基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的重樓鎮(zhèn)驚湯調(diào)治抽動(dòng)障礙的作用機(jī)制研究

陳 玉，鄧安妮，薛貝貝

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，四川 成都 610000）

抽動(dòng)障礙是兒童時(shí)期一種常見的神經(jīng)精神障礙性疾病，與遺傳、中樞神經(jīng)遞質(zhì)、感染及免疫等因素有關(guān)，臨床以不自主、突發(fā)、反復(fù)、快速、無節(jié)律性的一個(gè)或多個(gè)部位運(yùn)動(dòng)抽動(dòng)和（或）發(fā)聲抽動(dòng)為主要特征，嚴(yán)重影響兒童的身心健康及日常生活[1-3]。重樓鎮(zhèn)驚湯為李建保教授所創(chuàng)立的治療抽動(dòng)障礙的經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效顯著，由重樓、柴胡、黃芩、白芍、桑葉、菊花、鉤藤、全蝎、天麻、蜈蚣、薄荷、甘草組成。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合了多學(xué)科的技術(shù)，能夠?qū)λ幬镏委熂膊∵M(jìn)行多層次網(wǎng)絡(luò)分析，從微觀分子的角度去探索其治療機(jī)制，提供了一條新的途徑以研究藥物作用機(jī)制[4]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析重樓鎮(zhèn)驚湯調(diào)治抽動(dòng)障礙的藥理作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 潛在作用靶點(diǎn)篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中尋找重樓鎮(zhèn)驚湯化學(xué)成分并根據(jù)OB ≥30% 且DL ≥0.18 進(jìn)行篩選，獲得相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，后在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中將蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。以抽動(dòng)障礙為關(guān)鍵詞在GeneCards、TTD、OMIM、DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫中查找其靶點(diǎn)，將藥物和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1 軟件中取交集并繪圖，即重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動(dòng)障礙的潛在靶點(diǎn)。

1.2 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)和“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點(diǎn)在STRING 數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，其文件導(dǎo)入CytoScape3.8.0，利用內(nèi)置工具分析拓?fù)渲?，包括連接度、介度及緊密度，構(gòu)建重樓鎮(zhèn)驚湯“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并篩選核心成分及靶點(diǎn)。

1.3 富集分析及構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)錄入Metascap 平臺并設(shè)置P＜0.01，進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析。

2 結(jié)果

2.1 重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動(dòng)障礙的潛在靶點(diǎn)

因TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未查到重樓、全蝎、天麻、蜈蚣4 味藥活性成分，故經(jīng)查閱已發(fā)表文獻(xiàn)、化源網(wǎng)、化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、ETCM、BATMAN-TCM 獲得其成分及CAS 號，經(jīng)swissadme 篩選得到有效成分及TCMSP 平臺預(yù)測靶點(diǎn)，共獲得重樓鎮(zhèn)驚湯活性成分336 種，靶點(diǎn)520 個(gè)。分別在Genecard 等4 個(gè)數(shù)據(jù)庫中查找、合并并刪除重復(fù)值后得到2395 個(gè)抽動(dòng)障礙相關(guān)靶點(diǎn)。將二者靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖（見圖1），得到165 個(gè)交集靶點(diǎn)，即重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動(dòng)障礙的潛在靶點(diǎn)。

圖1 重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動(dòng)障礙的潛在靶點(diǎn)

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫中得到重樓鎮(zhèn)驚湯靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖2），其TSV.文件導(dǎo)入CytoScape3.8.0，利用CytoScape3.8.0 內(nèi)置工具分析各節(jié)點(diǎn)連接度、介度及緊密度等拓?fù)鋮?shù)，并繪制“成分- 靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（見圖3）。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)可視化分析得到重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動(dòng)障礙的核心成分（見表1）及核心靶點(diǎn)（見表2）。其中AKT1 的連接度、介度及分別為89、0.0549、0.6599，預(yù)測是重樓鎮(zhèn)驚湯發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表1 重樓鎮(zhèn)驚湯主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 重樓鎮(zhèn)驚湯“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.3 KEGG 富集分析

在Metascape 平臺對重樓鎮(zhèn)驚湯調(diào)治抽動(dòng)障礙的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，結(jié)果見圖4。由圖4 可知重樓鎮(zhèn)驚湯主要參與的通路有PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路以及多巴胺能突觸通路等。

圖4 KEGG 富集分析氣泡圖

3 討論

多巴胺合成與代謝障礙是抽動(dòng)障礙的病理機(jī)制，且炎性因子與其相關(guān)。槲皮素能夠減輕多巴胺神經(jīng)損傷[5]并抑制白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）[6-8]。山柰酚能降低IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平[9-10]。β- 谷甾醇可降 低IL-1β、IL-6、TNF-α 和ERK1/2 的 表 達(dá)[11]。柚皮素能夠減輕腦缺血大鼠神經(jīng)元的變性死亡，降低IL-1β 和IL-6 的表達(dá)[12]，且對脂多糖誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用[13]。木犀草素和蘆丁組合物可減輕神經(jīng)元受損程度，抑制促炎因子的釋放，延緩多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性退變[14]。故上述重樓鎮(zhèn)驚湯的核心成分可能通過調(diào)節(jié)多巴胺合成與代謝以及抗炎發(fā)揮抗抽動(dòng)作用。本文預(yù)測出重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動(dòng)障礙的核心靶點(diǎn)，其中IL-1β、IL-6、CXCL8、TNF 均為炎性細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，抽動(dòng)障礙患兒血清及動(dòng)物模型腦組織中IL-6、TNF-α 等炎性細(xì)胞因子水平升高[15-16]，IL-1β、IL-8 與心理社會(huì)壓力相關(guān)[17]，而心理精神因素是抽動(dòng)障礙的危險(xiǎn)因素。AKT1 參與調(diào)節(jié)人腦紋狀體多巴胺信號傳導(dǎo)且位于P13K-Akt 信號通路上，能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，可能是調(diào)治抽動(dòng)障礙的重要靶點(diǎn)。抽動(dòng)障礙與神經(jīng)發(fā)育起源、多巴胺能神經(jīng)元的改變等有關(guān)，神經(jīng)生長因子（NGF）對維持周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元存活、分化和生物學(xué)功能具有重要作用，可能在抽動(dòng)障礙的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[18]。PI3K/Akt 通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、代謝、分化，抗細(xì)胞凋亡[19-21]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，PI3K 抑制劑LY294002能夠減輕多發(fā)性抽動(dòng)癥（TS）大鼠的癥狀，降低TS大 鼠IL-1β、IL-6 和TNF-α 的 水 平[22]。多 巴 胺D2受體在多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育過程中起著重要作用，有實(shí)驗(yàn)表明其與ERK/MAPK 激活有關(guān)[23]。通過MAPK 通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育，從而影響抽動(dòng)。大腦基底神經(jīng)節(jié)及邊緣系統(tǒng)皮質(zhì)多巴胺系統(tǒng)功能紊亂，可能是抽動(dòng)障礙的主要發(fā)病機(jī)制[24]。多巴胺突觸通路上有包括DRD2在內(nèi)的多個(gè)多巴胺受體，通過調(diào)節(jié)這些靶點(diǎn)能夠較好地控制抽動(dòng)障礙[25]。綜上，重樓鎮(zhèn)驚湯可能是通過抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞凋亡從而治療抽動(dòng)障礙。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析了重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動(dòng)障礙的主要活性成分、核心靶點(diǎn)及信號通路，為臨床運(yùn)用重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動(dòng)障礙提供了分子學(xué)依據(jù)。但本研究未考慮中藥劑量、劑型、煎煮后的化學(xué)成分變化及在體內(nèi)的代謝物，故后續(xù)仍需在此基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。