丁香假單胞菌在3 種苔蘚中的致病性研究*

閆 振，牙庫甫江·阿西木，劉秀瑾，李小雙，張道遠(yuǎn) ，李 進(jìn)

(1.新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054；2.中國科學(xué)院 新疆生態(tài)與地理研究所，新疆抗逆植物基因資源保育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011；3.中國科學(xué)院 吐魯番沙漠植物園，新疆 吐魯番 838008)

植物在自然界中的生長受多種因素的制約，如寒冷、干旱、鹽和滲透等非生物脅迫以及食草類昆蟲、競爭性植物和各種微生物的生物脅迫，甚至多種脅迫的綜合制約[1]。苔蘚植物是早期登陸植物的代表，也可用于環(huán)境監(jiān)測和園林綠化[2-3]。部分苔蘚有極強(qiáng)的抗逆特性，通過抗逆基因的篩選對農(nóng)業(yè)的發(fā)展有著深遠(yuǎn)的意義[4]。小立碗蘚(Physcomirella patens)隸屬于葫蘆蘚科(Fumariaceae)小立碗蘚屬(Physcomirium)，對環(huán)境變化較為敏感，是研究環(huán)境脅迫對植物影響的理想材料。小立碗蘚由單層細(xì)胞構(gòu)成，形態(tài)結(jié)構(gòu)和生活史便于觀察；其基因組已被測序且具備高同源重組率的特點(diǎn)，減少了基因編輯過程中的功能冗余，利于基因組操作[5]，因此，小立碗蘚也是研究植物與病原菌相互作用的理想材料。

大自然中還分布有一類耐干苔蘚，它能忍耐原生質(zhì)脫水(脫水可達(dá)95%以上)而不受損害，且遇水能快速復(fù)蘇，因而又被稱為“變水植物”[6]。在干旱沙漠區(qū)分布有多種耐干苔蘚，其中，齒肋赤蘚(Syntrichia carninervis)和銀葉真蘚(Bryum argentum)是耐干苔蘚的代表種，也是組成沙漠生物土壤結(jié)皮的優(yōu)勢物種，對維護(hù)沙漠穩(wěn)定具有重要作用[7]。它們也因其特殊的耐干性狀以及現(xiàn)有完備的組織培養(yǎng)和分子操作平臺，成為耐干性研究的模式種，并已開展了大量耐干分子機(jī)制的研究[8-14]。目前，已知苔蘚對部分植物病原菌具有抑菌能力，通過研究病原菌對苔蘚的致病性能夠判斷苔蘚的抗病能力，從而進(jìn)一步篩選出抗病能力強(qiáng)的苔蘚[15]，有利于植物抗病性的研究，然而有關(guān)耐干苔蘚與病原菌互作的研究卻鮮有報(bào)道。

丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)是一種典型且傳播廣泛的革蘭氏陰性細(xì)菌，能夠?qū)Χ喾N作物造成傷害，是最具破壞力的農(nóng)業(yè)病原菌之一[16]。作為研究植物和病原菌互作機(jī)制的典型物種，同時也是50 多種丁香假單胞菌屬中最先被完全測序的菌株，丁香假單胞菌番茄致病變種PstDC3000 (P.syringaepv.Tomato DC3000)具有清晰的遺傳背景，有利于病害研究[17]。已有研究認(rèn)為丁香假單胞菌能夠在非農(nóng)業(yè)生態(tài)位中廣泛傳播[18]。為了探究丁香假單胞菌是否對荒漠耐干苔蘚有致病性，明確侵染后苔蘚的致病響應(yīng)，本研究以2 種耐干苔蘚(齒肋赤蘚和銀葉真蘚)以及1 種模式苔蘚(小立碗蘚)為研究對象進(jìn)行試驗(yàn)，旨在初步篩選具有抗病能力的苔蘚，為后續(xù)進(jìn)一步開展極端干燥環(huán)境下植物—病原菌互作機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

齒肋赤蘚、銀葉真蘚和小立碗蘚為本課題組培養(yǎng)材料。用自來水清洗3～5 遍后，換無菌水洗至無泥沙為止。3 種苔蘚培養(yǎng)使用的營養(yǎng)基質(zhì)塊購自加拿大Jiffy 公司，于121 ℃、40 min 條件下高壓蒸汽滅菌。在超凈工作臺內(nèi)使用無菌鑷子將3 種苔蘚的配子體單株接種在基質(zhì)塊上，培養(yǎng)條件為16 h 光照、8 h 黑暗，光照條件為3 500 lx，溫度為18～25 ℃，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。

1.1.2 菌種

采用番茄丁香假單胞菌(PstDC3000)作為病害研究的模式菌，菌種由清華大學(xué)劉玉樂教授惠贈。PstDC3000 的培養(yǎng)使用KB 液體培養(yǎng)基，配方為：蛋白胨20 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，甘油10 mL/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1PstDC3000 培養(yǎng)

PstDC3000 儲存于50%甘油中，并于-80 ℃冰箱中保存。使用時用無菌牙簽挑取，在KB 固體培養(yǎng)基(KB 液體培養(yǎng)基+瓊脂15 g/L)上平板劃線，于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2～5 d，直至純化出單菌落。將單菌落挑取至含有液體KB 培養(yǎng)基10 mL 的EP 管中，由于丁香假單胞菌具有利福平的抗性，故在液體KB 培養(yǎng)基中添加50 mg/L利福平，于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)12 h 后，按照1∶100 (體積比)的比例將菌液在液體KB 培養(yǎng)基中進(jìn)行二次活化。菌液OD600值為0.8～1.0 時，將菌液置于5 000 r/min 離心10 min。棄置上清液，使用10 mmol/L MgCl2溶液進(jìn)行重懸，細(xì)菌懸液調(diào)節(jié)至OD600值為0.2 時，病原菌密度為1×108CFU/mL[19]；菌液濃度調(diào)節(jié)完畢后，添加0.02% Silwetl-77 表面活性劑。

1.2.2 侵染試驗(yàn)

將高溫、高壓滅菌的沙土均勻地鋪撒在直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中，PstDC3000 的接種采用MIRZAEE 等[20]的方法。將3 種苔蘚在PstDC-3000 菌懸液中浸泡3 s，以整株苔蘚表面均勻沾染菌懸液為標(biāo)準(zhǔn)。將浸泡過菌懸液的苔蘚種植于沙土上，觀察記錄并統(tǒng)計(jì)其被病原菌侵染的情況。本研究設(shè)置接種病原菌的苔蘚為試驗(yàn)組，噴灑無菌水的苔蘚為對照組。若無特殊情況，每皿中放置30 株苔蘚，每種苔蘚5 個重復(fù)。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 表型觀察

在接種病原菌0、3、7、11 和14 d 時，使用Olympus 體式顯微鏡分別對3 種苔蘚的配子體進(jìn)行表型觀察、統(tǒng)計(jì)并拍照，對病害發(fā)生的過程進(jìn)行實(shí)時記錄，每種苔蘚選取20 株配子體進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。

1.3.2 細(xì)胞活力測定

細(xì)胞活力的測定參考BRETT 等[21]的方法并稍作改進(jìn)。取伊文思藍(lán)粉末用無菌水配置成0.1%伊文思藍(lán)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；將苔蘚置于其中染色2 h，然后用無菌水沖洗4～5 遍，直至洗滌液為無色為止；在體式顯微鏡下拍照觀察，死亡的組織被染為藍(lán)色。

1.3.3 過氧化氫(H2O2)原位檢測

苔蘚配子體H2O2積累的檢測參考MARDANI 等[22]的方法并稍作改進(jìn)。稱取DAB 粉末并配置為1 mg/mL DAB 溶液，加入0.1%表面活性劑Triton X-100，將pH 調(diào)至5.8，遮光備用。挑選試驗(yàn)組和對照組的3 種苔蘚，放入含有DAB工作液的EP 管中，抽真空20 min，遮光染色7 h。在95%乙醇中煮沸10 min，取出后在95%乙醇中過夜脫色，樣品在95%乙醇中保存。在體式顯微鏡下觀察配子體的染色結(jié)果并拍照，組織損傷所產(chǎn)生H2O2的部位被染為棕黃色。

1.3.4 超氧陰離子檢測

超氧陰離子檢測參考PRATEEK 等[23]的方法并稍作改進(jìn)。稱取NBT 粉末并配置成0.5 mg/mL NBT 溶液，將pH 調(diào)至5.8，遮光備用。挑選試驗(yàn)組和對照組的3 種苔蘚，放入含有NBT 工作液的EP 管中，使用真空泵抽真空20 min，遮光染色7 h，在95%乙醇中煮沸10 min，取出后在95%乙醇中過夜脫色，樣品在95%乙醇中保存。在體式顯微鏡下觀察配子體的染色結(jié)果并拍照，超氧陰離子積累的部位被染為藍(lán)色。

1.3.5 熒光定量PCR

hrpZ基因在所有受PstDC3000 感染的組織中都可以被檢測到，對易感植物的感病及超敏反應(yīng)的發(fā)生至關(guān)重要。為了確定細(xì)菌含量，利用q-PCR 對PstDC3000 致病基因hrpZ的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。按照Omega 公司細(xì)菌DNA 提取試劑盒的說明書，提取丁香假單胞菌DNA，并統(tǒng)一稀釋到10 ng/μL，并按梯度稀釋為100、10-1、10-2、10-3和10-4ng/μL，通過熒光定量PCR 的結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。接種后，取不同時間點(diǎn)的3 種苔蘚，將其表面的菌液沖洗干凈，留樣備用。苔蘚DNA 的提取選用Omega 公司的植物DNA 提取試劑盒，特異性引物由上海生工公司合成，其序列為：HrpZ1-F：TCTGAGCAGCGACGCGGGT；HrpZ1-R：AGAGCCGAACGAAACTGAG。按照試劑盒TB Green Premix ExTaqII 配置25 μL的反應(yīng)體系，qPCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃5 s；60 ℃ 30 s；設(shè)置40 個循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 0.05 s；95 ℃ 5 s。測得對應(yīng)的Ct 值并換算為細(xì)菌的拷貝數(shù)，每個時間點(diǎn)設(shè)置3 個重復(fù)[24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019 軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)；采用Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pst DC3000 侵染3 種苔蘚的形態(tài)學(xué)觀察

PstDC3000 接種3 d 時，銀葉真蘚莖稈下部有褐化現(xiàn)象，但褐化程度較輕；隨著接種時間的增加，其配子體莖稈褐化程度明顯增加。PstDC3000 接種3 d 時，小立碗蘚配子體的葉片出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，部分葉片開始褪色；接種14 d 時，配子體褪綠嚴(yán)重，呈明顯萎蔫趨勢，部分葉片泛黃壞死程度較為嚴(yán)重。PstDC3000 接種7 d 時，齒肋赤蘚配子體的葉片整體褪綠現(xiàn)象明顯，且隨著時間的增加，葉綠體開始解體，葉片細(xì)胞死亡，部分配子體整株呈萎蔫狀態(tài)(圖1)。

圖1 Pst DC3000 侵染3 種苔蘚配子體的病狀(比例尺=2 mm)Fig.1 Pathological features of gametophytes of three mosses infected with Pst DC300 (scale bar=2 mm)

接種第0 天時，3 種苔蘚與對照組相比并未發(fā)生明顯變化；接種病原菌3 d 時，齒肋赤蘚開始出現(xiàn)第1 個明顯的細(xì)菌性斑點(diǎn)，癥狀發(fā)生在葉片下部接近假根的位置，癥狀為潮濕的葉片上出現(xiàn)棕色的壞死斑點(diǎn)；接種5 d 時，3 種苔蘚的部分葉片形成明顯的褪綠暈，隨著時間的增加壞死斑數(shù)量增多；接種14 d 時可觀察到明顯的褪綠暈，且配子體莖稈褐化程度加重(圖2)。

圖2 Pst DC3000 侵染3 種苔蘚配子體的表征(比例尺=200 μm)Fig.2 Representation of gametophytes of three mosses infected with Pst DC3000 (scale bar=200 μm)

2.2 細(xì)胞活力

不同苔蘚在接種PstDC3000 后細(xì)胞損傷程度差異較大，具體表現(xiàn)為被伊文思藍(lán)染液處理后苔蘚配子體染色面積不同。與接種0 d 相比，小立碗蘚的染色程度最高，細(xì)胞死亡程度嚴(yán)重；銀葉真蘚適中，細(xì)胞死亡多集中在莖稈褐化部位；齒肋赤蘚染色多集中于配子體葉片病灶發(fā)生部位，葉片褪綠現(xiàn)象發(fā)生后擴(kuò)散至整株配子體(圖3)。染色區(qū)域多集中在病征明顯的部位，這與3 種苔蘚發(fā)病后的表型相吻合。

圖3 Pst DC3000 侵染3 種苔蘚后細(xì)胞活力變化(比例尺=2 mm)Fig.3 Changes in cell viability of gametophyte infected with Pst DC3000 in three mosses (scale bar=2 mm)

2.3 H2O2 原位染色

接種PstDC3000 后，3 種苔蘚表面出現(xiàn)H2O2積累的現(xiàn)象，并集中在不同的區(qū)域，隨著接種時間的增加，染色面積逐漸擴(kuò)大(圖4)。接種14 d時，3 種苔蘚均有明顯的H2O2積累，經(jīng)酒精煮沸后苔蘚配子體呈褪色狀態(tài)。接種0 d 時，小立碗蘚經(jīng)褪色后近乎為透明狀態(tài)，而侵染后其配子體整株被染為棕褐色，其中莖稈部位為深棕色，說明活性氧積累最多；葉片部位染色較淺，病斑集中的部位為深棕色，說明活性氧積累水平較高。接種14 d 時，齒肋赤蘚葉片褪色明顯，而經(jīng)DAB 染色后，整株為明顯的深棕色，說明配子體H2O2整體迸發(fā)明顯。病原菌侵染下，活性氧積累主要集中于銀葉真蘚莖稈部位，表現(xiàn)為其莖稈部位被染為深棕色；葉片部位雖有活性氧積累，但較莖稈部位少，顏色較淺。

圖4 Pst DC3000 侵染3 種苔蘚后H2O2 水平變化(比例尺=2 mm)Fig.4 Changes of H2O2 levels in gametophytes of three mosses infected with Pst DC3000 (scale bar=2 mm)

2.4 超氧陰離子檢測

接種PstDC3000 后，3 種苔蘚表面均出現(xiàn)不同程度的超氧陰離子積累現(xiàn)象(圖5)。接種病原菌后，銀葉真蘚超氧陰離子最先在配子體下端積累；隨著接種時間的增加，超氧陰離子從根部向上擴(kuò)散，多集中在配子體莖稈褐化部位。齒肋赤蘚的超氧陰離子主要集中在葉片，隨著接種時間的增加，超氧陰離子積累的部位擴(kuò)散至整株配子體。隨著接種時間的增加，小立碗蘚配子體超氧陰離子含量逐漸上升，接種病原菌11 d 時整株配子體有明顯的超氧陰離子積累，接種14 d 時超氧陰離子積累最為明顯，莖稈染色部位較11 d 時面積擴(kuò)大。

圖5 Pst DC3000 侵染3 種苔蘚后超氧陰離子變化(比例尺=2 mm)Fig.5 Changes of superoxide anion in gametophytes of three mosses infected with Pst DC3000 (scale bar=2 mm)

2.5 q-PCR 結(jié)果

由圖6 可知：接種病原菌3 d 時苔蘚內(nèi)已檢測到病原菌DNA 的表達(dá)，但其表達(dá)量較低；隨著接種時間的增加，PstDC3000 在3 種苔蘚中的數(shù)量明顯增加，接種7 d 時約為1×105copies/μL；接種15 d 時，小立碗蘚中的病原菌數(shù)量顯著高于齒肋赤蘚和銀葉真蘚(P＜0.05)。

圖6 Pst DC3000 侵染3 種苔蘚后病原菌數(shù)量的變化Fig.6 Changes of pathogenic number in gametophytes of three mosses infected with Pst DC3000

3 討論

荒漠耐干苔蘚是荒漠生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的部分，但在野外和組培過程中時常有苔蘚感病現(xiàn)象的發(fā)生。關(guān)于苔蘚與病原菌互作的報(bào)道較少。前人研究表明：革蘭氏陰性菌胡蘿卜歐文軟腐病菌(Erwinia carotovora)和灰霉菌(Botrytis cinerea)能夠侵染小立碗蘚，導(dǎo)致其組織發(fā)生褐變，這兩類病原菌能夠侵染并誘導(dǎo)植物發(fā)生防御反應(yīng)，最終造成小立碗蘚配子體死亡[25]，但關(guān)于齒肋赤蘚和銀葉真蘚與病原菌間互作的研究卻鮮有報(bào)道。

丁香假單胞菌是世界范圍內(nèi)普遍存在的細(xì)菌，目前已知可對番茄、辣椒和擬南芥等植物造成損傷。TAO 等[26]研究表明：PstDC3000 侵染植物后會出現(xiàn)細(xì)菌性斑點(diǎn)，葉片組織出現(xiàn)廣泛的黃化現(xiàn)象，隨著接種時間的增加出現(xiàn)局部壞死的癥狀。本研究表明：接種病原菌3 d 時，觀察到PstDC3000 侵染植物后的典型表征，即葉片出現(xiàn)細(xì)菌性病斑以及葉片和莖稈褐化，且伴有褪綠暈的出現(xiàn)；接種后期3 種苔蘚配子體莖稈的褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，同時齒肋赤蘚和小立碗蘚伴有葉片泛黃的現(xiàn)象，隨著接種時間的增加，病原菌在植株體內(nèi)大量積累，苔蘚配子體發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的病灶，苔蘚配子體部分壞死，這一結(jié)果與KATAGIRI 等[27]的報(bào)道相似。根據(jù)NOMURA 等[28]對PstDC3000 入侵機(jī)制的研究，推測該種表型產(chǎn)生的原因可能是接種PstDC3000 后，病原菌侵入到苔蘚中，利用其配子體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)繁殖，產(chǎn)生各種毒素，破壞其光合作用，配子體葉片褪綠，并伴有病斑和壞死現(xiàn)象。本研究表明：接種PstDC3000 后，苔蘚會產(chǎn)生典型的病害反應(yīng)，可以觀察到病原菌入侵后的表型。

本研究表明：隨著接種時間的增加，苔蘚配子體染色面積逐漸增大，說明接種病原菌對3 種苔蘚造成了不可逆的損傷，染色區(qū)域多集中在壞死部位。齒肋赤蘚的芒尖屬于無生物活性結(jié)構(gòu)，能夠被伊文思藍(lán)整體染為藍(lán)色，配子體病斑發(fā)生處以及褐化嚴(yán)重的部位也被染為藍(lán)色；銀葉真蘚發(fā)病的主要表現(xiàn)為莖稈褐化，發(fā)病部位染色較為集中；被病原菌侵染后的小立碗蘚除莖稈褐化外，發(fā)病程度較重的則會整株萎蔫壞死，藍(lán)色區(qū)域也從部分?jǐn)U散到整株配子體，這與ZHANG等[29]的報(bào)道一致。隨著接種時間的增加，3 種苔蘚配子體被伊文思染色的面積逐漸擴(kuò)大，說明病原菌侵染3 種苔蘚后對其造成了明顯的損傷，壞死部位細(xì)胞死亡明顯。

病原菌在植物體內(nèi)定植后會引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累，這也是植物防御反應(yīng)的典型表現(xiàn)[30]。ROS 積累包括H2O2的產(chǎn)生以及超氧陰離子的累積，當(dāng)病原菌入侵到植物體內(nèi)時，植物為了抵御病原菌的入侵會產(chǎn)生H2O2清除病原菌，隨著病原菌的大量繁殖，活性氧族的代謝明顯紊亂，導(dǎo)致大量H2O2以及超氧陰離子積累，進(jìn)一步造成植物細(xì)胞發(fā)生持續(xù)性的超敏反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[31]。已有研究表明：DAB 可以與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生黃褐色沉淀，這一特性可以用于檢測H2O2的存在以及分布情況[32]；而超氧陰離子能夠?qū)BT 氧化并形成藍(lán)色沉淀，可以用于檢測超氧陰離子的存在及分布情況[33]。本研究表明：隨著接種時間的增加，3 種苔蘚的H2O2和超氧陰離子含量逐漸增加，其中小立碗蘚和齒肋赤蘚的ROS 積累多集中在莖稈和葉片病斑處，且以莖稈部位ROS 損傷最明顯；而銀葉真蘚的ROS 損傷主要集中在莖稈部位。通過觀察可知：接種PstDC3000 后3 種苔蘚有明顯的H2O2和超氧陰離子產(chǎn)生，說明病原菌的入侵激活了苔蘚的免疫反應(yīng)；隨著接種時間的增加，苔蘚的免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致ROS 大量累積，從而對配子體造成不可逆的損傷。通過熒光定量PCR 技術(shù)對病原菌在3 種苔蘚中定植的情況進(jìn)行實(shí)時檢測，從感染植物提取的總DNA 中特異性擴(kuò)增出PstDC3000 的DNA，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為病原菌拷貝數(shù)，結(jié)果表明：病原菌在接種3 d 時已經(jīng)在苔蘚中進(jìn)行繁殖，病原菌數(shù)量隨著接種時間的增加而增加。綜合病害指標(biāo)檢測表明：隨著接種時間的增加，PstDC3000 對3 種苔蘚的損傷增大。但3 種苔蘚配子體彼此感病程度差異較大，小立碗蘚配子體ROS 積累最多，而2 種荒漠耐干苔蘚相對較少，這可能是因?yàn)樾×⑼胩\是耐干敏感型物種，常生活在潮濕、陰蔽的環(huán)境中，對周圍環(huán)境較為敏感，抵抗逆境脅迫的水平較低[34]；而荒漠耐干苔蘚齒肋赤蘚葉片頂端具芒尖[35]，葉片被蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)包裹[36]，對病原菌侵入起到一定的抵抗作用。此外，推測齒肋赤蘚配子體內(nèi)可能存在較為豐富的抗病相關(guān)基因，并且在病原菌入侵后基因獲得高表達(dá)，進(jìn)而表現(xiàn)出一定程度的抗病性，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

丁香假單胞菌能夠侵染2 種耐干苔蘚及1 種苔蘚模式種，接種后表現(xiàn)為莖稈褐化，葉片出現(xiàn)細(xì)菌性斑點(diǎn)和褪綠暈。發(fā)病后的苔蘚能夠檢測到細(xì)胞死亡，同時在病害發(fā)生的區(qū)域可以檢測到H2O2和超氧陰離子積累；病原菌在苔蘚內(nèi)的數(shù)量隨接種時間的增加而增加。本研究為后續(xù)苔蘚與病原菌間的互作研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。