宮頸癌患者血清miRNA-34a表達(dá)水平研究

鐘銀雪，劉宓，陳海星，陳學(xué)書，李覓

（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550004）

宮頸癌是世界上第二常見的婦科腫瘤。在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌的發(fā)病率遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國(guó)家，病例數(shù)占世界宮頸癌總數(shù)的80%［1］。近年來，隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們性觀念、生活習(xí)慣的改變，發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，發(fā)病率逐年上升［2］。高危型人類乳頭狀瘤病毒（highrisk human papillomavirus,HR-HPV）持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因。其中HPV E6，E7 致癌蛋白在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。宮頸癌時(shí)，HPV 病毒感染人體，HPV 基因組整合到宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)HPV-E6 蛋白表達(dá)。E6 蛋白靶向結(jié)合P53 基因，通過泛素蛋白酶途徑降解P53，導(dǎo)致P53 有效性降低，P53 失活導(dǎo)致可與miR-34a 結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)區(qū)域的蛋白數(shù)量的減少，從而下調(diào)大多數(shù)被HPV 感染的組織中miR-34a 的表達(dá)。進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、使G1 期阻滯、DNA 修復(fù)和凋亡的蛋白失活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［3］。

miR-34 家族（miR-34s）是一組高度保守的miRNA 家族，廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物、線蟲綱動(dòng)物及哺乳動(dòng)物中。人源miR-34 家族包括miR-34a、miR-34b、miR-3c［4］。其中miR-34a 是miRNA 家族中一類高度保守的非編碼RNA，也是一種抑癌基因，它可通過靶定多種周期及凋亡相關(guān)蛋白mRNA 的3＇UTR 區(qū)而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，使這些蛋白的mRNA 降解，細(xì)胞周期不向S 期轉(zhuǎn)換，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的發(fā)生。反之如果miR-34a 表達(dá)降低，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，凋亡抑制，最終形成腫瘤［5］。WANG 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，HPV 能通過E6 癌基因直接和間接地影響miR-34a 使其表達(dá)下調(diào)。相反沉默宮頸癌細(xì)胞系E6 后，p53 和miR-34a 表達(dá)增多。有研究報(bào)道，miR-34a 表達(dá)從宮頸上皮內(nèi)瘤變到宮頸癌逐漸下調(diào)，低的miR-34a 水平可能與病毒的整合、E6 蛋白的表達(dá)及P53 缺失有關(guān)［7］。

很多研究表明miR-34a 不僅在宮頸癌中表達(dá)異常，在多種癌癥包括肺癌及結(jié)直腸癌中也有異常表達(dá)。趙艷爭(zhēng)［8］發(fā)現(xiàn)，miR-34a 在肺癌患者血清中的表達(dá)水平明顯上調(diào)；OKADA 等［9］發(fā)現(xiàn)miR-34a 可抑制抑癌基因p53 負(fù)調(diào)節(jié)因子HDM4 表達(dá)，進(jìn)而作用于p53 和miR-34a 形成的正反饋環(huán)，抑制肺癌進(jìn)展。雒亞蒙等［10］發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者的血清miR-34a 基因表達(dá)水平較結(jié)腸腺瘤性息肉組和健康對(duì)照組顯著降低。趙春娟等［11］發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者的血清miR-34a 基因表達(dá)水平較前列腺增生組和健康對(duì)照組顯著降低。從上述研究中可以發(fā)現(xiàn)，miR-34a 在不同腫瘤中表達(dá)趨勢(shì)并不相同，在同一腫瘤不同疾病期，表達(dá)水平也存在差異。因此，這提示miR-34a 在各腫瘤中的致病機(jī)制可能并不相同。

本研究組之前通過分析HPV 感染宮頸癌患者宮頸細(xì)胞miR-34a 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，HPV 陽性宮頸癌患者miR-34a 表達(dá)水平較宮頸炎和健康人群明顯升高，提示miR-34a 可能做為觀察宮頸癌發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)［12］。相較于宮頸細(xì)胞樣本，血清樣本更易獲得，但血清miR-34a 來源于全身各組織和器官，宮頸癌時(shí)其表達(dá)水平是否與宮頸細(xì)胞一致，值得探討；不同腫瘤時(shí)，血清miR-34a 水平變化趨勢(shì)是否一致，也值得研究。

因此，研究擬通過檢測(cè)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院宮頸癌患者血清miR-34a 的水平，探討血清miR-34a 水平在宮頸癌中的可能變化；并與肺癌、結(jié)直腸癌以及健康人群血清miR-34a 水平進(jìn)行比較，分析各組血清miR-34a 表達(dá)水平的變化趨勢(shì)，探討血清miR-34a 可能具有的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020 年10 月至2021 年3 月在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的宮頸癌患者20 例（年齡23～67 歲），并納入同期健康體檢人群20 例（年齡21～77 歲）作為健康對(duì)照組，另納入確診的肺癌（年齡48～83 歲）和結(jié)直腸癌（31～80 歲）患者各20 例作為疾病對(duì)照。宮頸癌患者、肺癌患者、結(jié)直腸癌患者均依據(jù)臨床病理結(jié)果進(jìn)行診斷，所有納入研究的患者入院前均未接受任何治療。本研究通過了貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（倫理審批號(hào)：SL-20205088）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

TAKARA RNAiso for Small RNA、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis 和 SYBR Green qRT-PCR試劑（日本寶生生物技術(shù)有限公司）。miR-34a 特異性引物（易錦生物有限公司）、異丙醇、75%乙醇、RNase-free 水等。ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）、BIOER Life Express 基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）、離心機(jī)。

1.3 miR-34a 的檢測(cè)方法

血清總RNA 提?。翰捎么倌婵詹裳懿杉? 組人員靜脈血5 mL 3 000 rpm 離心10 min，吸取血清于無RNA 酶的EP 管中，標(biāo)記好患者姓名，保存于-20℃冰箱備用。取500 μL 的血清加入1 000 μL 的RNAiso for Small RNA 后混勻室溫靜置5 min，12 000 g 4℃離心5 min，將600 μL 上清液移到新的1.5 mL tube 管中，加入200 μL 氯仿震蕩混勻靜置5 min，12 000 g 4℃離心15 min，將250 μL 上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇靜置10 min 12 000 g 4℃離心10 min，棄上清，向沉淀中加入1 mL 的75% 乙醇12 000 g 4℃離心5 min，棄上清保留，沉淀室溫干燥后加入20 μL 去離子水（ddH2O）。

逆轉(zhuǎn)錄PCR：采用TAKARA Mir-XTMmiRNA First-Strand 試劑將所提總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：mRNA Buffer（2X）5 μL，RNA sample（0.25～8 μg）3.75 μL，mRQ Enzyme 1.25 μL，反應(yīng)總體積10 μL。反應(yīng)條件：37℃ 1 h，85℃ 5 min。

定量PCR：qRT-PCR 反應(yīng)體系：miR-34a 樣本組：ddH2O 9 μL，SYBR Advantage qPCR Premix（2X）12.5 μL，ROX Reference Dye（50X）0.5 μL，miRNA-specific primer（10 μmol/L）0.5 μL，mRQ 3'Primer 0.5 μL，cDNA 2.0 μL。反應(yīng)總體積為25 μL。U6 對(duì)照組：ddH2O 9 μL，SYBR Advantage qPCR Premix（2X）12.5 μL，ROX Reference Dye（50X）0.5 μL，U6 Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，U6 Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL。反應(yīng)條件：95℃ 10 s、qRT-PCR 95℃ 5 s、60℃ 20 s 重復(fù)40 個(gè)循環(huán)，95℃ 60 s、55℃ 30 s、95℃ 30 s 重復(fù)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR SYBR GreenⅠ法檢測(cè)miR-34a，以U-6 為內(nèi)參基因，反應(yīng)結(jié)束后軟件自動(dòng)生成熒光定量值動(dòng)態(tài)曲線，并分析顯示結(jié)果及循環(huán)閾值（Ct）。

1.4 分析方法

2-ΔΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量，其反映的是實(shí)驗(yàn)組基因與對(duì)照組的倍數(shù)關(guān)系，使用U6 作為內(nèi)參基因。2-ΔΔCt=2-［（實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因循環(huán)數(shù)-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因循環(huán)數(shù)）-（對(duì)照組目標(biāo)基因循環(huán)數(shù)-對(duì)照組內(nèi)參基因循環(huán)數(shù)）］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 6 繪制圖表。Kolmogorov-Smirnova檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（P25,P75）表示，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組基本情況統(tǒng)計(jì)分析

宮頸癌患者、肺癌患者、結(jié)直腸癌患者及健康對(duì)照組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=41.175,P=0.254），見表1。

表1 研究對(duì)象的基本情況（n=20）

2.2 各組血清miR-34a 表達(dá)水平

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，宮頸癌組miR-34a 表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（40.2 倍，Z=-2.948,P=0.003）；肺癌組miR-34a 表達(dá)上升（Z=-1.921,P=0.055），結(jié)直腸癌組表達(dá)下降，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.407,P=0.684）。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，與結(jié)直腸癌組和肺部組相比，宮頸癌組miR-34a 表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（25.4 倍，P=0.005；93.4 倍，P＜0.001）。見圖1、圖2、表2。

圖1 癌癥組與健康對(duì)照組血清miR-34a 表達(dá)水平比較

圖2 癌癥組間血清miR-34a 表達(dá)水平比較

表2 各組血清miR-34a 表達(dá)水平比較

3 討論

做為miR-34 家族中的一員，miR-34a 在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及細(xì)胞代謝等方面發(fā)揮著重要作用。它是抑癌基因p53 的直接作用因子，激活p53 后miR-34a 表達(dá)明顯上升，進(jìn)而起到抑制腫瘤的作用［13］。有研究顯示，宮頸癌E6 異常表達(dá)會(huì)抑制p53 表達(dá)，進(jìn)而抑制miR-34a 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［14］。多項(xiàng)研究均證實(shí)宮頸癌組織及癌細(xì)胞中miR-34a 表達(dá)降低［15］，但本課題組在之前的工作中，得到了與上述研究相反的結(jié)果［12］：課題組通過收集HPV 陽性宮頸癌患者的宮頸細(xì)胞樣本，采用qRT-PCR 檢測(cè)了4 種與E6/E7 相關(guān)的miRNA（miR-9、miR-21、miR-27b、miR-34a），發(fā)現(xiàn)miR-34a 表達(dá)與正常對(duì)照組和宮頸上皮內(nèi)瘤樣變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）組相比均明顯升高（2.987 倍,P=0.002；2.930 倍,0.010）（見圖3）。該研究結(jié)果提示，miR-34a 在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能通過多種機(jī)制發(fā)揮作用。目前關(guān)于miRNA-34a 在宮頸癌發(fā)生早期中的具體機(jī)制尚不完全清楚，而其在宮頸癌及癌前病變中的表達(dá)爭(zhēng)議也增加了研究的必要性，為完善其相關(guān)機(jī)制提供了可能性［16］。

圖3 宮頸脫落細(xì)胞miR-34a 在宮頸癌和CIN 時(shí)的表達(dá)

本研究通過收集宮頸癌患者血清，檢測(cè)其miR-34a 的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，宮頸癌患者miR-34a 表達(dá)明顯升高（40.2 倍,P=0.003），與本課題組之前的研究結(jié)論相符，但與大部分研究結(jié)論相反。聶小鳳等［3］研究表明，宮頸脫落細(xì)胞中，miR-34a 在宮頸癌和高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變中的表達(dá)水平顯著低于它們?cè)谡m頸及低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變中的表達(dá)，且miRNA 34a 值隨著宮頸病變加重逐漸降低。舒慧敏等［17］研究也表明，miR-34a 在宮頸癌組織中表達(dá)降低，且在CIN組織表達(dá)也明顯降低，并指出miR-34a 表達(dá)下降發(fā)生在CIN 早期，甚至是在宮頸組織發(fā)生形態(tài)學(xué)改變之前。盡管大多數(shù)研究表明miR-34a 在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，但RIBEIRO 等［18］的研究與本研究相同，他們通過檢測(cè)患者的宮頸細(xì)胞顯示，miR-34a 的表達(dá)水平與未感染人群相比呈現(xiàn)明顯增高，考慮可能因?yàn)椴《靖腥臼沟眉?xì)胞修復(fù)機(jī)制被激活，導(dǎo)致P53 通路激活進(jìn)而誘導(dǎo)miR-34a 的表達(dá)。與舒慧敏等一樣，有研究人員認(rèn)為，miR-34a表達(dá)受抑，是宮頸癌發(fā)展過程中的一個(gè)早期事件。隨著疾病發(fā)展，一些其它通路可能被激活，參與到疾病的發(fā)生發(fā)展中導(dǎo)致miR-34a 表達(dá)水平的升高［7］。本次研究結(jié)果也再次提示，miR-34a 可能通過多種機(jī)制在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

多項(xiàng)研究顯示，除了宮頸癌以外，miR-34a 還在多腫瘤中表達(dá)異常，且不同腫瘤miR-34a 的變化趨勢(shì)并不一致，大多數(shù)腫瘤表達(dá)下降包括前列腺癌，結(jié)直腸癌，乳腺癌等，而肺癌時(shí)多研究顯示表達(dá)上升。卞俊杰等［19］研究表明，與健康對(duì)照組相比，非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-34a 表達(dá)升高，并指出miR-34a 的含量與非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤負(fù)荷強(qiáng)度有關(guān)。雒亞蒙等［10］研究表明結(jié)腸癌患者的血清miR-34a 基因表達(dá)水平較結(jié)腸腺瘤性息肉組和健康對(duì)照組顯著降低。趙春娟等［11］用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)血清中miR-34a 的基因表達(dá)水平前列腺癌，發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者的血清miR-34a 基因表達(dá)水平較前列腺增生組和健康對(duì)照組顯著降低IORIO 等［20］研究表明miR-34a 在乳腺癌的表達(dá)明顯低于正常乳腺組織。為了解宮頸癌患者miR-34a 的表達(dá)與其它腫瘤是否存在差異，本研究選擇了中國(guó)人群發(fā)病率最高的肺癌和發(fā)病率第三的結(jié)直腸癌做為疾病對(duì)照組進(jìn)行了研究［21］。研究顯示：與肺癌和結(jié)直腸癌患者相比，宮頸癌患者血清miR-34a 表達(dá)明顯升高（84.8 倍，P=0.005；25.4 倍，P＜0.001）。這提示，血清miR-34a 可能做為一個(gè)宮頸癌診斷的生物標(biāo)志，值得進(jìn)一步研究。本次研究也發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，肺癌患者血miR-34a 表達(dá)上升，結(jié)直腸癌患者血清miR-34a 表達(dá)下降，與其它研究的miR-34a 表達(dá)變化趨勢(shì)一致，但差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與本次研究的標(biāo)本量較小有關(guān)，未來需要增加樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。通過分析肺癌及結(jié)直腸癌以及宮頸癌患者血清miR-34a 的表達(dá)水平也可發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤其表達(dá)變化趨勢(shì)并不相同，這進(jìn)一步證實(shí)miR-34a 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著非常復(fù)雜的作用，可能存在多個(gè)靶點(diǎn)。腫瘤不同，病程不同，其激活機(jī)制亦不相同。

綜上所述，相較與健康人群以及肺癌和結(jié)直腸癌患者，宮頸癌患者血清miR-34a 表達(dá)明顯升高，提示miR-34a 可能做為宮頸癌診斷的生物學(xué)指標(biāo)志來進(jìn)行深入研究；血清miR-34a 的表達(dá)水平和肺癌變化趨勢(shì)一致，與結(jié)直腸癌相反，提示miR-34a 在不同腫瘤中可能通過不同的機(jī)制發(fā)揮作用，值得進(jìn)一步探討。本次研究樣本量較小，可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，未來將通過大樣本量研究，對(duì)本次結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。