1 317例高危孕婦胎兒產(chǎn)前分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析

馬麗爽 霍平 張萍萍 楚偉 王向靜 高健

胎兒染色體核型分析作為產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常的經(jīng)典細(xì)胞遺傳學(xué)方法,可檢出染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常,但對小于5 Mb的拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)卻無法識別,而CNVs是許多發(fā)育障礙的重要遺傳原因[1],染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)中的單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)(single nucleotide polymorphism array, SNP-Array)已被認(rèn)為是智障或多種先天性異?；颊叩氖走x檢測方案[2],其不僅能識別非整倍體、三倍體和單親二倍體,還能識別小于5 Mb的CNVs,但其對染色體結(jié)構(gòu)異常和低比例嵌合卻不及核型分析能穩(wěn)定檢出[3],SNP-Array技術(shù)可補(bǔ)充核型分析,提高了胎兒染色體異常檢出率,對于預(yù)防和控制出生缺陷是有效的[4-5]。本文回顧性分析1 317例具有產(chǎn)前診斷指征的高危孕婦胎兒行G顯帶核型分析聯(lián)合SNP-Array技術(shù),分析其染色體結(jié)果及妊娠結(jié)局,以探討其診斷價值。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析2018年8月至2020年5月因具有高齡、血清學(xué)篩查高風(fēng)險、不良孕史、超聲異常、夫婦染色體異常等產(chǎn)前診斷指征的1 317例高危孕婦,血清學(xué)篩查分為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測和唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查,超聲異常分為超聲軟指標(biāo)陽性、超聲結(jié)構(gòu)異常、生長受限和羊水量異常,超聲軟指標(biāo)包括腦室擴(kuò)張、顱后窩池擴(kuò)張、脈絡(luò)叢囊腫、頸部透明層(nuchal translucency, NT)、頸后皮膚皺褶(nuchal fold, NF)、鼻骨發(fā)育不良、小腦發(fā)育不良、心內(nèi)強(qiáng)回聲灶、強(qiáng)回聲腸管、胸腔積液、輕度腎盂擴(kuò)張、膽囊增大、胃泡顯示不清或偏小、長骨短、單臍動脈、臍帶囊腫[6]。為排除其他指標(biāo)干擾,特研究孤立性指標(biāo),以探討其臨床價值。孕婦及家屬簽署知情同意書后行介入性產(chǎn)前診斷穿刺術(shù),取羊水或臍帶血行SNP-array檢測和G顯帶核型分析,孕婦年齡17～48周歲,平均(30.5±5.5)周歲;孕周17～34周,平均(22.7±4.5)周。

二、方法

1.介入性產(chǎn)前診斷穿刺術(shù):因高齡、血清學(xué)高危、超聲異常、不良孕史、夫婦染色體異常等之一或多項產(chǎn)前診斷指征的孕婦均行核型及SNP-array檢測,孕17～24周行羊膜腔穿刺術(shù),取羊水20 mL行G顯帶核型分析,10 mL行SNP-array檢測;孕25周以后孕婦行臍帶血穿刺術(shù)1 mL行G顯帶核型分析,0.5 mL行SNP-array檢測。

2.G顯帶核型分析:常規(guī)37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)羊水5～6 d換液、隔天觀察、擇時收獲、制片、G顯帶;37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)臍帶血72 h、收獲、制片、G顯帶,核型分析依據(jù)2016年染色體核型分析命名體制(International System for Human Cytogenetic Nomenclature, ISCN),常規(guī)細(xì)胞計數(shù)20個,如為嵌合核型計數(shù)100個,分析5個分散良好的染色體核型。核型異常指染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常,不含多態(tài)性。

3.SNP-array檢測:采用Affymetrix Cytoscan 750K Array(美國Affymetrix公司)進(jìn)行全基因組芯片檢測,提取DNA、片段化、標(biāo)記信號、雜交及掃描,芯片儀讀取數(shù)據(jù)應(yīng)用ChAS4.0軟件分析結(jié)果。依據(jù)CNVs位置、大小、DGV數(shù)據(jù)庫、ISCA數(shù)據(jù)庫、Decipher數(shù)據(jù)庫、Clingen數(shù)據(jù)庫報道等將結(jié)果分為致病性變異、可能致病變異、臨床意義不明、可能良性變異、良性變異。SNP-Array異常指致病性變異、可能致病性變異、臨床意義不明。

4.妊娠結(jié)局的隨訪:對所有孕婦分娩后4～6個月進(jìn)行電話隨訪,了解妊娠結(jié)局和新生兒生長發(fā)育情況,針對染色體異常而選擇分娩的嬰兒于1歲左右進(jìn)行追蹤隨訪。

5.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件,組間比較采用卡方檢驗、Fisher確切概率法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、核型與SNP-Array檢測結(jié)果

在1 317例胎兒染色體中,核型多態(tài)性44例(3.3%,44/1 317),核型異常152例(152/1 317,11.5%),SNP-Array異常241例(241/1 317,18.3%),兩種檢測比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。152例核型異常中21-三體42例、18-三體10例(包括1例超雌)、13-三體3例、特納12例、超雌12例(包括1例18-三體)、克氏17例、超雄10例、48,XXYY 1例、易位22例(包括1例倒位)、增加6例、缺失5例、衍生4例、倒位3例(包括1例易位)、額外標(biāo)記染色體2例、重復(fù)1例、插入1例、其他2例。241例SNP-Array檢測異常中致病性變異146例、可能致病性變異42例、臨床意義不明53例,其中重復(fù)56例(片段206～82 900 kb)、缺失79例(片段104～53 900 kb)、雜合性丟失18例(片段3 100～32 630 kb)。

核型異常152例(152/1 317,11.5%),SNP-Array異常241例(241/1 317,18.3%)。兩種檢測聯(lián)合應(yīng)用染色體異常270例(270/1 317,20.5%),與核型異常檢出率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

核型與SNP-Array均異常123例(123/1 317,9.3%),其中致病性變異109例、可能致病性變異12例、臨床意義不明2例,其中重復(fù)11例(片段3 420～82 900 kb),缺失18例(片段725～53 900 kb);核型正常中SNP-Array異常110例(110/1 121,9.8%),其中致病性變異35例、可能致病性變異28例、臨床意義不明47例,其中重復(fù)42例(片段206～23 300 kb),缺失55例(片段104～12 070 kb),雜合性丟失18例(片段3 100～32 630 kb);SNP-Array正常中核型異常31例(31/1 076,2.9%),其中小于5%低比例嵌合3例,額外標(biāo)記染色體1例,附加、易位、倒位、衍生、插入等27例。

二、核型與SNP-Array結(jié)果不符情況

1 121例核型正常胎兒中SNP-Array異常110例;1 076例SNP-Array正常胎兒中核型異常31例;123例兩種檢測均異常胎兒中結(jié)果不符4例,病例1核型為45,XN,der(13;14)(q10;q10),SNP-Array結(jié)果為1q21.1q21.2缺失;病例2核型為46,XN,13q?,SNP-Array結(jié)果為22q11.21q11.21缺失1.084Mb;病例3核型為46,XN,add(8)(p23)pat,SNP-Array結(jié)果為8p23.3p23.1缺失8.68Mb,足月順產(chǎn),隨訪至11個月發(fā)育未見異常;病例4核型為46,XN,add(21)(p13),SNP-Array結(jié)果為22q13.1q13.33重復(fù)。產(chǎn)前診斷指征與核型、CNVs相關(guān)性。

剔除其他高危因素,孤立性產(chǎn)前診斷指標(biāo)中無創(chuàng)高危組核型與SNP-Array異常率最高。合并兩類指標(biāo)中,高齡僅合并無創(chuàng)高危組的胎兒核型及SNP-Array異常率最高。見表1。

表1 產(chǎn)前診斷指征與核型、CNVs相關(guān)性分析[例(%)]

三、孕齡與核型、CNVs相關(guān)性

依據(jù)孕婦年齡分組,相關(guān)分析顯示,21-三體發(fā)生率與年齡之間Pearson相關(guān)性(系數(shù)=0.901),顯著性(雙側(cè),系數(shù)=0.037)。進(jìn)一步采用一元線性回歸分析,年齡為自變量,21-三體發(fā)生率為因變量,系數(shù)=0.950,R2=0.902,F=37.007,P=0.004,說明21-三體發(fā)生率與年齡呈正相關(guān),但年齡分組中CNVs與年齡沒有相關(guān)性,見表2。

四、不良孕史與核型、CNVs相關(guān)性

剔除其他高危因素,將不良孕史分為21-三體生育史、胎停育史和其他組,孤立性胎停育史組的胎兒核型異常率最高,其他不良孕史合并超聲軟指標(biāo)陽性組SNP-Array異常率最高,孤立性21-三體生育史組的胎兒未檢出染色體異常,見表3。

表3 不良孕史與核型、CNVs相關(guān)性分析[例(%)]

五、超聲軟指標(biāo)類型及超聲異常數(shù)目與核型、CNVs相關(guān)性

在孤立性超聲軟指標(biāo)陽性組中,SNP-Array共檢出24例染色體異常,其中致病性變異共9例,為5例21-三體,1例18-三體,1例Y與X染色體比例異常(嵌合比例30%),1例Xq28重復(fù)和1例22q13.1q13.33重復(fù);可能致病性變異7例,臨床意義不明8例。

剔除其他高危因素,在孤立性超聲軟指標(biāo)陽性分組中,核型分析僅孤立性心內(nèi)強(qiáng)回聲灶的胎兒檢出染色體異常[46,XN,ins(13;4)(q22;q31q35)],SNP-Array檢測孤立性長骨短的胎兒染色體異常率最高,其次依次是孤立性NF增厚、孤立性側(cè)腦室擴(kuò)張。剔除其他高危因素,僅超聲異常組中隨超聲異常數(shù)目增加,核型和SNP-Array染色體異常率隨之升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表4。

表4 超聲軟指標(biāo)類型及超聲異常數(shù)目與核型、CNVs相關(guān)性分析[例(%)]

六、12例胎兒SNP-Array異常父母驗證結(jié)果及妊娠結(jié)局

父母驗證的SNP-Array異常胎兒中7例來源于父母,父母表型均正常,其中1例因足內(nèi)翻選擇終止妊娠,其他均順利分娩,隨訪至1周歲左右發(fā)育未見異常。另外5例SNP-Array異常胎兒為新發(fā)變異,其中1例胎兒核型及FISH均正常,SNP-Array為可能致病性變異,父母驗證SNP-Array均正常,臨床遺傳咨詢后選擇繼續(xù)妊娠后順利分娩,隨訪至1歲6個月,發(fā)育未見異常,其他4例均選擇終止妊娠。

討 論

單核苷酸多態(tài)性是指基因組中DNA某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化,而且任何一種等位基因在群體中的頻率不小于1%[7]。CMA是一種以微陣列為技術(shù)基礎(chǔ)的高分辨率全基因組染色體變異檢測技術(shù),近年來在臨床已廣泛應(yīng)用。相比于基于微陣列的比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)和低深度全基因組測序(CNV-seq)技術(shù),SNP-Array技術(shù)對于染色體非整倍體和拷貝數(shù)變異的檢測與aCGH和CNV-seq技術(shù)相當(dāng),但對于單親二倍體、三倍體和一定比例嵌合體的檢測優(yōu)勢更為突出,而且CNV-seq測序深度低有可能會漏檢,SNP-Array以高分辨率、高準(zhǔn)確性的優(yōu)點,與傳統(tǒng)核型分析聯(lián)合應(yīng)用可以更好地指導(dǎo)臨床遺傳咨詢[8]。

任何單一的產(chǎn)前診斷檢測方法均有漏檢或誤檢的可能,本研究中,SNP-Array的異常檢出率(18.3%)相比核型分析的異常檢出率(11.5%)提高了26.8%,兩者聯(lián)合應(yīng)用的染色體異常檢出率達(dá)到20.5%。若僅行核型分析而不進(jìn)行SNP-Array檢測,其染色體異常漏檢率達(dá)9.8%,包括致病性變異35例,可能致病28例。而若僅行SNP-Array檢測而不進(jìn)行核型分析,其染色體異常漏檢率達(dá)2.9%,包括小于5%低比例嵌合3例,額外標(biāo)記染色體1例,附加、易位、倒位、衍生、插入等27例,需結(jié)合SNP-Array結(jié)果方能進(jìn)行更精準(zhǔn)的遺傳咨詢,若SNP-Array沒有致病性CNVs,可以考慮繼續(xù)妊娠。123例兩種檢測均異常胎兒中結(jié)果不符4例,其中1例核型示46,XN,add(8)(p23)pat,SNP-Array示8p23.3p23.1缺失8.68 Mb,由此分析核型提示8號染色體增加未知起源遺傳物質(zhì),有可能是多態(tài)性變異,因沒有引起拷貝數(shù)變異,故SNP-Array無法識別,但檢出8號染色體p23.3p23.1區(qū)段存在約8.68 Mb的缺失,根據(jù)DGV、ISCA、Decipher與Clingen數(shù)據(jù)庫綜合分析,該片段為可能致病性變異[9],經(jīng)SNP-Array夫婦驗證,缺失片段來源于父親,但父親表型正常,經(jīng)過深度遺傳咨詢,夫婦決定保留胎兒,該嬰兒足月順產(chǎn),出生后6個月及11個月隨訪嬰兒身體及智力發(fā)育均未見異常。另1例核型示46,XN,13q?,SNP-Array示22q11.21微缺失,由此分析核型提示13號染色體長臂可疑異常,也有可能是多態(tài)性變異,沒有引起拷貝數(shù)變異,故SNP-Array未檢出,而SNP-Array提示22號染色體缺失1.084 Mb,可能致病性變異,核型未檢出,也補(bǔ)充了結(jié)果,建議夫婦驗證,但孕婦及家屬選擇終止妊娠未驗證。而另1例核型示46,XN,add(21)(p13),SNP-Array示22q13.1q13.33微重復(fù),由此分析是22號染色體微重復(fù)的部分到了21號染色體。由此可見,SNP-Array技術(shù)較核型分析染色體異常檢出率高,兩者聯(lián)合應(yīng)用可彌補(bǔ)各自不足,提高染色體異常檢出率,核型結(jié)果與SNP-Array結(jié)果相互補(bǔ)充,可以更精準(zhǔn)的分析染色體異常,有利于臨床咨詢及再生育指導(dǎo)[10-11]。

剔除其他高危因素,本研究中,探討孤立性產(chǎn)前診斷指標(biāo)對胎兒染色體的影響,其中孤立性無創(chuàng)高危組核型與SNP-Array異常率最高,尤其SNP-Array可檢出核型不可識別的CNVs,可見,核型聯(lián)合SNP-Array在無創(chuàng)高危孕婦的產(chǎn)前診斷中體現(xiàn)出較高的臨床應(yīng)用價值[12-13]。在年齡分組中,21-三體發(fā)生率與年齡呈正相關(guān),而孤立性高齡組SNP-Array檢測致病性變異檢出率僅為1.6%,年齡分組中CNVs與年齡沒有相關(guān)性,可見SNP-Array檢測應(yīng)涉及到所有年齡段的高危孕婦[14]。

在孤立性不良孕史中,孤立性胎停育史組的胎兒核型異常率最高,其他不良孕史合并超聲軟指標(biāo)陽性組SNP-Array異常率最高,而染色體異常是胎停育的最常見原因,具有胎停育史的孕婦其胎兒再次患染色體異常的發(fā)生率仍較高[15-17]。而孤立性21-三體生育史組的胎兒未檢出染色體異常,因剔除其他高危因素,可能與樣本量較少有關(guān),還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

在孤立性超聲軟指標(biāo)陽性組中,SNP-Array共檢出24例染色體異常,其中致病性變異共9例,為5例21-三體,1例18-三體,1例Y與X染色體比例異常(嵌合比例30%),1例Xq28重復(fù)和1例22q13.1q13.33重復(fù);可能致病性變異7例,臨床意義不明8例。在超聲軟指標(biāo)分組中,核型分析僅孤立性心內(nèi)強(qiáng)回聲灶的胎兒檢出染色體異常,為46,XN,ins(13;4)(q22;q31q35),可見心內(nèi)強(qiáng)回聲灶仍不排除染色體異?？赡堋Ｆ渌铝⑿猿曑浿笜?biāo)核型分析沒有檢出染色體異常,但SNP-Array卻能檢出CNVs,其中SNP-Array檢測孤立性長骨短的胎兒染色體異常率最高,其次依次是孤立性NF增厚、孤立性側(cè)腦室擴(kuò)張,且隨超聲異常數(shù)目增加,核型和SNP-Array染色體異常率隨之升高。早在2013年CMA就已經(jīng)被美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會和母胎醫(yī)學(xué)協(xié)會推薦作為超聲結(jié)構(gòu)畸形胎兒的首選技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷,可見,超聲異常尤其是超聲軟指標(biāo)陽性的胎兒其染色體異常的發(fā)生率較高,傳統(tǒng)核型分析存在局限性,SNP-Array檢測已成為超聲異常胎兒產(chǎn)前診斷首選一級檢測方案[18-19],而SNP-Array檢測異常后應(yīng)父母加以驗證,但因SNP-Array費用較高,無法普及。本研究中父母SNP-Array驗證的異常胎兒中7例來源于父母,父母表型均正常,其中1例因足內(nèi)翻選擇終止妊娠,其他均順利分娩,隨訪至1周歲左右發(fā)育未見異常。另外5例SNP-Array異常胎兒為新發(fā)變異,其中1例胎兒核型及FISH均正常,SNP-Array為可能致病性變異,父母驗證SNP-Array均正常,臨床遺傳咨詢后選擇繼續(xù)妊娠后順利分娩,隨訪至1周6個月,發(fā)育未見異常,其他4例均選擇終止妊娠。可見,染色體異常胎兒應(yīng)雙親驗證并結(jié)合進(jìn)一步連續(xù)超聲檢查及遺傳咨詢,以指導(dǎo)孕婦是否繼續(xù)妊娠。

綜上所述,21-三體發(fā)生率與年齡呈正相關(guān),無創(chuàng)高危、胎停育史、長骨短、NF增厚和側(cè)腦室擴(kuò)張?zhí)崾救旧w異常風(fēng)險升高,心內(nèi)強(qiáng)回聲灶仍不排除染色體異常的可能,遺傳咨詢中雙親驗證后的家系綜合分析仍十分重要,核型分析聯(lián)合SNP-Array技術(shù)可提高染色體異常檢出率,核型結(jié)果與SNP-Array結(jié)果相互補(bǔ)充,可以更精準(zhǔn)的分析染色體異常,有利于遺傳咨詢及再生育指導(dǎo),是高危孕婦胎兒首選的產(chǎn)前診斷方案。