一種新發(fā)生的玉米細(xì)菌性葉腐病病原菌分離鑒定

王春明　郭成　周天旺等

關(guān)鍵詞 玉米；細(xì)菌性病害；短小芽胞桿菌；分離鑒定；16SrDNA;gyrB

中圖分類號(hào)：S 435.131 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2022445

玉米Zea mays由于其產(chǎn)量高，品質(zhì)好，適應(yīng)性強(qiáng)，不僅被作為重要的糧飼兼用型作物，而且被作為重要的工業(yè)原料等在生產(chǎn)中加以利用，在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用口]。隨著玉米種植面積增加、新品種引進(jìn)、氣候條件變化及多年連作等，玉米病害的發(fā)生日漸嚴(yán)重，已成為制約玉米產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一[2]。據(jù)報(bào)道，每年因病害造成的玉米產(chǎn)量損失在一些省份可達(dá)到10%～15%，大發(fā)生時(shí)甚至超過30%[3]。玉米細(xì)菌性病害在局部地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，給當(dāng)?shù)赜衩咨a(chǎn)造成了不同程度的損失[4-9]。種子和病殘?bào)w帶菌是玉米細(xì)菌性病害傳播的主要途徑，加之細(xì)菌具有繁殖速度快的特點(diǎn)，一旦在田間發(fā)生，如未及時(shí)采取相應(yīng)的防治措施，可能對(duì)大田和制種田造成毀滅性的損失[10]。

甘肅省作為我國玉米主產(chǎn)區(qū)之一，玉米已成為第一大糧食作物。據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計(jì)顯示，至2020年甘肅省玉米種植面積已達(dá)到100萬hm，其中制種面積常年穩(wěn)定在10萬hm左右[11]。玉米病害已成為影響甘肅省玉米產(chǎn)量的重要因素。據(jù)調(diào)查，近年來一些玉米細(xì)菌性葉斑病在甘肅河西和隴中部分地區(qū)有逐年上升的趨勢(shì)，對(duì)玉米生產(chǎn)產(chǎn)生了一定的影響。2021年7月，在白銀市景泰縣條山農(nóng)場玉米種植區(qū)，出現(xiàn)一種新的玉米細(xì)菌性葉部病害，為了明確引發(fā)該病害的致病菌，本研究從發(fā)病玉米葉片中分離菌株，從形態(tài)學(xué)觀察、致病性測(cè)定、生理生化測(cè)定、16SrDNA和gyrB基因序列分析等方面進(jìn)行鑒定，為玉米葉部細(xì)菌性病害的流行規(guī)律及綜合防治提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1病樣采集及病原菌分離純化

于2021年7月在甘肅省白銀市景泰縣條山農(nóng)場普通玉米種植區(qū)不同玉米田塊，隨機(jī)采集玉米葉腐病病樣共計(jì)15份。參考方中達(dá)[12]的方法對(duì)病原菌進(jìn)行分離和純化。

1.2煙草過敏性試驗(yàn)

將分離菌株在NA培養(yǎng)基（蛋白胨5.0 g，牛肉浸膏3.0 g，酵母粉1.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0）上劃線培養(yǎng)36 h后，分別刮下菌苔配成濃度為1×10 cfu/mL的菌懸液，用無菌注射器將菌懸液注射到6～8葉齡煙草葉片背面，以注射滅菌水為對(duì)照，室內(nèi)套袋保濕，觀察有無枯斑產(chǎn)生。

1.3病原菌致病性測(cè)定及再分離

玉米種子（品種為‘先玉335’）用75%乙醇表面消毒30 min后，用無菌水沖洗5遍，于35℃培養(yǎng)箱催芽。待胚芽長1cm左右時(shí)種植于裝有滅菌蛭石的花盆中，每盆種植7株，3次重復(fù)，置于室溫下正常管理。待玉米長到4～6葉期，將培養(yǎng)36 h的分離菌分別刮下菌苔配制成1×10 cfu／mL的菌懸液（加少量吐溫- 20）分別噴霧接種于玉米葉片上，對(duì)照接NA培養(yǎng)液，套袋保濕培養(yǎng)24 h后，揭開塑料袋繼續(xù)正常管理，逐天觀察發(fā)病情況。對(duì)發(fā)病葉片上的病原進(jìn)行再分離鑒定，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.4病原菌鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化測(cè)定

將病原細(xì)菌在NA平板上劃線培養(yǎng)，參照《植病研究方法》[12]，觀察菌落形態(tài)、生長速度和產(chǎn)生色素情況。采用革蘭氏染色法，在100倍油鏡下觀察和測(cè)量病原細(xì)菌菌體大小、形狀及產(chǎn)生芽胞情況。生理生化指標(biāo)測(cè)定參照文獻(xiàn)[12-14]的方法進(jìn)行。

1.4.2病原菌16S rDNA和gyrB基因序列測(cè)定與分析

用天根生化科技（北京）有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取代表性菌株B1-0和B2-1的全基因組DNA，選擇細(xì)菌16S rDNA通用引物27F／1492R[15]和gyrB引物UPl／UP2r[16]，參考荊卓瓊等[17]和程勛輝[18]的方法對(duì)B2-0和B2-1的16SrDNA和gyrB序列分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)完成后，取3μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將特異性條帶亮度好、純度高且無非特異性條帶的PCR產(chǎn)物冷凍條件下送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上用BLAST進(jìn)行同源性比較，下載短小芽胞桿菌Bacil-lus pumilus標(biāo)準(zhǔn)菌株及近緣種和外群菌株的目的序列，采用ClustalX 2.0.10軟件進(jìn)行多序列比對(duì)后，利用Bioedit 5.0.6軟件進(jìn)行校正，用MEGA7.0軟件以NJ法構(gòu)建基于16S rDNA和gyrB序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1田間發(fā)生情況調(diào)查及病樣分離純化結(jié)果

2021年7月，在甘肅省白銀市景泰縣玉米田中新發(fā)病害發(fā)生較為嚴(yán)重，田間病株率22.5%，表現(xiàn)為初期葉片產(chǎn)生不規(guī)則褪綠斑塊（圖1a，1b），病斑不受葉脈限制（圖1c），后期病部連片，葉肉組織腐爛，裂開（圖1d，1e）。發(fā)病嚴(yán)重的引起心葉卷曲，變褐腐爛（圖1f，1g）。觀察發(fā)現(xiàn)植株莖稈及根部正常。經(jīng)對(duì)不同發(fā)病形狀的病斑進(jìn)行分離均得到比較單一的1種菌落。挑取代表性菌株B1-0和B2-1進(jìn)行致病性測(cè)定。

2.2致病性測(cè)定結(jié)果

將菌株B1-0和B2-1回接到玉米葉片24 h后開始顯癥，初期葉片產(chǎn)生褪綠小斑塊（圖2a），隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展，3d后病斑逐漸連片形成褪綠長斑塊，形狀不固定，且不受葉脈限制（圖2b）。后期如濕度增加，發(fā)病葉片變褐腐爛（圖2c）。接種Bl-0和B2-1的發(fā)病率均為100%，發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相似，而對(duì)照葉片均未發(fā)病。對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行再次分離得到與接種病原菌相同的分離物，符合柯赫氏法則。

2.3對(duì)煙草致病性測(cè)定結(jié)果

菌株Bl-0和B2-1接種煙草葉片24 h后開始顯癥，隨后進(jìn)一步發(fā)展形成黃色枯斑（圖2d）。

2.4病原菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征

菌株在NA培養(yǎng)基上菌落為白色、圓形、隆起，表面光滑，不透明，邊緣整齊（圖3a）。培養(yǎng)24～48 h后在100倍油鏡下觀察顯示，菌體短桿狀，大?。?.53～0.71》μm×（1.62～2.93） μm;革蘭氏染色陽性，芽胞中生（圖3b），故從形態(tài)學(xué)初步判斷其屬于芽胞桿菌Bacillus sp.。

2.5生理生化特性測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），該病原菌需氧，能運(yùn)動(dòng)，能使明膠液化，在5% NaCl中可生長，不能水解淀粉，能利用檸檬酸鹽，接觸酶陽性，甲基紅試驗(yàn)陰性，能使馬鈴薯腐爛，能利用D-甘露醇、麥芽糖和葡萄糖、不能利用甘油和肌醇，在4℃和40℃條件下均能生長。結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特性初步將其鑒定為短小芽胞桿菌B.pumilus。

2.6病原菌16S rDNA和gyrB基因序列分析

將測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast相似性分析，菌株B1-0和B2-1的16S rDNA序列與短小芽胞桿菌B.pumilus同源性最高，相似性均在99%以上，且與登錄號(hào)為MT065817.1、MT065814.1、MI102721.1、MT102722.1、MT102723.1、MT197380.1和MT065805.1的短小芽胞桿菌B.pumilus相似性達(dá)100.00%；gyrB基因序列與登錄號(hào)為GU568184.1、KF194241.1、HM585095.1和MF784845.1的短小芽胞桿菌B.pumilus相似性均在99.00%以上。在GenBank中下載短小芽胞桿菌B.pumilus標(biāo)準(zhǔn)菌株及其近緣種和外群菌株的目的基因序列，比對(duì)后拼接，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于16S rDNA和gyrB的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），B1-0和B2-1與短小芽胞桿菌B.pumilus （ATCC7061、BKS1-108、AUEC29、BP-hd-1、NMTD17和17）聚在一個(gè)分支。說明菌株Bl-0和B2-1與短小芽胞桿菌B.pumilus遺傳距離更近，結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定將其確定為短小芽胞桿菌B.pumilus。

3結(jié)論與討論

目前國內(nèi)外報(bào)道的引起玉米葉部病害的病原細(xì)菌主要有須芒草伯克霍爾德氏菌Burkholderia an-dropogonis（異名高梁假單胞菌Pseudomonas an-dropogonis）[14，19]、燕麥?zhǔn)人峋帑渷喎NAcidovorax avenae subsp. avenae[4，20]、斯氏泛菌Pantoea stew-artii[19-20]、菠蘿泛菌P.ananatis[5，21-22]、野油菜黃單胞菌絨毛草致病變種Xanthomonas campestrzs pv.holcicola E23]、丁香假單胞菌丁香致病變種P.syrin-gae pv. syringaeE23-24]、巨大芽胞桿菌Bacillus megaterium [25]等，分別可引起玉米葉片條紋病、葉疫病、枯萎病、葉斑病、褐斑病等，但未見短小芽胞桿菌能引起玉米葉部病害的報(bào)道。

短小芽胞桿菌作為芽胞桿菌屬Bacillus的一種細(xì)菌，被作為生防菌在國內(nèi)外研究居多。于婷等[26]篩選出一株短小芽胞桿菌對(duì)鐮刀菌有較強(qiáng)的抑制作用；Agarwal等[27]研究結(jié)果顯示短小芽胞桿菌MSUA3對(duì)供試的尖鐮孢Fusarium oxysporum和立枯絲核菌Rhizoctonia solani抑制效果強(qiáng)；柳自清等[28]研究表明短小芽胞桿菌B102對(duì)棉花枯萎病具有較好的防治效果；馮永新等[29]發(fā)現(xiàn)短小芽胞桿菌AR03與噻菌銅聯(lián)合復(fù)配后能增強(qiáng)對(duì)煙草青枯病的防效。同時(shí)查閱文獻(xiàn)可知，其作為植物病原菌的相關(guān)報(bào)道也在不斷增多，如有研究表明該病原菌能引起幼齡桃Prunus persica細(xì)菌性斑疹病[30]、芒果Mangifera indica枯萎病[31]、菜豆Phaseolus vul-garis葉片褐斑病[32]、馬鈴薯Solanum tuberosum貯藏期塊莖軟腐病[33]、生姜Zingiber of icinale根腐病[34]，且侵染歐洲松樹Pinus的莖和枝干造成發(fā)病部位變黃、枝干枯萎，針葉脫落等[35]，還能引起甜瓜Cucumis melo果腐病[36]、雅榕Ficus concinna果腐病[37]和橡皮樹Ficus elastica枝干凸起病等[38]；曹慧英等[39]2010年研究發(fā)現(xiàn)該病原菌能引起玉米細(xì)菌性莖腐病，其典型癥狀為莖基處開裂，變黑、變褐并出現(xiàn)干腐。本研究在田間發(fā)現(xiàn)的玉米細(xì)菌性病害，發(fā)病玉米葉片可產(chǎn)生不同大小的不受葉脈限制的不規(guī)則褪綠斑塊，隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展出現(xiàn)葉片開裂、腐爛等癥狀，發(fā)病嚴(yán)重的植株心葉卷曲、腐爛，無法抽出，嚴(yán)重影響后期玉米的生長發(fā)育。挖出發(fā)病植株觀察發(fā)現(xiàn)，植株莖基部及根部均正常，未出現(xiàn)變褐、開裂等癥狀，這與曹慧英等[39]的研究存在差異。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定、16S rDNA及gyrB基因序列測(cè)定結(jié)果，菌株B1-0和B2-1與短小芽胞桿菌相似度最高，且在基于16S rDNA和gyrB的系統(tǒng)發(fā)育樹上與短小芽胞桿菌（ATCC 7061、BKS1-108、AUEC29、BP-hd-1、NMTD17和17）聚在一個(gè)分支，故將其鑒定為短小芽胞桿菌。但本研究獲得的菌株在生理生化特性上與已報(bào)道的短小芽胞桿菌菌株存在一定的差異，如Song等[36]研究報(bào)道稱短小芽胞桿菌不能使明膠液化，而本研究結(jié)果顯示供試菌株均能使明膠液化；曹慧英等[39]研究表明短小芽胞桿菌能水解淀粉，能利用甘露醇，不能利用葡萄糖，而本研究結(jié)果表明供試菌株不能水解淀粉，不能利用甘露醇、能利用葡萄糖。分析產(chǎn)生這種差異的原因主要可能與其來源及生長環(huán)境等存在一定的差異相關(guān)，使得不同來源的同種病原菌即使在相同的培養(yǎng)基和相同的培養(yǎng)條件下，在生理生化特性方面也呈現(xiàn)差異。

傅俊范等[2]對(duì)玉米葉部病害流行成災(zāi)的原因分析發(fā)現(xiàn)，隨著栽培制度和品種抗病性的改變、田間病原菌積累以及一些極端天氣導(dǎo)致田間小氣候更適宜病害發(fā)生，是玉米葉部病害流行成災(zāi)的根本原因。玉米細(xì)菌性病害的發(fā)生除與品種的抗病性有關(guān)外，還與環(huán)境溫度和濕度條件有較大的關(guān)系，一般溫暖多雨有利于細(xì)菌性病害的發(fā)生。對(duì)比2021年5月至7月上旬白銀市景泰縣的天氣情況，降雨量較往年有所增加，氣溫略低，更適宜細(xì)菌性病害的發(fā)生，因此導(dǎo)致細(xì)菌性葉腐病在該地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重。查閱國內(nèi)外報(bào)道的玉米細(xì)菌性葉部病害文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)玉米細(xì)菌性葉部病害的報(bào)道多停留在病害發(fā)生癥狀和病原菌的鑒定上，而對(duì)其發(fā)病規(guī)律、傳播途徑、品種抗性及綜合防治等發(fā)面的系統(tǒng)研究較少，因此有待于后期進(jìn)一步的研究。

本研究通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)測(cè)定、16S rDNA和gyrB基因序列分析和致病性測(cè)定等研究，明確了引起甘肅省白銀市景泰縣玉米田一種細(xì)菌性葉腐病的病原菌為短小芽胞桿菌B.pumi-lus，該研究結(jié)果可為該病害的發(fā)生流行和綜合防治提供參考。