是應(yīng)激時啟動HPA軸引起中樞效應(yīng)的前驅(qū)神經(jīng)內(nèi)分泌激素和神經(jīng)調(diào)質(zhì)，并通過CRF受體（CRF receptors， CRFR）發(fā)揮其調(diào)制作用，CRFR分為1型和2型，其中1型受體（CRFR1）與CRF的親和力顯著高于2型受體，且主要介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)［2］。

海馬是腦內(nèi)邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，臨床數(shù)據(jù)提示人腦的海馬內(nèi)CRF含量較高，并分布大量的CRFR1及GC受體［2］，因此，海馬對應(yīng)激刺激高度敏感，是HPA軸的重要調(diào)節(jié)元件。動物實(shí)驗研究表明，應(yīng)激對海馬認(rèn)知功能的影響較為復(fù)雜，既可能帶來積極的促進(jìn)作用［3］，也可能損傷海馬的學(xué)習(xí)記憶能力［4-5］。哺乳動物的海馬主要分為CA1、CA3及齒狀回（dentate gyrus， DG）區(qū)，其中DG作為外界信息進(jìn)入海馬的關(guān)鍵部位，在空間學(xué)習(xí)和記憶中起著重要作用［6-7］，本課題組的前期研究也表明，慢性應(yīng)激（chronic stress， CS）能夠影響大鼠海馬DG的空間學(xué)習(xí)記憶能力［8］。不僅如此，大量的動物實(shí)驗結(jié)果顯示應(yīng)激可通過增加神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激水平和神經(jīng)遞質(zhì)含量等影響突觸的結(jié)構(gòu)及功能，參與神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）等的發(fā)生和發(fā)展過程［4， 9］，但其具體分子發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚。此外，與人類相似，大鼠海馬內(nèi)分布有豐富的CRF及CRFR1，因此，大鼠是探究應(yīng)激誘發(fā)認(rèn)知功能改變的重要實(shí)驗對象［4-5， 10］。可見探討大鼠海馬DG的CRF-CRFR1系統(tǒng)在應(yīng)激中的應(yīng)答變化及其對AD樣模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用，對進(jìn)一步認(rèn)識應(yīng)激誘發(fā)海馬學(xué)習(xí)記憶改變的機(jī)制和應(yīng)對老齡化社會均有積極意義。

因此，本研究利用側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）聯(lián)合腹腔注射D-半乳糖（D-galactose， D-Gal）的方法建立AD樣學(xué)習(xí)記憶損傷模型大鼠，觀察4周的CS對其空間學(xué)習(xí)和記憶的影響，并探討DG區(qū)CRFR1在CS條件下AD樣模型大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能改變中的作用。

材料和方法

1　動物

5個月齡SPF級雄性Wistar大鼠45只，體重450～500 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物許可證號為SCXK（遼）2015-0001。所有大鼠在自然光照，室溫20～25 ℃的環(huán)境下飼養(yǎng)。動物實(shí)驗方案經(jīng)延邊大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2　主要試劑

STZ和D-Gal購自Sigma，兩者均在使用前溶解于生理鹽水（normal saline， NS）；R121919（CRFR1阻斷劑）購自Sigma，溶解于純水中使用；大鼠CRF的ELISA試劑盒購自上海恒遠(yuǎn)生物科技股份有限公司；CRFR1（又稱CRHR1）兔抗大鼠抗體、Aβ1-42兔抗大鼠抗體、β-actin兔抗大鼠抗體和抗兔IgG-HRP連接Ⅱ抗購自Abcam或Cell Signaling Technology；ECL顯影液購自Millipore。

3　主要方法

3.1實(shí)驗分組和模型的制備本實(shí)驗中動物分兩個大組進(jìn)行實(shí)驗：（1）第1大組：分為對照（control， CON）組（=7）、AD組（=7）和AD大鼠給予4周CS刺激（AD+CS）組（=7），主要觀察CS對AD大鼠DG的CRF-CRFR1系統(tǒng)及空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響；（2）第2大組：分為AD+NS組（=6）、AD+CS+NS組（=6）和AD+CS+R121919組（=8），主要觀察阻斷海馬DG區(qū)的CRFR1對CS下AD樣模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

AD樣模型大鼠的制備方法與課題組前期造模方法一致［7］，即：腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉大鼠后固定于腦立體定向儀上。消毒后在大鼠頭部正中做切口，參照《大鼠腦立體定位圖》于大鼠雙側(cè)側(cè)腦室上方鉆出小孔，利用微量注射器往側(cè)腦室（定位坐標(biāo)：以前鹵為原點(diǎn)，旁開1.4 mm，后0.7 mm，深4.0 mm）微量注射2 μL STZ（0.5 mg/kg），速度為0.5 μL/min，注射后留針5 min，拔針后用膠封住注射孔，并縫合切口。手術(shù)后恢復(fù)3 d，以后每天腹腔注射D-Gal（60 mg/kg），共6周；CON組大鼠用等體積NS代替STZ和D-Gal。

CS模型大鼠與課題組前期造模方法一致［8］，即：AD樣模型大鼠側(cè)腦室注射STZ 2周后，每天按照隨機(jī)數(shù)表給予大鼠以下應(yīng)激原中的一種：束縛4 h、夾尾2 min、冰水游泳5 min、禁食禁水24 h、懸尾3 min、水平旋轉(zhuǎn)15 min、通宵照明12 h或傾斜鼠籠24 h（同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)），共持續(xù)4周。

3.2海馬DG區(qū)微量注射法前2周的CS結(jié)束后，第2大組的大鼠進(jìn)行第2次手術(shù)。大鼠深度麻醉后固定于立體腦定位儀上，將外套管垂直插入DG（定位坐標(biāo)：以前鹵為原點(diǎn)，后3.4 mm，左/右側(cè)1.6 mm，深3.0 mm），用牙托粉和牙托水混合物固定在顱骨上。術(shù)后大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)24 h，之后每天應(yīng)激前（即CS第3和第4周）和Morris水迷宮訓(xùn)練前，微量注射管經(jīng)外套管插入DG區(qū)，注射2 μL的R121919（1 g/L）或相應(yīng)溶媒，3 min內(nèi)注射完，留針1 min后拔出微量注射管。

3.3Morris水迷宮實(shí)驗Morris水迷宮實(shí)驗過程與本課題組既往研究方法一致［7-8］，即分為定位航行實(shí)驗和空間探索實(shí)驗。正式實(shí)驗前所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性游泳一次，約2 min，所有實(shí)驗在每天相同時間段進(jìn)行。（1）定位航行實(shí)驗：共4 d，記錄大鼠從入水到完全爬上隱藏在水下站臺所用的時間（即逃避潛伏期）和游泳的速度。具體訓(xùn)練方法為：每只大鼠每天按照I～I(xiàn)V象限的順序分別從4個象限的入水點(diǎn)將大鼠放入水池中，每只大鼠的游泳時限為120 s，如果大鼠在120 s內(nèi)找到站臺并站立其上10 s，則大鼠的逃避潛伏期記錄為找到站臺的時間；若大鼠120 s內(nèi)未找到站臺，需要引導(dǎo)大鼠到站臺上站立10 s，此時逃避潛伏期記為120 s。（2）空間探索實(shí)驗：Morris水迷宮訓(xùn)練的第5天撤去水下的站臺，記錄大鼠在120 s內(nèi)穿越原站臺區(qū)的次數(shù)和在目標(biāo)象限（站臺所在象限）的時間。

3.4ELISA麻醉狀態(tài)下處死大鼠，冰上剝離DG區(qū)后研磨勻漿，破壞細(xì)胞膜后，將組織勻漿、5 000×離心10 min，取上清液。按照說明書操作檢測DG組織中的CRF水平，酶標(biāo)儀的檢測波長為450 nm。

3.5Western blot實(shí)驗海馬DG組織于冰上加入裂解液（含PMSF），充分勻漿后離心取上清液；BSA法測定蛋白濃度后進(jìn)行電泳，條件為：恒壓 70 V，3 h。轉(zhuǎn)膜條件為：4 ℃，恒壓90 V，1 h。5％的脫脂奶粉室溫封閉2 h后TBST洗3次。加入Ⅰ抗β-actin（1∶2 000）和CRFR1（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后Ⅱ抗孵育（1∶2 000）2 h；加入ECL，曝光、掃描。

3.6免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗冰上取大鼠腦組織，利用免疫組織化學(xué)染色法觀察Aβ1-42的表達(dá)情況。組織于福爾馬林固定12 h后，石蠟包埋、切片（厚度為8 μm）。各組腦片于二甲苯中脫蠟20 min，梯度乙醇中脫水5 min，抗原修復(fù)30 min，PBS沖洗后過氧化物阻斷20 min，緩沖液清洗后BSA室溫封閉20 min，滴加Aβ1-42Ⅰ抗（1∶100）孵育過夜；第2天PBS沖洗后，滴加適當(dāng)Ⅱ抗（1∶200）室溫孵育2 h；PBS沖洗后加DAB顯色10 min，蘇木素復(fù)染2 min，乙醇梯度浸泡后二甲苯透明，中性樹脂封片。

4　統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。本實(shí)驗的所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩樣本的均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本檢驗；多組樣本均數(shù)比較采用單因素或雙因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　CS對AD樣模型大鼠海馬的Aβ1-42表達(dá)的影響

應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法觀察海馬Aβ1-42表達(dá)的情況。如圖1所示，CON組大鼠海馬內(nèi)幾乎不表達(dá)Aβ1-42；而AD組大鼠海馬區(qū)可見明顯的Aβ1-42沉積，呈棕色的塊狀或點(diǎn)狀分布；AD+CS組大鼠海馬的Aβ1-42表達(dá)較少。

Figure 1.　Expression of Aβ1-42（solid arrows） in the hippocampus. The scale bar=500 μm.

2　CS對AD樣模型大鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響

Morris水迷宮定位航行實(shí)驗結(jié)果顯示，CON和AD+CS組大鼠的逃避潛伏期均隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而逐漸減少（<0.05），而AD組大鼠卻無顯著變化；與CON組比較，AD組大鼠第2～4天的逃避潛伏期均顯著延長（<0.05）；而給予4周的CS后（AD+CS組），大鼠的第2～4天的逃避潛伏期均顯著縮短（<0.05），見圖2A。此外，檢測結(jié)果還顯示，定位航行實(shí)驗期間3組大鼠每天的游泳速度無顯著差異（>0.05），見圖2B。

Figure 2.　The spatial learning ability of the rats in each group. The escape latency （A） and swimming speed （B） in place navigation trial of Morris water maze test. Mean±SEM. n=7. *P<0.05 vs CON group； #P<0.05 vs AD group； @P<0.05 vs the 1st day.

3　CS對AD樣模型大鼠空間記憶能力的影響

Morris水迷宮空間探索實(shí)驗結(jié)果如圖3所示，CON組和AD+CS組大鼠對目標(biāo)象限（原站臺所在象限，圖3A）產(chǎn)生明顯偏好，呈現(xiàn)出密集的游泳軌跡，與之不同，AD組大鼠的游泳軌跡幾乎平均分布于四個象限；與CON組比較，AD組大鼠在目標(biāo)象限停留的時間百分比（圖3B）和穿越原平臺區(qū)域次數(shù)（圖3C）均顯著減少（<0.05），而這些指標(biāo)在AD+CS組大鼠均顯著增加（<0.05）。

Figure 3.　The spatial memory ability of the rats in each group. Representative swimming traces （A）， the time in each quadrant （B） and the number of platform crossings （C） in spatial probe trial of Morris water maze test. The escape platform location is indicated by a small red circle in the III quadrant of water maze outline. Mean±SEM. n=7. *P<0.05 vs CON group； #P<0.05 vs AD group； @P<0.05 vs 25% chance level.

4　CS對AD樣模型大鼠海馬DG區(qū)CRF-CRFR1系統(tǒng)的影響

如表1所示，與CON相比，AD組大鼠海馬DG區(qū)的CRF水平顯著降低（<0.05）；與AD組相比，AD+CS組大鼠海馬DG區(qū)的CRF水平顯著升高（<0.05）。海馬DG區(qū)CRFR1表達(dá)的變化如圖4所示，與CON組相比，AD組大鼠海馬DG區(qū)CRFR1表達(dá)顯著減少（<0.05），但AD+CS組大鼠海馬DG區(qū)CRFR1表達(dá)顯著增加（<0.05）。

表1　各組大鼠海馬DG區(qū)CRF水平的變化

*<0.05CON group；#<0.05AD group.

Figure 4.　The expression of CRFR1 in the hippocampal DG region of the rats in each group. The protein level of CRFR1 was detected by Western blot. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs CON group； #P<0.05 vs AD group.

5　阻斷海馬DG區(qū)CRFR1對CS下AD樣模型大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶的影響

Morris水迷宮定位航行實(shí)驗中，與AD+CS+vehicle組大鼠相比，AD+CS+R121919組大鼠的逃避潛伏期在訓(xùn)練第1、2、4天顯著延長（<0.05），見圖5A；且各組大鼠游泳速度無顯著差異（>0.05），見圖5B；而在Morris水迷宮空間探索實(shí)驗中，與AD+CS+vehicle組大鼠比較，AD+CS+R121919組大鼠穿越原站臺次數(shù)顯著減少（<0.05），見圖5C。

Figure 5.　Effects of R121919 on the spatial learning and memory abilities of the rats in each group. The escape latency （A）， swimming speed （B） and number of platform crossings （C） in the Morris water maze test. Mean±SEM. n=6 or 8. #P<0.05 vs AD+vehicle group； &P<0.05 vs AD+CS+vehicle group； @P<0.05 vs the 1st day.

討論

經(jīng)濟(jì)社會的進(jìn)步帶來了生活成本的提高和生活節(jié)奏的加快，這使得應(yīng)激成為普遍存在的一種社會現(xiàn)象。應(yīng)激按照應(yīng)激原刺激時間的長短可分為急性應(yīng)激和CS，后者在日常生活中最為常見。為了探究CS對機(jī)體的影響機(jī)制，學(xué)者們建立了多種CS動物模型以模擬生活中人們經(jīng)受的各種生理和心理的刺激。不同于人體實(shí)驗，動物實(shí)驗可以充分的進(jìn)行多種刺激干預(yù)以及藥物干預(yù)，對探究疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律以及初步篩選治療藥物具有重要的意義。經(jīng)大量的實(shí)驗研究顯示，不可預(yù)見的應(yīng)激原刺激的方式建立的CS動物模型可較好的模擬人類的應(yīng)激刺激，因此，該模型現(xiàn)被廣泛使用于探究CS對腦高級功能的影響［11］。本課題組前期也模擬該手段，通過7種不同的應(yīng)激原（包括夾尾2 min、冰水游泳5 min、水平旋轉(zhuǎn)15 min、束縛4 h、禁食水24 h、通宵照明24 h和傾斜鼠籠24 h）刺激的方式建立了CS大鼠模型，并觀測到應(yīng)激激素分泌顯著增多等應(yīng)激指標(biāo)改變［8］，因此本研究延續(xù)使用了這種造模手段。

我國已步入老齡化社會，在眾多的腦衰老疾病譜中，癡呆癥是最主要疾患，其中AD是常見的類型。隨著不斷的研究，有學(xué)者顯示在嚙齒動物和靈長類動物的側(cè)腦室注射STZ可模擬臨床AD患者突觸功能障礙、神經(jīng)元萎縮、老年斑過度聚集和進(jìn)行性記憶損傷等病理特征［12-14］。另外，長期注射高濃度D-Gal作為基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用的衰老模型制備方法，可通過增加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)實(shí)驗動物出現(xiàn)AD樣的認(rèn)知功能損害［15］。因此，大鼠側(cè)腦室注射STZ聯(lián)合體內(nèi)長期注射高濃度D-Gal是建立原發(fā)性AD大鼠模型的常用方法之一［16］。本課題組前期利用上述方法建立AD樣大鼠模型，觀察到空間學(xué)習(xí)和記憶的損傷，以及DG內(nèi)出現(xiàn)的突觸結(jié)構(gòu)異常、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損傷和明顯Aβ沉積［7］?；诖?，本實(shí)驗依然利用上述的建模方式，觀察了CS對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。動物實(shí)驗數(shù)據(jù)顯示，CS對認(rèn)知功能的影響較為復(fù)雜，甚至出現(xiàn)相反的結(jié)果，如，CS既可以加重AD的認(rèn)知功能損傷［17］，也可以緩解Aβ沉積并改善AD小鼠的突觸功能障礙和認(rèn)知缺陷［18］，與后者研究結(jié)果類似，本實(shí)驗中CS改善了AD樣模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶損傷，而造成上述研究結(jié)果的原因可能與應(yīng)激原的種類及作用時間有關(guān)，即溫和的CS刺激，改善了AD樣模型大鼠的認(rèn)知缺陷。

CRF作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)肽類物質(zhì)，增加其釋放或應(yīng)用CRFR1受體激動劑，能夠增強(qiáng)實(shí)驗動物海馬突觸傳遞效能的長時程增強(qiáng)，促進(jìn)實(shí)驗動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力和情景記憶存儲時間等［19］，相反，抑制CRFR1活性，大鼠海馬的突觸傳遞效能顯著下降；臨床數(shù)據(jù)顯示，老年人尤其AD患者，血漿和腦脊液的CRF水平均顯著下降，患者海馬的CRF免疫反應(yīng)性神經(jīng)元顯著減少［20］，這些數(shù)據(jù)提示，海馬CRF-CRFR1系統(tǒng)參與了AD的認(rèn)知障礙，但其具體機(jī)制尚不十分清楚。因此，本研究檢測了CRF水平及DG內(nèi)CRFR1表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)AD樣模型大鼠海馬CRF含量及CRFR1表達(dá)減少，這與人類AD患者海馬組織結(jié)果相似，CS顯著提高AD樣模型大鼠DG區(qū)CRF水平，增加CRFR1表達(dá)。因此，我們推測CS增強(qiáng)了AD樣模型大鼠DG區(qū)的CRF-CRFR1系統(tǒng)活性，繼而緩解AD樣模型大鼠的空間認(rèn)知障礙。為了驗證猜想，本實(shí)驗中向AD+CS組大鼠DG內(nèi)注射CRFR1阻斷劑R121919并進(jìn)行了Morris水迷宮實(shí)驗，結(jié)果顯示，CS引起的AD樣大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用被R121919部分逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果提示，海馬CRF-CRFR1系統(tǒng)活動抑制參與損傷AD的認(rèn)知功能，CS刺激可以減輕AD樣模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷，其作用機(jī)制與增強(qiáng)了內(nèi)源性DG區(qū)CRF-CRFR1系統(tǒng)活動有關(guān)。

［1］ Salehzadeh M， Soma KK. Glucocorticoid production in the thymus and brain： immunosteroids and neurosteroids［J］. Brain Behav Immun Health， 2021， 18：100352.

［2］ Pandey GN， Rizavi HS， Bhaumik RR， et al. Increased protein and mRNA expression of corticotropin-releasing factor （CRF）， decreased CRF receptors and CRF binding protein in specific postmortem brain areas of teenage suicide subjects［J］. Psychoneuroendocrinology， 2019， 106：233-243.

［3］劉能保， 李輝， 劉向前， 等. 慢性復(fù)合應(yīng)激增強(qiáng)大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力［J］. 生理學(xué)報， 2004， 56（5）：615-619.

Liu NB， Li H， Liu XQ， et al. Chronic multiple stress enhances learning and memory capability in rats［J］. Acta Physiol Sin， 2004， 56（5）：615-619.

［4］ Hyer MM， Shaw GA， Goswamee P， et al. Chronic adolescent stress causes sustained impairment of cognitive flexibility and hippocampal synaptic strength in female rats［J］. Neurobiol Stress， 2021， 14：100303.

［5］ Mohammadi HS， Goudarzi I， Lashkarbolouki T， et al. Chronic administration of quercetin prevent spatial learning and memory deficits provoked by chronic stress in rats［J］. Behav Brain Res， 2014， 270：196-205.

［6］ Okada K， Okaichi H. Functional differentiation and cooperation among the hippocampal subregions in rats to effect spatial memory processes［J］. Behav Brain Res， 2009， 200：181-191.

［7］肖斌， 任鵬， 李明月， 等. 海馬齒狀回的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與AD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的機(jī)制［J］. 中國病理生理雜志， 2021， 37（7）：1163-1170.

Xiao B， Ren P， Li MY， et al. Endoplasmic reticulum stress in dentate gyrus is involved in spatial learning and memory impairment in rat model of Alzheimer's disease［J］. Chin J Pathophysiol， 2021， 37（7）：1163-1170.

［8］趙可， 任鵬， 李明月， 等. 慢性應(yīng)激增加大鼠海馬齒狀回的多巴胺水平并損傷空間學(xué)習(xí)記憶能力［J］. 生理學(xué)報， 2020， 72（6）：777-784.

Zhao K， Ren P， Li MY， et al. Chronic stress increases dopamine levels in hippocampal dentate gyrus and impairs spatial learning and memory in rats［J］. Acta Physiol Sin， 2020， 72（6）：777-784.

［9］ Wu J， Liu C， Zhang L， et al. Chronic restraint stress impairs cognition via modulating HDAC2 expression［J］. Transl Neurosci， 2021， 12（1）：154-163.

［10］ McAlinn HR， Reich B， Contoreggi NH， et al. Sex differences in the subcellular distribution of corticotropin releasing factor receptor 1 in the rat hippocampus following chronic immobilization stress［J］. Neuroscience， 2018， 383：98-113.

［11］ 黃攀， 王然， 王金甜， 等. 應(yīng)激動物模型的構(gòu)建與應(yīng)用［J］. 畜牧與獸醫(yī)， 2016， 48（3）：146-151.

Huang P， Wang R， Wang JT， et al. Development and application of animal stress model［J］. Anim Husb Vet Med， 2016， 48（3）：146-151.

［12］ Huang XB， Chen YJ， Chen WQ， et al. Neuroprotective effects of tenuigenin on neurobehavior， oxidative stress， and tau hyperphosphorylation induced by intracerebroventricular streptozotocin in rats［J］. Brain Circ， 2018， 4（1）：24-32.

［13］ Yeo HG， Lee Y， Jeon CY， et al. Characterization of cerebral damage in a monkey model of Alzheimer's disease induced by intracerebroventricular injection of streptozotocin［J］. J Alzheimers Dis， 2015， 46：989-1005.

［14］ Zhou M， Chen S， Peng P， et al. Dulaglutide ameliorates STZ induced AD-like impairment of learning and memory ability by modulating hyperphosphorylation of tau and NFs through GSK3β［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2019， 511（1）：154-160.

［15］ Li H， Zheng L， Chen C， et al. Brain senescence caused by elevated levels of reactive metabolite methylglyoxal on D-galactose-induced aging mice［J］. Front Neurosci， 2019， 13：1004.

［16］ Huang HC， Zheng BW， Guo Y， et al. Antioxidative and neuroprotective effects of curcumin in an Alzheimer's disease rat model co-treated with intracerebroventricular streptozotocin and subcutaneous D-galactose［J］. J Alzheimers Dis， 2016， 52（3）：899-911.

［17］ Machado A， Herrera AJ， Pablos RM， et al. Chronic stress as a risk factor for Alzheimer's disease［J］. Rev Neurosci， 2014， 25（6）：785-804.

［18］ Mattson MP， Longc VD， Harvie M. Impact of intermittent fasting on health and disease processes［J］. Ageing Res Rev， 2017， 39：46-58.

［19］ Blank T， Nijholt I， Grammatopoulos DK， et al. Corticotropin-releasing factor receptors couple to multiple G-proteins to activate diverse intracellular signaling pathways in mouse hippocampus： role in neuronal excitability and associative learning［J］. J Neurosci， 2003， 23（2）：700-707.

［20］ Davis KL， Mohs RC， Marin DB， et al. Neuropeptide abnormalities in patients with early Alzheimer disease［J］. Arch Gen Psychiatry， 1999， 56（11）：981-987.

Chronic stress attenuates spatial learning and memory impairment in a rat model of Alzheimer disease by increasing CRF expression in hippocampal dentate gyrus

XU Mingzhen， FENG Hui， LI Shenghui， QING Pei， WU Xiyue， XIAO Bin△

（，，133002，）

To observe the effects of chronic stress （CS） on corticotropin-releasing factor （CRF） and its receptor CRFR1 in the hippocampal dentate gyrus （DG） of Alzheimer disease （AD） model rats， and to explore the role of CRFR1 in the spatial learning and memory impairment of AD-like rats under CS conditions.Male Wistar rats were randomly divided into control （CON）， AD， and AD+CS groups （=7 per group）. The AD model was generateda single intracerebroventricular injection of streptozotocin combined with a daily intraperitoneal injection of D-galactose for 6 consecutive weeks. The rats in AD+CS group were randomly given one of seven different stressors daily in the last 4 weeks. The spatial learning and memory abilities of the animals were evaluated using Morris water maze test. The expression level of Aβ1-42in the hippocampus was measured by immunohistochemistry. The level of CRF in the DG was measured by ELISA. The expression of CRFR1 in the DG was determined by Western blot. The role of CRFR1 in spatial learning and memory of AD rats under CS was examinedmicroinjection of its antagonist （R121919） into the DG.Compared with CON rats， AD model animals displayed impaired spatial learning and memory capacity， as well as increased expression of Aβ1-42in the hippocampus. However， these effects were significantly attenuated by exposure to CS. Additionally， compared with CON group， the levels of CRF and CRFR1 in the DG were significantly lower in AD group （<0.05）， but these changes were significantly mitigated in AD+CS group （<0.05）. Meanwhile， the microinjection of R121919 into the DG significantly impaired the spatial learning and memory abilities of AD+CS rats （<0.05）.Chronic stress attenuates spatial learning and memory impairment in AD model rats by increasing CRF level and CRFR1 expression in the DG.

chronic stress； Alzheimer disease； corticotropin-releasing factor； hippocampal dentate gyrus； spatial learning and memory

1000-4718（2023）07-1181-07

2023-02-06

2023-06-13

0433-2435146； E-mail： xiaobin@ybu.edu.cn

R338.6； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.07.004

［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目（No. 32160195）；吉林省科技廳項目（No.YDZJ202201ZYTS255）；延邊大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目

（責(zé)任編輯：宋延君，李淑媛）