丹參酮ⅡA對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人腎皮質(zhì)近曲小管損傷的影響研究

詹樹煜，黃 薇，陳文良

（廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

丹參酮ⅡA 是從中藥丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）中提取出的一種重要的脂溶性單體[1]。研究表明，丹參酮ⅡA 具有良好的抑制腫瘤的藥理作用，其主要是通過抑制血管生成來抑制腫瘤[2]。在中醫(yī)臨床上，丹參是一味常用于治療腎臟疾病的中藥，亦有研究顯示其具有抑制腎臟炎癥的作用[3]。腎皮質(zhì)近曲小管是腎皮質(zhì)中占比最多的細(xì)胞[4]。當(dāng)致炎因素刺激腎臟時(shí)，腎皮質(zhì)近曲小管會(huì)出現(xiàn)凋亡，釋放促炎因子，參與腎臟的炎癥病理改變[5]。然而丹參酮ⅡA 對(duì)腎皮質(zhì)近曲小管細(xì)胞活力和炎癥的作用目前尚待進(jìn)一步闡明。本研究旨在探究丹參酮ⅡA 對(duì)體外人腎皮質(zhì)近曲小管的影響作用。

1 研究方法

1.1 主要材料

丹參酮ⅡA 購(gòu)自成都瑞芬思（純度≥98%）；脂多糖購(gòu)自Sigma 公司（CAT#L2630）；CCK8 試劑盒購(gòu)自大連美侖（CAT#MA0218、MA0186）；DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素/ 鏈霉素和0.25%含EDTA 胰酶購(gòu)自Gibco 公司（CAT#C11330500BT、10378016、25200072）；胎 牛 血 清 購(gòu) 自BI 公 司（CAT#04-001-1ACS）。RNA 提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑 盒、SYBR 染 料 購(gòu) 自AG 公 司（CAT# AG21102、AG11728、AG11718）。

1.2 人腎皮質(zhì)近曲小管細(xì)胞系（HK-2）的培養(yǎng)與干預(yù)

HK-2 細(xì)胞系購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司（CL-0109）。細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（DMEM/F12+10%胎牛血清+1% 青霉素/ 鏈霉素）在5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度約為90%時(shí)，應(yīng)用0.25%胰蛋白酶以1:3 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 CCK8 實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以5×103顆/ 孔的密度均勻播種在96 孔板中，每孔加100 μL 的完全培養(yǎng)液，置入培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)24 h。次 日 給 予0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL 的脂多糖或0、2.5、5、10、20、40、80 μM的丹參酮ⅡA（溶于DMSO）干預(yù)22 h。每孔加10 μL的CCK8 溶液混勻，繼續(xù)避光孵育2 h。在全波長(zhǎng)酶標(biāo) 儀（Thermo Fisher Scientific, Multiskan GO 1510）中檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。

1.4 細(xì)胞總RNA 提取

將細(xì)胞以1.5×105顆/ 孔的密度均勻播種在96孔板中，每孔加2 mL 的完全培養(yǎng)液，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。次日給予空白對(duì)照組、脂多糖組（4 μg/mL）、丹參酮ⅡA 低劑量組（4 μg/mL 脂多糖+20 μM 丹參酮ⅡA）、丹參酮ⅡA 高劑量組（4 μg/mL 脂多糖+40 μM丹參酮ⅡA）對(duì)應(yīng)干預(yù)。24 h 后以PBS 潤(rùn)洗3 次，加入500 μL/ 孔的RNA 提取試劑，并遵照試劑盒說明書進(jìn)行總RNA、合成cDNA 的提取。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)（qPCR）

委托上海生工公司合成TNF-α（正義鏈：5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG，反 義 鏈：5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG）、IL-1β（正義 鏈：5’-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA，反義鏈：5’-GTCGGAGATTCGTAGCTGGA）和β-actin（正義鏈：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT，反義鏈：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC）。按照SYBR 染料試劑盒說明書配置試劑，并加入1 μL 濃度為1 μg/μL的cDNA，最后按說明書設(shè)定運(yùn)行程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析（ABI, QuantStudio ? 5）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

運(yùn)用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均以±s表示。兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的脂多糖及丹參酮ⅡA 對(duì)HK-2 細(xì)胞活力的影響

本研究通過給予不同濃度的脂多糖干預(yù)來觀察脂多糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)及活力的影響。結(jié)果顯示，隨著脂多糖干預(yù)濃度梯度的上升，HK-2 的細(xì)胞存活率逐步上升，并在4 μg/mL 濃度時(shí)達(dá)到最高的增殖率（見圖1A）。梯度給予不同濃度的丹參酮ⅡA 后，與空白對(duì)照組相比，大于10 μM 濃度的丹參酮ⅡA 組出現(xiàn)明顯的細(xì)胞抑制（見圖1B）。結(jié)果表明，脂多糖會(huì)導(dǎo)致HK-2 異常增殖，而丹參酮ⅡA 具有抑制HK-2增殖的作用。

圖1 不同濃度脂多糖及丹參酮ⅡA 對(duì)HK-2 的影響

2.2 丹參酮ⅡA 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞活力的影響

為探索丹參酮ⅡA 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞活力的影響，我們進(jìn)一步檢測(cè)了脂多糖聯(lián)合丹參酮ⅡA干預(yù)后HK-2 細(xì)胞活力及形態(tài)上的改變。結(jié)果顯示，與脂多糖干預(yù)組相比，給予20、40、80 μM 丹參酮ⅡA 時(shí)細(xì)胞異常增殖率出現(xiàn)明顯下降（見圖2A）。形態(tài)學(xué)觀察顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞透光均勻，細(xì)胞密度約60%，細(xì)胞呈飽滿圓形。脂多糖組的細(xì)胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則狀，透明度不均一，細(xì)胞密度達(dá)到90%以上（見圖2B）。相較于脂多糖組，給予丹參酮ⅡA（40 μM）后，細(xì)胞的密度有一定程度的下降，細(xì)胞的透光度有一定的改善。結(jié)果表明，10 μM ～80 μM 的丹參酮ⅡA 能改善脂多糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞異常增殖及形態(tài)異常。

圖2 丹參酮ⅡA 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)HK-2 炎癥模型細(xì)胞活力及形態(tài)的影響

2.3 丹參酮ⅡA 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞炎癥的影響

為了進(jìn)一步探究丹參酮ⅡA 對(duì)HK-2 炎癥的影響，本研究通過qPCR 檢測(cè)了脂多糖及丹參酮ⅡA 干預(yù)后HK-2 中炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)（見圖3A、B）。結(jié)果顯示，給予脂多糖干預(yù)后，HK-2的炎癥因子表達(dá)水平明顯上升，表明細(xì)胞炎癥損傷模型造模成功。與脂多糖組相比，給予丹參酮ⅡA 后，細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)水平明顯下降，且呈劑量依賴性，表明丹參酮ⅡA 能抑制細(xì)胞模型的炎癥。

圖3 丹參酮ⅡA 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞炎癥的影響

3 討論

目前，丹參酮ⅡA 已有應(yīng)用于臨床的制劑—丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液，其主要用于治療心腦血管相關(guān)的疾病，例如冠心病、腦供血不足、動(dòng)脈閉塞癥等[6]。有研究指出，丹參酮ⅡA 是具有明確藥理活性的單體，具有良好的臨床療效。腎臟是血管、血流豐富的臟器，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥或現(xiàn)代藥理學(xué)的角度看，丹參酮ⅡA 治療腎臟疾病都具備理論基礎(chǔ)。本研究進(jìn)一步提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人腎皮質(zhì)近曲小管細(xì)胞系HK-2 的炎癥損傷具有抑制作用，并可保護(hù)細(xì)胞活力。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了丹參酮ⅡA 對(duì)急性腎損傷、糖尿病腎病等腎臟疾病的作用機(jī)制[7-8]。這些研究表明，丹參酮ⅡA 對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。本研究從對(duì)體外腎皮質(zhì)近曲小管影響的角度進(jìn)一步分析了丹參酮ⅡA 的作用，有助于揭示丹參酮ⅡA 的腎臟保護(hù)作用機(jī)制。

綜上所述，本研究有助于明確丹參酮ⅡA 對(duì)腎臟保護(hù)作用的機(jī)制，可為丹參酮ⅡA 用于治療腎臟疾病提供參考依據(jù)，從而可擴(kuò)大其臨床適應(yīng)癥范圍。