貴州魔芋軟腐病菌多基因分子鑒定及其致病力分析

黃露　周兵正　安星宇等

關(guān)鍵詞 魔芋；軟腐??；病原鑒定；致病力

中圖分類號(hào)：S 436.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022328

魔芋Amorph，ophallus konjac是天南星科的一種多年生草本植物，主要分布在中國(guó)、日本及東南亞等國(guó)家和地區(qū)，其塊莖富含葡甘聚糖，被廣泛用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是貴州省的特色產(chǎn)業(yè)之一[1-2]。隨著魔芋大面積規(guī)?；N植，病害發(fā)生也越來(lái)越重，其中魔芋軟腐病是魔芋生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害，可造成產(chǎn)量損失30%～50%，甚至絕收[3]。魔芋軟腐病普遍發(fā)生于貴州魔芋種植區(qū)，已成為限制貴州魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。

魔芋軟腐病是由果膠桿菌Pectobacterium和迪基氏菌Dickeya等引起的細(xì)菌性病害，有學(xué)者認(rèn)為其致病菌為胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種Erwinia carotovora subsp.carotovora[4-5]，修建華等通過(guò)16S- 23S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)分析，將魔芋軟腐病菌分為胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種、菊歐文氏菌Erwinia chrysanthemi及一株未能確定的菌株[6]。吳金平認(rèn)為我國(guó)魔芋軟腐病的病原菌主要為胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種和菊歐文氏菌，同時(shí)分離到一株新的引起軟腐病的細(xì)菌一腸桿菌屬細(xì)菌En-terobacter sp.[7]。盧美歡等發(fā)現(xiàn)陜南地區(qū)魔芋軟腐病的病原菌為胡蘿卜果膠桿菌Pectobacterium ca-rotovorum[8]。孫苗苗研究發(fā)現(xiàn)引起湖北省魔芋軟腐病的主要為海芋果膠桿菌Pectobacteriumaroidearum和方中達(dá)迪基氏菌Dickeya fang-zhongdai[9]。魏環(huán)宇等發(fā)現(xiàn)云南省珠芽魔芋軟腐病的病原菌為海芋果膠桿菌[10-11]。而對(duì)貴州魔芋軟腐病菌的研究，僅有本研究組前期發(fā)現(xiàn)黔東南魔芋軟腐病菌為菊歐文氏菌E.chrysanthe-mi[12]。目前貴州省內(nèi)許多地區(qū)引起軟腐病的病原菌種類和分布仍不清晰，本研究采集貴州省主要魔芋種植基地的軟腐病樣，進(jìn)行病菌的分離鑒定及致病力分析，明確貴州魔芋軟腐病菌種類、致病力及分布特點(diǎn)，旨在為魔芋軟腐病的防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料和培養(yǎng)基

從貴州省威寧、水城、赫章、雷山等魔芋種植地采集發(fā)生軟腐病的魔芋塊莖、葉柄，裝進(jìn)采樣袋中，標(biāo)記采集信息，帶回試驗(yàn)室備用。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10g/L，牛肉膏粉5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂12g/L。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：蛋白胨10g/L，牛肉膏粉3g/L，氯化鈉5g/L。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌分離

采用平板劃線法分離病原菌[13-14]。病樣用75%乙醇表面消毒2 min，在無(wú)菌條件下挑取魔芋病樣病健交界部分的小塊組織，轉(zhuǎn)移到含0.5 mL無(wú)菌生理鹽水（0.85%NaCl）的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用滅菌玻璃棒將病組織搗碎，無(wú)菌條件下室溫靜置10～15 min，形成細(xì)菌懸浮液。用滅菌的移植環(huán)蘸取少量汁液在NA平板上劃線，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接純化1～2次后，4℃和—80℃保存。

1.2.2病原菌的分子鑒定

1.2.2.1病原菌DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA，參考Bing等和Waleron等的方法[15-16]，選用icdA、mdh、mtlD、proA、rpoS基因的引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（25μL）：2×Taq PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH20 9.5μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30s，退火溫度下退火30s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將有清晰條帶的樣品送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序。

1.2.2.2單基因和多基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測(cè)序獲得的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。采用BioEdit軟件對(duì)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的可信度較高的相似序列進(jìn)行多序列比對(duì)，基于icdA，mdh，mtlD，proA和rpoS 5個(gè)管家基因單個(gè)基因及多基因，用MEGA 6.0軟件鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和聚類分析。

1.2.3病原菌的致病力測(cè)定

分離的病原菌于NB培養(yǎng)液中，28℃，180 r／min培養(yǎng)24 h，配制成濃度1×10 cfu/mL的菌懸液，吸取2μL接種于用75%乙醇消毒的健康魔芋塊莖（40 mm×40 mm）中央處，以無(wú)菌水為對(duì)照，2次重復(fù)，放于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后觀察發(fā)病情況，根據(jù)病斑的長(zhǎng)度評(píng)價(jià)病菌的致病力，用Excel和DPS 7.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法（α=0.05）進(jìn)行差異顯著性分析。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：病斑長(zhǎng)度>30 mm為高致?。╤ighly pathogenic level，H）；10mm<病斑長(zhǎng)度≤30 mm為中等致病力（moderately pathogenic level，M）；病斑長(zhǎng)度≤10 mm為低致病力（lowly pathogenic level，L），

2結(jié)果與分析

2.1魔芋軟腐病原菌分離

通過(guò)對(duì)貴州赫章、威寧、雷山、平壩、息烽、花溪、荔波、關(guān)嶺、水城等魔芋種植地的軟腐病進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)植株于展葉期染病，葉柄頂部及基部首先出現(xiàn)濕潤(rùn)狀暗綠色或黑色小斑（圖1a），后整個(gè)葉柄潰爛，植株倒伏，散發(fā)惡臭味；植株基部或塊莖染病時(shí)，早期葉片仍保持綠色，后整株逐漸變黃、干枯、倒伏，地下塊莖呈灰色或黑灰色腐爛，并散發(fā)惡臭味（圖1b～c）。對(duì)采集的各魔芋軟腐病樣進(jìn)行病原菌分離、純化，共獲得47株菌株，回接魔芋塊莖后都造成塊莖腐爛，但不同菌株對(duì)魔芋塊莖的致病程度不同（圖1d～f）。

2.2單基因序列分析

以分離的魔芋軟腐病菌基因組總DNA為模板，分別進(jìn)行icdA、mdh、mtlD、proA、rpoS等5個(gè)管家基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序，并分別構(gòu)建單基因系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)不同基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)軟腐病菌的鑒定結(jié)果有一定的差異，但所有菌株經(jīng)鑒定均分屬于為海芋果膠桿菌Pectobacterium aroidea-rum、胡蘿卜果膠桿菌Pectobacterium carotovoorum或方中達(dá)迪基氏菌Dickeya fangzhongdai 3個(gè)種，其中根據(jù)mdh，mtlD，proA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果基本一致，而采用icdA和rpoS基因時(shí)，菌株GZCC.20047、GZCC.20049和GZCC.20053鑒定結(jié)果有差異。基于icdA基因，GZCC.20049菌株與P.carotovorum聚為一支，GZCC.20053單獨(dú)聚為一支；基于rpoS基因，菌株GZCC. 20047、GZCC.20053與P.aroidearum聚為一支（圖2）。

2.3多位點(diǎn)序列分析

將分離的魔芋軟腐病菌基因組的5個(gè)管家基因片段進(jìn)行拼接、比對(duì)分析并構(gòu)建多基因聯(lián)合序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。發(fā)現(xiàn)47個(gè)菌株有的聚在同個(gè)類群，有的則聚在不同類群，其中GZCC.20001、GZCC. 20003、GZCC. 20004等33個(gè)菌株與Pectobacterium aroidearum聚在同一個(gè)分支，同源性較高，均屬于P.aroidearum；GZCC.20039菌株與Pectobacterium carotovorum聚類在同一個(gè)分支，屬于P.carotovorum；而GZCC. 20002、GZCC. 20010、GZCC. 20011等13個(gè)菌株與Dickeya fangzhongdai聚類在同一個(gè)分支，為D.fangzhongdai。

2.4魔芋軟腐病菌致病力測(cè)定

通過(guò)對(duì)魔芋軟腐病菌進(jìn)行致病力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同軟腐菌株的致病力有一定的差異。其中菌株GZCC. 20022、23、24、25、26、43、47、48、49和52號(hào)菌株具有強(qiáng)致病力，病斑直徑達(dá)40 mm；GZCC. 20003、4、5、7、8、12號(hào)菌株致病力較弱，病斑直徑在5. 7～9.8 mm；其余菌株的致病稍弱，病斑在10.5～28.5 mm間（表2）。

2.5貴州魔芋軟腐病菌分布情況

通過(guò)對(duì)貴州魔芋軟腐病病原菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)病菌分為3個(gè)種Pectobacterium aroidearum、P.ca-rotovorum和Dickeya fangzhongdai，其中P.aroidearum為貴州魔芋軟腐病主要病原菌，約占分離菌株數(shù)的70%，廣泛分布在多個(gè)地區(qū)；其次為D.fangzhongdai，占28%，也普遍存在于貴州魔芋種植區(qū)；P.carotovorum僅在息烽縣魔芋種植地分離到1株，占2%。

3結(jié)論與討論

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，近20年來(lái)，軟腐病菌的分類發(fā)生很大的變化。1998年，歐文氏菌屬Erwinia spp.有了重大修訂，其許多種被歸到果膠桿菌屬Pectobacterium[17-18]，隨后在2005年P(guān)ecto-bacterium chrysanthemi被劃定到新屬迪基氏菌屬Dicke ya[19-20]中。目前Pectobacterium屬包括19個(gè)種，分別為獼猴桃果膠桿菌P.actinidiae，水生果膠桿菌P.aquaticum，海芋果膠桿菌P.aroidearum，黑莖果膠桿菌P.atrosepticum，甜菜果膠桿菌P.betavasculorum，巴西果膠桿菌P.brasiliense，仙人掌果膠桿菌P.cacticidum，胡蘿卜果膠桿菌P.ca-rotovorum，泉水果膠桿菌P.fontis，氣味果膠桿菌P.oderiferum，帕蒙蒂埃果膠桿菌P.parmentieri，微小果膠桿菌P.parvum，秘魯果膠桿菌P.peruvi-ense，北極星果膠桿菌P.polare，波蘭果膠桿菌P.polonicum，旁遮普果膠桿菌P.punjabense，廣泛果膠桿菌P.versatile，山葵果膠桿菌P.wasabiae和馬蹄蓮果膠桿菌P.zantedeschiae；而Dickeya屬有12個(gè)種，分別為菊迪基氏菌D. chrysanthemi，達(dá)旦迪基氏菌D.dadantii（subsp.dadantii and subsp.dieffenbachiae），石竹迪基氏菌D.dianthicola，玉米迪基氏菌D.zeae，水稻迪基氏菌D.oryzae，玉米迪基氏菌D.parazeae，茄迪基氏菌D.solani，方中達(dá)迪基氏菌D.fangzhongdai，水生迪基氏菌D.aquatica，湖泊迪基氏菌D.lacustris，水棲迪基氏菌D.undicola和喜禾本迪基氏菌D.poaceiphilan[18]。

本研究通過(guò)建立單基因和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)貴州魔芋軟腐病病原菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)貴州魔芋軟腐病病原菌具有一定的多樣性，包括海芋果膠桿菌P.aroidearum、胡蘿卜果膠桿菌P.carotovorum和方中達(dá)迪基氏菌D.fangzhongdai 3個(gè)種，但一些菌株的單基因鑒定結(jié)果與多基因聯(lián)合鑒定結(jié)果有一定差異，由于P.aroidearum、P.carotovorum和D.fangzhongdai 3個(gè)種比較相似，在歷史分類地位上也常把其歸為一類[17-19，21]。僅通過(guò)單個(gè)基因?qū)ζ溥M(jìn)行分類鑒定有一定的局限性，而采用多基因和全基因測(cè)序?qū)ζ滂b定的準(zhǔn)確性更好。本研究發(fā)現(xiàn)P.aroidearum為魔芋軟腐病菌的主要種，廣泛分布于貴州多個(gè)魔芋種植區(qū)，其菌株間致病力差異較大，低、中、高致病力菌株都有，而D.fangzhongdai菌株間差異較小，僅有中、高致病力菌株。

海芋果膠桿菌P.aroidearum在2013年被認(rèn)定主要危害單子葉植物，但不僅限于單子葉植物的軟腐病菌新種[22]，近年來(lái)相繼被報(bào)道危害馬鈴薯、西葫蘆、白菜、魔芋、萵苣、辣椒、馬蹄蓮、胡蘿卜、合果芋、甘蔗等作物[18，21，23-32]。對(duì)于魔芋軟腐病的病原菌，以前報(bào)道多是胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種Pecto-bacterium carotovora subsp.carotovora（P.carotovo-rum）和菊歐文氏菌Erwinia chrysanthemi （Dickeya sp.），但近年來(lái)通過(guò)全基因組及多基因序列分析，發(fā)現(xiàn)一些P.carotovorum其實(shí)是P.aroidearum，例如從陜西魔芋軟腐樣品中分離到一株細(xì)菌M8為P.aroidearum[21，33]，魏環(huán)宇等發(fā)現(xiàn)云南省珠芽魔芋軟腐病的致病菌也為P.aroidearum[10-11]。

本研究基于貴州魔芋軟腐病菌種類不清的情況，確定了貴州魔芋軟腐病菌的主要種類、致病力及分布情況，明確P.aroidearum、D.fangzhongdai是貴州魔芋軟腐病的主要病菌，為魔芋軟腐病的發(fā)生流行和科學(xué)防控提供了科學(xué)依據(jù)。