木霉生物合成納米銅條件優(yōu)化及其對甜瓜枯萎病防效的研究

崔曉慧　鐘震　姚薇等

關(guān)鍵詞 木霉； 納米銅； 合成優(yōu)化； 尖鐮孢； 抑菌作用

中圖分類號： Ｓ４３６．５ 文獻標識碼： Ａ DOI： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２１８８

納米技術(shù)作為一門多學(xué)科交叉的創(chuàng)新技術(shù)和最具發(fā)展前景的新興技術(shù)，已經(jīng)在電子、醫(yī)藥、國防和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。金屬納米粒子因其高表面積／體積、高導(dǎo)熱（電）性和高催化性能等優(yōu)異的物理和化學(xué)性質(zhì)而備受關(guān)注［１］。過去幾十年，關(guān)于金屬納米粒子制備方法（物理法、化學(xué)法和生物法）一直是研究熱點，其中生物法因其方法簡便、生產(chǎn)成本低和環(huán)境友好而被廣泛關(guān)注［２３］。目前植物［４］和微生物［５］及其提取物可作為封端劑和還原劑用于納米材料的生物合成。與植物和細菌相比，絲狀真菌能夠產(chǎn)生可還原金屬離子和穩(wěn)定金屬納米粒子的有機物質(zhì)，使納米粒子具有更好的生物相容性［６］。木霉Trichoderma是重要的植物病害生防菌，同時也用來生產(chǎn)工業(yè)酶和抗生素［７］，在工農(nóng)業(yè)中發(fā)揮著重要的作用。木霉容易在實驗室和工廠內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)，對培養(yǎng)條件要求不高、生產(chǎn)成本低，因此被廣泛用來生產(chǎn)金屬納米粒子［８１２］。納米粒子合成的速率取決于金屬離子的濃度、還原劑的類型、ｐＨ、溫度和反應(yīng)時間［１３１５］。納米銅粒子（Ｃｕ-ＮＰｓ）合成過程中，Ｃｕ（Ⅱ）被微生物代謝產(chǎn)生的各種還原性物質(zhì)還原為Ｃｕ（０）。納米銅粒子與空氣接觸容易在其表層形成ＣｕＯ-ＮＰｓ或ＣｕＯ-ＮＰｓ［１６１７］，而微生物代謝產(chǎn)生的大分子物質(zhì)可以作為封端劑或穩(wěn)定劑，防止粒子聚集，增加粒子的穩(wěn)定性［１８］，在一定程度上能夠避免Ｃｕ-ＮＰｓ氧化為ＣｕＯ-ＮＰｓ或ＣｕＯ-ＮＰｓ［１６］。生物合成的納米銅相比于其他金屬納米粒子（納米銀或納米金）生產(chǎn)成本低且具有獨特性能。此外，雖然銅氧化物納米粒子在熱力學(xué)上比納米銅粒子更穩(wěn)定，但其可能會影響納米粒子的其他性能，故其應(yīng)用受到一定限制［１９］。納米銅對莖點霉Phoma destructiva、鏈格孢Alternaria alternata、彎孢菌Curvularia lunata和尖鐮孢Fusarium oxysporum都具有良好的抗菌活性，能夠抑制其菌絲的生長［２０］。另外，高表面積的納米材料能夠有效地保留養(yǎng)分，可以不斷為植物提供養(yǎng)分，同時也可以改善化學(xué)農(nóng)藥的溶解性和分散性，提高農(nóng)藥的有效性［２１２２］。因此納米銅具有較高的抗菌活性［２３］，可以抑制真菌［２０］和細菌的［２４］生長，濃度越高，殺菌效果越好。

近年來，隨著我國設(shè)施栽培的發(fā)展，甜瓜種植面積不斷擴大，由尖鐮孢引起的甜瓜枯萎病發(fā)生日趨加重，發(fā)病率高達５０％～７０％［２５］，造成甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)下降［２６］。目前農(nóng)業(yè)上仍采用化學(xué)農(nóng)藥防治枯萎病，但化學(xué)農(nóng)藥容易造成瓜果品質(zhì)下降、污染環(huán)境和病原菌產(chǎn)生抗藥性［２７］。因此，環(huán)境友好型且不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性的生物殺菌劑是未來生防制劑的發(fā)展方向。本研究以木霉發(fā)酵液為還原劑和穩(wěn)定劑合成Ｃｕ-ＮＰｓ，通過ＵＶ-ｖｉｓ光譜表征探究不同合成條件對木霉合成Ｃｕ-ＮＰｓ的影響，以期明確木霉合成Ｃｕ-ＮＰｓ的最適條件。同時研究Ｃｕ-ＮＰｓ對尖鐮孢的抑菌活性和對甜瓜枯萎病的防效，為開發(fā)農(nóng)用新型藥劑及木霉和納米銅綜合防控甜瓜枯萎病奠定理論基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１試驗菌種

長枝木霉Trichoderma longibrachiatum分離于柞樹根系，保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實驗室。尖鐮孢Fusarium oxysporum分離于發(fā)病甜瓜根系，保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物免疫研究所。甜瓜種子‘紅城５號’購買于苗壯農(nóng)資公司。

１．１．２培養(yǎng)基

ＰＤＡ培養(yǎng)基：土豆２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，瓊脂１５～２０ｇ，蒸餾水１０００ｍＬ。ＰＤＢ培養(yǎng)基：ＰＤＡ 培養(yǎng)基中不加入瓊脂。

１．２試驗方法

１．２．１納米銅的生物合成

木霉在ＰＤＡ 培養(yǎng)基上活化后，在菌落邊緣打取菌餅轉(zhuǎn)入ＰＤＢ培養(yǎng)基，于轉(zhuǎn)速１２０ｒ／ｍｉｎ，２８℃下培養(yǎng)３～４ｄ，使用無菌Ｗｈａｔｍａｎ１號濾紙過濾并收集發(fā)酵液。每１００ｍＬ發(fā)酵液加５００μＬＣｕＳＯ，避光條件下靜置反應(yīng)２４ｈ，?。常恚谭磻?yīng)液于紫外可見光分光光度計中進行全波長（２００～８００ｎｍ）掃描，綜合分析Ｃｕ-ＮＰｓ合成的條件。然后１００００ｒ／ｍｉｎ，離心３０ｍｉｎ收集Ｃｕ-ＮＰｓ，無菌水洗滌２次，７５％乙醇洗滌１次，自然陰干，稱重后備用。

１．２．２納米銅合成條件的優(yōu)化

１．２．２．１底物ＣｕＳＯ 濃度對合成納米銅的影響

設(shè)置１００ｍＬ反應(yīng)液中ＣｕＳＯ 的終濃度分別為５．０、１０．０、１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ，于３５℃，ｐＨ＝７，避光條件下靜置反應(yīng)２４ｈ，分析反應(yīng)液中ＣｕＳＯ 濃度對Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影響。

１．２．２．２ ｐＨ 對合成納米銅的影響

根據(jù)１．２．２．１的試驗結(jié)果，ＣｕＳＯ 濃度設(shè)置為１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ，反應(yīng)液的ｐＨ 用１ｍｏｌ／Ｌ ＨＳＯ 和１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ 分別調(diào)整為５、７、９、１１，于３５℃，避光條件下靜置反應(yīng)２４ｈ，分析ｐＨ 對ＣｕＮＰｓ合成的影響。

１．２．２．３溫度對合成納米銅的影響

根據(jù)１．２．２．１和１．２．２．２的試驗結(jié)果，將反應(yīng)液ｐＨ 設(shè)為７，ＣｕＳＯ４ 濃度設(shè)為１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ，分別于３５、４５、５５、６５℃，避光條件下靜置反應(yīng)２４ｈ，分析溫度對Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影響。

１．２．３納米銅粒子的表征分析

透射電子顯微鏡（ＴＥＭ）觀察：將納米銅水溶液加到覆有碳膜的銅網(wǎng)上，室溫干燥，使用透射電子顯微鏡（ＨＴ７７００，日本）在１００．０ｋＶ 下觀察金屬納米粒子的形狀和尺寸。

Ｘ射線衍射（ＸＲＤ）觀察：在４０ｋＶ 的電壓下，以ＣｕＫα１為輻射源，在２θ角為２０°～９０°范圍內(nèi)掃描，用Ｘ射線衍射儀（ＸＰｅｒｔＰｒｏ ＭＰＤ，荷蘭）分析合成的納米銅粒子的晶體結(jié)構(gòu)。

傅立葉紅外光譜儀（ＦＴＩＲ）檢測：納米銅粒子以干燥粉末形式與ＫＢｒ混合，壓片后暴露于紅外，波數(shù)范圍從４００～４０００ｃｍ－１對其進行傅里葉變換紅外光譜（ＦＴＩＲ，Ｎｉｃｏｌｅｔｎｅｘｕｓ４１０，美國）表征檢測。

１．２．４納米銅對尖鐮孢的抑制作用

將納米銅用無菌水配制成１００００ｍｇ／Ｌ的金屬納米粒子溶液，經(jīng)過超聲充分溶解后，加入到ＰＤＡ培養(yǎng)基中，使最終濃度為２００ｍｇ／Ｌ。接入尖鐮孢菌餅，２８℃倒置培養(yǎng)７ｄ，測量菌落直徑，每處理３個重復(fù)。用血球計數(shù)法計數(shù)每皿中尖鐮孢的產(chǎn)孢量［２８］，每處理３個重復(fù)。

１．２．５Ｃｕ-ＮＰｓ對甜瓜枯萎病的防效

利用蘸根法接種尖鐮孢，當(dāng)甜瓜幼苗高度約８～１０ｃｍ 時，將甜瓜根部劃傷浸于濃度約為１×１０６個／ｍＬ的孢子懸浮液中，１５ｍｉｎ后轉(zhuǎn)移至質(zhì)量濃度為０、５０、１００ｍｇ／Ｌ和２００ｍｇ／Ｌ的Ｃｕ-ＮＰｓ水溶液中２８℃下培養(yǎng)，５ｄ后觀察并記錄感病情況。另設(shè)無菌水浸泡根部劃傷的甜瓜幼苗，并一直在水中培養(yǎng)為空白對照。每處理２０株幼苗，３次重復(fù)。按照曲明星等［２９］的方法計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

１．３數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用Ｅｘｃｅｌ２０１６進行初步整理、分析，用ＳＰＳＳ２１．０進行單因素方差分析（Ｏｎｅ-ｗａｙＡＮＯ-ＶＡ），用Ｄｕｎｃａｎ氏新復(fù)極差法進行多重比較，犘＜０．０５（０．０１）表示差異（極）顯著。

２結(jié)果與分析

２．１納米銅合成條件的優(yōu)化

木霉發(fā)酵液與ＣｕＳＯ 溶液混合后，銅離子被還原為納米銅粒子將會發(fā)生顏色變化，溶液顏色由橙黃色變?yōu)樽鼐G色，紫外可見光譜分析結(jié)果顯示，不同反應(yīng)條件下獲得的Ｃｕ-ＮＰｓ的最大吸光度出現(xiàn)在３２５～４２５ｎｍ 之間（圖１），說明Ｃｕ-ＮＰｓ能夠在不同反應(yīng)條件下合成，其最大吸收峰出現(xiàn)的位置不同，說明Ｃｕ-ＮＰｓ粒子的大小不同。一般認為吸收峰藍移，納米粒子粒徑變小［３０］。納米粒子的粒徑越小其抗菌活性越大［１３］。納米粒子吸收峰越高說明合成的納米粒子的量越大［３１］。因此，我們在分析Ｃｕ-ＮＰｓ合成條件中將綜合這些指標來確定其較優(yōu)的合成條件。

底物ＣｕＳＯ濃度對木霉發(fā)酵液合成ＣｕＮＰｓ的影響見圖１ａ。３種濃度下都可合成ＣｕＮＰｓ，但隨著底物濃度增加峰值逐漸增高，說明Ｃｕ-ＮＰｓ的合成量增加。在底物濃度為１５ｍｍｏｌ／Ｌ時，吸收峰發(fā)生藍移，說明Ｃｕ-ＮＰｓ的粒徑變小，因此，１５ｍｍｏｌ／Ｌ是合成納米銅的最適濃度。溫度對Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影響見圖１ｂ。當(dāng)溫度較高時會影響Ｃｕ-ＮＰｓ的合成。３５℃時，紫外吸收峰的峰值較高，且Ｃｕ-ＮＰｓ的特征吸收峰發(fā)生藍移，合成的Ｃｕ-ＮＰｓ粒徑較小，因此，３５℃是生物合成納米銅的最適溫度。溶液ｐＨ對Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影響見圖１ｃ。強酸或強堿條件都不利于納米銅粒子的合成。中性條件下形成的峰較窄，ｐＨ９時形成的峰較寬，形成窄峰說明粒徑較為均一且粒徑較小，形成寬峰說明粒徑分布不均且粒徑較大，故ｐＨ７為納米銅合成的最適ｐＨ 條件。

２．２納米銅粒子的表征分析

為進一步明確合成的納米銅的形狀和大小，利用ＴＥＭ 對合成的Ｃｕ-ＮＰｓ進行表征分析（圖２）。結(jié)果表明，合成的納米銅多為球形或偽球形，分散性較好。優(yōu)化前Ｃｕ-ＮＰｓ的平均粒徑約７．８５ｎｍ，優(yōu)化后的平均粒徑約２．４５ｎｍ，說明優(yōu)化后Ｃｕ-ＮＰｓ粒徑變小。

Ｘ射線衍射（ＸＲＤ）分析Ｃｕ-ＮＰｓ的結(jié)晶特性表明，２θ角在２０°～８０°之間出現(xiàn)３個強特征衍射峰，對應(yīng)的２θ值分別為４３．４１°、５０．６５°、７４．６０°，與銅Ｘ 射線衍射卡（ＰＤＦ＃０４ ０８３６）標準圖譜吻合，分別對應(yīng)著（１１１）（２００）（２２０）３個晶面，表明Ｃｕ-ＮＰｓ結(jié)構(gòu)是面心立方結(jié)構(gòu)（圖３）。

ＦＴＩＲ分析能夠說明在Ｃｕ-ＮＰｓ合成和穩(wěn)定化中有生物大分子的參與。ＣｕＮＰｓ的ＦＴＩＲ分析（圖３）表明，在３３７９．７０、１６０５．２８、１４０４．３１、１０７８．８３、６１４．７４ｃｍ處出現(xiàn)紅外光譜吸收帶，其中３３７９．７０ｃｍ吸收峰為酚類和醇類的ＯＨ 的伸縮振動，１６０５．２８ｃｍ是由Ｃ＝Ｏ 化合物的羰基伸縮振動引起的特征峰，１４０４．３１ｃｍ是Ｃ-Ｎ 伸縮振動，１０７８．８３ｃｍ處是Ｃ-Ｏ 伸縮振動，６１４．７４ｃｍ是Ｃ-Ｃ 伸縮振動。由此可推測，木霉的某些代謝物在納米銅粒子合成過程中起還原作用，同時也可能起到穩(wěn)定納米銅粒子的作用。

２．３納米銅對尖鐮孢的抑制作用

長枝木霉合成的Ｃｕ-ＮＰｓ對尖鐮孢有明顯的抑制作用。由圖４可以看出Ｃｕ-ＮＰｓ影響了尖鐮孢菌落的生長，雖然菌落的直徑?jīng)]有顯著改變，但菌絲稀疏，菌落厚度較薄，產(chǎn)生的分生孢子少。對產(chǎn)孢量計數(shù)發(fā)現(xiàn)，Ｃｕ-ＮＰｓ顯著抑制尖鐮孢產(chǎn)孢，對照組產(chǎn)孢量為１．８８×１０個／ｍＬ，而Ｃｕ-ＮＰｓ處理的產(chǎn)孢量僅為為８．７３×１０個／ｍＬ。由此可以看出，Ｃｕ-ＮＰｓ能夠抑制尖鐮孢菌絲的生長，降低了菌絲量和產(chǎn)孢量。

２．４納米銅對甜瓜枯萎病的防效

接種尖鐮孢后，使用不同濃度的Ｃｕ-ＮＰｓ處理甜瓜苗，調(diào)查甜瓜幼苗的發(fā)病情況（表１）。結(jié)果表明，Ｃｕ-ＮＰｓ能夠降低甜瓜枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)。Ｃｕ-ＮＰｓ的濃度在５０ｍｇ／Ｌ時，甜瓜的發(fā)病率為８６．６７％，病情指數(shù)為６３．３３，隨著Ｃｕ-ＮＰｓ濃度的增加，發(fā)病率和病情指數(shù)逐漸降低，當(dāng)濃度為２００ｍｇ／Ｌ時，發(fā)病率降低為５３．３３％，病情指數(shù)降低為３３．３３。由此說明，Ｃｕ-ＮＰｓ能夠有效緩解甜瓜枯萎病的發(fā)病程度。

３結(jié)論與討論

納米技術(shù)在保障糧食安全生產(chǎn)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。納米材料可以用于肥料促進作物生長，提高產(chǎn)量；用于殺蟲（菌）劑實現(xiàn)病蟲害管理；用于傳感器監(jiān)測土壤質(zhì)量和植物健康［３２］。納米材料合成過程中涉及多種化學(xué)品和雜質(zhì)，可能會帶入到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料中，從而對農(nóng)業(yè)系統(tǒng)造成負面影響［３３］，因此，選擇低成本、環(huán)境友好的生物合成方法是必要的，也是未來納米技術(shù)發(fā)展的方向［３４］。本研究選用絲狀真菌—長枝木霉生物合成納米銅，發(fā)現(xiàn)長枝木霉能夠有效合成納米銅，合成的Ｃｕ-ＮＰｓ在３２５～４２５ｎｍ處出現(xiàn)特征吸收峰［３５］，較優(yōu)的合成條件是ＣｕＳＯ 濃度為１５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７、溫度３５℃。合成的Ｃｕ-ＮＰｓ多呈球形或偽球形，為面心立方結(jié)構(gòu)，平均粒徑為２．４５ｎｍ，其表面有多種官能團。納米銅合成后反應(yīng)液的顏色由橙黃色轉(zhuǎn)變?yōu)樽鼐G色，顏色的變化是由于納米粒子溶液中的自由電子被激發(fā)，通過與光波共振的Ｃｕ-ＮＰｓ電子振動組合形成表面等離子體共振吸收（ＳＰＲ）帶［３６］，從而證實了納米銅的合成［３７］。優(yōu)化后合成的Ｃｕ-ＮＰｓ粒子經(jīng)ＸＲＤ 分析有（１１１）（２００）（２２０）３個晶面，這與Ｖｉｅｔ等［３８］的研究結(jié)果一致。ＦＴＩＲ分析表明，木霉代謝產(chǎn)物中游離胺或半胱氨酸等基團與ＮＰｓ結(jié)合，起到穩(wěn)定納米粒子的作用［３９］。

納米銅的生物合成受到多種因素的影響，其中ＣｕＳＯ 濃度、反應(yīng)溫度和ｐＨ 是人們常研究的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，隨著銅離子濃度增大，金屬納米粒子的合成量逐漸增大，超過一定濃度反而下降［４０］，我們的研究結(jié)果基本與之相同，較高濃度的ＣｕＳＯ有利于納米銅的合成，１５ｍｍｏｌ／Ｌ比較適合納米銅合成。ｐＨ 能夠影響金屬納米粒子的形狀和大小，納米銅的合成中，中性條件更有利于其合成［４１］，我們的研究結(jié)果與其一致。合成溫度影響ＣｕＮＰｓ質(zhì)量和產(chǎn)量，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高能夠提高納米銅的合成量，但溫度過高反而降低合成量，這可能是溫度過高，生物大分子的活性降低或被降解造成的［４０］。我們研究發(fā)現(xiàn)，３５℃是合成納米銅的最佳溫度，與Ｅｌ-Ｓａａｄｏｎｙ等［４０］的研究結(jié)果一致。因此，底物濃度，溶液ｐＨ 和合成溫度均影響納米粒子的合成，且導(dǎo)致合成的納米粒子粒徑不同。另外，在優(yōu)化納米銅合成條件的過程中，也要考慮合成納米銅的抗菌活性，通過綜合評價納米銅產(chǎn)量及其抗菌活性來選擇合成方法。有研究表明，納米銅和納米銅前體［琥珀酸銅（Ⅱ）］的抗菌活性是有差異的［４２］，因此有可能合成Ｃｕ-ＮＰｓ和Ｃｕ-ＯＮＰｓ的混合物具有更高的抗菌活性，當(dāng)然這些還需進一步設(shè)計試驗來驗證。

已有研究表明，納米銅對莖點霉、鏈格孢、彎孢菌和尖鐮孢等植物病原真菌都具有抗菌活性［２０］，能夠抑制這些真菌的生長，我們的研究結(jié)果與其基本一致，納米銅能夠抑制尖鐮孢菌絲生長，導(dǎo)致菌落稀疏、菌絲纖細，造成產(chǎn)孢量顯著減少。Ｒｕｂｉｎａ等［４３］的研究發(fā)現(xiàn)，納米銅對絲核菌犚．狊狅犾犪狀犻也產(chǎn)生同樣的效果，產(chǎn)孢量明顯減少。納米銅對甜瓜枯萎病的防效表明，納米銅能夠降低甜瓜枯萎病的發(fā)生和病情指數(shù)，說明納米銅可用于植物真菌病害的防治，但由于目前還缺乏系統(tǒng)性研究，造成納米銅還未真正在病害防治中應(yīng)用。因此，在系統(tǒng)研究提高納米銅抗真菌活性的同時，應(yīng)加強其在病害防治上的研究，以加速其在農(nóng)業(yè)病害防治上的應(yīng)用，同時還應(yīng)該研究納米銅是否對甜瓜生長產(chǎn)生影響，分析納米銅的生物安全性。