micro-CT 觀察晚期氧化蛋白產(chǎn)物對兔骨關節(jié)炎軟骨下骨的影響

余輝 吳慶能 熊光 胡文帥 溫輝林 趙進喜 蔡蔚

骨關節(jié)炎是一種以軟骨退化、滑膜慢性炎癥、軟骨下骨重塑以及骨贅形成為特點的退行性關節(jié)病[1]。研究證實氧化應激是骨關節(jié)炎的一種重要致病因素，活性氧自由基 (reactive oxygen species，ROS)在骨關節(jié)炎軟骨中含量很高[2]。伴隨著衰老，軟骨細胞內抗氧化酶活性與線粒體功能的顯著下降[3]，關節(jié)內 ROS 水平逐漸升高，軟骨細胞的 DNA 結構受損，端粒長度明顯下降，導致軟骨基質生成大量減少、軟骨細胞老化或出現(xiàn)凋亡[4]。晚期氧化蛋白產(chǎn)物 (advanced oxidation protein products，AOPPs) 是體內重要的氧化應激標記物，已被證實參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[5-8]。同時 AOPPs 又能誘導各種細胞發(fā)生呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生更多的 ROS[9]，造成惡性循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性骨關節(jié)炎和類風濕性關節(jié)炎患者血漿中，AOPPs 水平均有顯著提高[10]，且 AOPPs能夠通過不同途徑誘導軟骨細胞的凋亡[11-12]，這說明 AOPPs 也是骨關節(jié)炎極其重要的致病因子。既往對骨關節(jié)炎的研究一直將重點放在關節(jié)軟骨上，而相關學者卻提出軟骨下骨的改變要早于軟骨的改變[13]。雖然軟骨下骨的骨重塑作為骨關節(jié)炎啟動因素的論斷尚缺乏足夠的證據(jù)，但骨關節(jié)炎病程中軟骨下骨改變的普遍性已被許多報道證實[14-16]。而研究發(fā)現(xiàn) AOPPs 能誘導成骨樣細胞內 ROS 生成、激活 ROS 敏感核轉錄因子 Kappa B (nuclear factor-κB，NF-κB) 信號，抑制成骨細胞的增殖與分化[17]，還可以通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶依賴的、MAPKs 介導的內源性凋亡通路誘導成骨細胞凋亡[18]。因此，有理由推測，骨關節(jié)炎患者關節(jié)液中可能存在 AOPPs 蓄積，且 AOPPs 可能是軟骨下骨發(fā)生骨重塑的一種重要因素。本實驗以手術造模[19]的方式制造出兔骨關節(jié)炎模型，再由外源性 AOPPs 干預，最終采用高分辨率 micro-CT 來量化并評價軟骨下骨的改變。

材料與方法

一、試驗設計、時間及地點

本實驗為動物對比實驗，實驗于 2013 年 6 月至2014 年 11 月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院中心實驗室完成。

二、實驗材料

實驗動物：5 月齡雄性新西蘭大白兔 24 只，體重 2.0～2.5 kg，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。于室溫 (22±1) ℃、濕度 50%～60% 的環(huán)境下飼養(yǎng)，給予充足的水 (蒸餾水) 和食物 (兔標準化飼料，南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，嚴格控制光照周期 (晝 12 h，夜 12 h)。在新環(huán)境中適應 10 天后，通過隨機數(shù)字表法對動物進行區(qū)組隨機化分組，將動物平均分為晚期氧化蛋白產(chǎn)物組 (AOPPs組)，磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline，PBS)組和假手術組 (Sham組)。本實驗方案通過南方醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會審核并批準實施。

三、方法

1.無內毒素 AOPPs 制備方法：將兔血清白蛋白粉末用 PBS 溶解配成 20 mg / ml 溶液后與 40 mmol / L的次氯酸等體積混合后，室溫下反應 30 min 后立即轉移至透析袋中，放入 PBS 中在磁力攪拌器攪拌下連續(xù)透析 24 h，每隔 6 h 更換 PBS 液體，至配制的混合液體中無游離 HCIO。用直徑為 0.22 μm 的細菌濾器對配制的液體進行過濾后分裝于 50 ml 離心管中備用。為盡可能降低內毒素污染，配液過程中所有玻璃器皿都經(jīng)高溫處理。用除菌濾器過濾配制好的 AOPPs 溶液，使其內毒素水平低于 0.05 ng / mg 水平。使用試劑、儀器詳情見表1、2。

表1 使用試劑名稱、規(guī)格及生產(chǎn)廠家Fig.1 Reagent name, specification and manufacturer

表2 使用儀器、設備名稱、型號及生產(chǎn)廠家Fig.2 Instrument, equipment name, model and manufacturer

2.動物造模方法：采用濃度為 30 g / L 的戊巴比妥鈉 (1.0 ml / kg) 與速眠新 Ⅱ (0.3 ml / kg) 進行肌內注射麻醉新西蘭大白兔后，常規(guī)備皮消毒手術區(qū)域。其中 AOPPs 組與 PBS 組均行前交叉韌帶橫斷和內側半月板切除術 (anterior cruciate ligament transection and medial meniscus resection，ACLT +MMx)。Sham 組以同樣手術入路暴露關節(jié)腔后逐層縫合。

3.動物干預方法：采用膝關節(jié)腔內注射干預，將兔固定于兔盒中，屈曲膝關節(jié)，用 1 ml 注射器抽取配制好的干預藥劑注射入膝關節(jié)腔中，隔天注射1 次。

4.處死與取材：使用戊巴比妥鈉將兔深度麻醉處死，然后沿大腿外側中線切開肌肉至小腿遠端，充分暴露股骨與脛骨，用咬骨鉗將股骨近端與脛骨遠端剪斷，留取中間含膝關節(jié)的部分。將整體的膝關節(jié)標本放置在顯微手術操作臺上，用眼科剪剪開關節(jié)囊，分離股骨與脛骨之間的軟組織直到將股骨與脛骨分離開。分離開的脛骨經(jīng)過充分剝離標本上殘余軟組織后，用生理鹽水紗布進行包埋并放入50 ml 離心管中編號置入 -80 ℃ 冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

5.大體形態(tài)觀察：用眼科剪將脛骨平臺周圍軟組織剔除干凈后對脛骨平臺軟骨關節(jié)面進行觀察與拍照。

6.組織學切片番紅 O 染色：取各組脛骨，用體積分數(shù) 10% 的多聚甲醛溶液固定 24 h 后采用乙二胺四乙酸螯合劑慢速脫鈣 8 周，石蠟縱向包埋。將脛骨平臺內側關節(jié)面標本縱向分為 4 個區(qū)域，取中間2 個區(qū)域的軟骨及軟骨下骨制作 5 μm 厚切片。切片經(jīng)逐級脫蠟、脫水、用番紅染色劑染色 2 min，95%酒精沖去浮色并脫水，擦去標本以外的多余染料，晾干后以中性樹脂封片。

7.脛骨軟骨下骨的 micro-CT 掃描：將脛骨平臺標本垂直置于樣品套筒中，以泡沫固定防止標本晃動。然后將套筒固定于 micro-CT 中對標本經(jīng)行預掃描，在預掃描的基礎上選擇正式掃描的感興趣區(qū)域后即可開始掃描，掃描參數(shù)：電壓 45 kV，電流90 μA，掃描分辨率 36 μm，掃描完成后將掃描數(shù)據(jù)從主機導出。

四、主要觀察指標

觀察關節(jié)軟骨損傷程度和軟骨基質染色情況。micro-CT 測量參數(shù)：骨體積分數(shù) (bone volume fraction，BV / TV)，即骨體積占總骨組織體積的百分比，單位為 %；骨小梁厚度 (trabecular thickness，Tb.Th)，是指骨小梁的平均厚度，單位為 mm；骨小梁分離度 (trabecular separation，Tb.Sp)，是指骨小梁之間的髓腔平均寬度，單位為 mm；骨小梁數(shù)目 (trabecular number，Tb.N) 是指在給定長度骨組織與非骨組織的交點數(shù)量，單位為 1 / mm；骨小梁結構模型指數(shù) (structure model index，SMI)，定義骨小梁板狀和桿狀的程度，板狀骨小梁和桿狀骨小梁的SMI 數(shù)值分別為 0 和 3；骨小梁連接密度 (connection density，CD)，是指在給定的空間內骨小梁之間交點的數(shù)量，單位為 1 / mm3。

五、統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學處理。計量數(shù)據(jù)以±s表示，首先對各組 micro-CT 測量參數(shù)行方差齊性檢驗，各組間比較在方差齊時行 One-way ANOVA，LSD 法多重比較。方差不齊時行 Welch 法，Dunett T3 法多重比較。測量參數(shù)之間的相關分析在各組方差齊時應用 Pearson 相關分析，方差不齊時采用 Spearman 相關分析。檢驗水準 α 值取雙側 0.05。

結 果

一、大體觀察結果

Sham 組脛骨平臺軟骨關節(jié)面平整有光澤，關節(jié)周圍未見骨贅；PBS 組可見關節(jié)面軟骨出現(xiàn)較小裂紋，關節(jié)面局部泛紅；AOPPs 組關節(jié)面負重區(qū)可見明顯缺損，關節(jié)色澤變暗，周圍可見骨贅形成(圖1a～c)。

圖1 各組的大體標本與組織學切片觀察 (番紅O 固綠染色 × 200) a：Sham 組脛骨平臺軟骨關節(jié)面平整有光澤，關節(jié)周圍未見骨贅；b：PBS 組可見關節(jié)面軟骨出現(xiàn)較小裂紋，關節(jié)面局部泛紅；c：AOPPs 組關節(jié)面負重區(qū)可見明顯缺損，關節(jié)色澤變暗，周圍可見骨贅形成；d：Sham 組可見軟骨表面光滑平整，基質染色均勻，軟骨細胞形態(tài)以及分布正常；e：PBS 組軟骨表面出現(xiàn)裂隙，基質染色均勻，軟骨細胞形態(tài)及分布正常；f：AOPPs 組可見軟骨出現(xiàn)較大范圍損傷，基質染色稍淡，部分軟骨淺層部分軟骨細胞出現(xiàn)死亡Fig.1 Gross image and histological observation of cartilage of tibial plateau (Alcian blue and Picrosirius red staining × 200) a: In the Sham group, the articular surface of tibial plateau cartilage was smooth and shiny, with no osteophytes around the joints; b: In the PBS group, small cracks in the cartilage and osteophytes were visible around the joints; c: In the AOPPs group, conspicuous defects were observed in the weight-bearing area of the articular surface, accompanied by a darkening of joint coloration and the formation of surrounding osteophytes; d: In Sham group, cartilage surface was smooth and flat with uniform matrix staining, and cartilage morphology and distribution were normal; e: In PBS group, cartilage surface cracks were observed with uniform matrix staining, and cartilage morphology and distribution were normal; f: In AOPPs group, matrix staining was slightly weak, and some chondrocytes appeared in superficial layers of cartilage died

二、組織學切片番紅 O 染色結果

Sham 組可見軟骨表面光滑平整，基質染色均勻，軟骨細胞形態(tài)以及分布正常；PBS 組軟骨表面出現(xiàn)裂隙，基質染色均勻，軟骨細胞形態(tài)及分布正常；AOPPs 組可見軟骨出現(xiàn)較大范圍損傷，基質染色稍淡，部分軟骨淺層部分軟骨細胞出現(xiàn)死亡(圖1d～f)。

三、micro-CT 掃描參數(shù)比較

脛骨平臺軟骨下骨的水平截面、冠狀截面 CT表現(xiàn)以及三維重建圖見圖2。

圖2 脛骨平臺軟骨下骨的水平截面、冠狀截面CT 表現(xiàn)以及三維重建圖a～c：脛骨平臺下軟骨下骨水平截面 CT 圖，可見 AOPPs 組中 Tb.N 較另外兩組減少，骨小梁連接稀疏；d～f：脛骨平臺下軟骨下骨的冠狀截面CT 圖，可見在冠狀面上AOPPs 組中亦出現(xiàn)了骨小梁稀疏的情況；g～i：脛骨平臺下軟骨下骨 CT三維重建圖，同樣可觀察到 AOPPs 組中骨小梁數(shù)目減少Fig.2 Horizontal plane and coronal plane CT images of subchondral bone of tibial plateau and observation of threedimensional reconstruction of subchondral bone a - c:CT chart of the horizontal section under the tibial plateau, showing that the number of trabecules in the AOPPs group decreased compared with the other two groups, and the trabecular connection was sparse; d - f: Coronal cross section CT of the subchondral bone of the tibial plateau, showing the sparse trabecules in the AOPPs group; g - i: 3D CT reconstruction of the subchondral bone in the tibial plateau, showing reduced trabecular bone in the AOPPs group

BV / TV：Sham 組與 PBS 液組 BV / TV 均較AOPPs 組高，且差異有統(tǒng)計學意義 (P＜ 0.01) 。

Tb.N：Sham組Tb.N 較 AOPPs 組高，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜ 0.01)。而 PBS組Tb.N 雖較 AOPPs 組高，但差異無統(tǒng)計學意義 (P＞ 0.05)。

Tb.Sp：Sham 組與 PBS組Tb.Sp 均低于 AOPPs組，且差異均有統(tǒng)計學意義 (前者P＜ 0.01，后者P＜ 0.05) 。

Tb.Th：Sham組Tb.Th 高于 AOPPs 組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜ 0.05)。PBS組Tb.Th 也高于 AOPPs組，但差異無統(tǒng)計意義 (P＞ 0.05)。

CD：Sham組CD 高于 AOPPs 組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜ 0.05)。PBS組CD 也高于 AOPPs 組，但差異無統(tǒng)計意義 (P＞ 0.05)。

SMI：AOPPs 組的 SMI 值更接近 0，其骨小梁形狀更偏向于板狀，而 Sham 組與 PBS 組的 SMI 值在1.0～1.5，其骨小梁形狀并無明顯偏向。

四、BV / TV 與 Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp 及 CD 的相關性

骨小梁數(shù)目與 BV / TV 之間呈正相關關系 (R2=0.5275，P＜ 0.05)，兩者之間存在顯著的相關關系；Tb.Th 與 BV / TV 之間呈正相關關系 (R2= 0.2102，P＜ 0.05)，兩者之間存在顯著的相關關系；Tb.Sp 與BV / TV 之間呈負相關關系 (R2= 0.5491，P＜ 0.05)，兩者之間存在顯著的相關關系；CD 與 BV / TV 之間呈負相關關系 (R2= 0.4097，P＜ 0.05)，兩者之間存在顯著的相關關系。

圖3 各組之間脛骨平臺軟骨下骨 micro-CT 掃描參數(shù)的比較。*表示與 AOPPs 組相比，差異有統(tǒng)計學意義 (P ＜ 0.05)；**表示與 AOPPs 組相比，差異有統(tǒng)計學意義 (P ＜ 0.01)；SMI 為骨小梁結構模型指數(shù)，數(shù)值取 0～3 之間，0 表示骨小梁呈板狀，3 表示骨小梁呈桿狀Fig.3 Comparison of Micro-CT scanning parameters among three groups.*Represented a statistically significant difference compared to AOPPs(P ＜ 0.05); **Indicated a significant difference compared to AOPPs (P ＜ 0.01); SMI was the index of trabecular structure (0 - 3), 0 represented trabecular plate and 3 represented trabecular rod

圖4 BV / TV 與骨小梁數(shù)目、Tb.Th、Tb.Sp 以及 CD 的相關性分析，R2 為決定系數(shù)，決定系數(shù)越大，自變量對因變量的解釋程度越高，自變量引起的變動占總變動的百分比越高；P ＜ 0.05 表示兩者存在顯著相關關系Fig.4 The correlation between bone fraction and trabecular number, trabecular thickness, trabecular separation and trabecular connection density separately.R2 was the coefficient of determination, the larger the coefficient of determination, the higher the interpretation degree of the dependent variable, the higher the percentage of the independent variable in the total change; P ＜ 0.05 indicated a significant correlation between the two

討 論

本研究在實驗中觀察動物大體標本切片發(fā)現(xiàn)：PBS 組大體標本以及軟骨切片均可以觀察到異于Sham 組的改變，如軟骨裂隙和軟骨色澤的改變，而在 AOPPs 組中觀察到較 PBS 組更為嚴重的軟骨退變，說明外源性 AOPPs 加速了骨關節(jié)炎軟骨的退變速度。

本研究的主要目的是通過 micro-CT 觀察外源性AOPPs 在骨關節(jié)炎早期進程中對軟骨下骨骨重塑的影響，而描述軟骨下骨骨重塑最常用的 micro-CT 指標分別是 BV / TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N、SMI 以及CD。除此之外，筆者還對 micro-CT 掃描的軟骨下骨各截面圖片以及三維重建圖進行了收集與觀察，從最直觀的角度來說明軟骨下骨的改變。實驗中發(fā)現(xiàn)無論是從水平面還是冠狀面觀察，AOPPs 組軟骨下骨的 Tb.N 明顯較另外兩組減少，且在三維重建圖中觀察到了相同的情況。這一現(xiàn)象初步證實了筆者的假設，即外源性 AOPPs 在兔骨關節(jié)炎早期病程中對軟骨下骨的骨重塑產(chǎn)生了影響。在進一步對各組軟骨下骨相關掃描參數(shù)的統(tǒng)計學分析中發(fā)現(xiàn)，Sham 組與 PBS 組的 BV / TV 較 AOPPs 組高，且差異有統(tǒng)計學意義。同時，Sham 組骨小梁數(shù)目較 AOPPs 組高，差異有統(tǒng)計學意義，這一結果說明了外源性 AOPPs加速了骨關節(jié)炎早期進程中軟骨下骨的骨吸收過程。而軟骨下骨骨量以及骨小梁數(shù)目的減少又會導致軟骨下骨生物力學特性的改變，從而加速軟骨的退變。既往研究亦證實 OA 早期關節(jié)軟骨退變之前，軟骨下骨已經(jīng)出現(xiàn)彈性模量減低、骨量減少的改變[20]。Tb.Sp 是指骨小梁之間的髓腔平均寬度，Sham組與 PBS 組的 Tb.Sp 均較 AOPPs 組高，差異有統(tǒng)計學意義。這說明 Sham 組與 PBS 組的骨小梁排列較AOPPs 組更為致密緊湊，在外源性 AOPPs 干預下，軟骨下骨的骨小梁的排列出現(xiàn)了紊亂，出現(xiàn)了類似于骨質疏松的改變。同時 Sham 組的 Tb.Th 較 AOPPs高，且差異有統(tǒng)計學意義，而 PBS組Tb.Th 雖高于AOPPs 組，但差異無統(tǒng)計學意義。這說明在骨關節(jié)炎進程中，骨小梁本身的結構發(fā)生了改變，即厚度減小。CD 同樣是 Sham 組與 PBS 組均高于 AOPPs，但只有 Sham 組與 AOPPs 組之間的差異有統(tǒng)計學意義，說明經(jīng) ACLT + MMx 造模的兔骨關節(jié)炎早期即出現(xiàn)了軟骨下骨骨小梁連接的斷裂，即軟骨下骨的微損傷。關于 SMI，其主要是在骨質疏松的研究中被用到，本研究發(fā)現(xiàn) Sham 組與 PBS 組的 SMI 值趨于正常，而 AOPPs 組的 SMI 值則接近 0，顯示其骨小梁更趨向與板狀結構。既往研究發(fā)現(xiàn)骨質疏松患者的骨小梁形狀更接近于桿狀[21]，說明雖然 AOPPs 組的骨量及骨小梁數(shù)目減少，出現(xiàn)類似骨質疏松的改變，但其本質上又與骨質疏松卻不盡相同。

上述 micro-CT 掃描參數(shù)在骨重塑的過程中并不是相互獨立的，筆者將其它參數(shù)指標與最為主要的指標即 BV / TV 進行了相關分析，以探求哪些指標與 BV / TV 的改變聯(lián)系最為緊密。最終結果發(fā)現(xiàn)Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp 以及 CD 與 BV / TV 都存在顯著的相關關系，且除了 Tb.Sp 以外，其余三項指標均與BV / TV 相關性較高。其中 Tb.Sp 與 BV / TV 呈負相關，其余三項指標與 BV / TV 均呈正相關。值得指出的是通過對決定系數(shù)R2的分析，發(fā)現(xiàn)在骨重塑的過程中，骨小梁數(shù)目 (R2= 0.5275)、Tb.Sp (R2= 0.5491)與 CD (R2= 0.4097) 可能是導致 BV / TV 改變的主要因素，Tb.Th 為次要因素。

綜上所述，本研究證實了在外源性 AOPPs 的干預下，兔骨關節(jié)炎早期病程中關節(jié)軟骨的退變和軟骨下骨的重吸收速度均有顯著加快，也從側面印證了 AOPPs 作為一種內源性致病介質，可能參與了骨關節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展。這一結論為骨關節(jié)炎的發(fā)病機制提供新方向，從而為臨床發(fā)展新的疾病干預方式打下理論基礎。同時，為研究蛋白質修飾產(chǎn)物在骨關節(jié)炎中的致病機制提供新線索和新視角。