PD-1抗體調(diào)節(jié)糖尿病大鼠CD8+T細(xì)胞和Treg平衡促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合的療效研究

黃亞蓮 劉瑩 賴舒暢 符茂雄

[摘要]目的：探討PD-1抗體治療糖尿病大鼠足潰瘍的療效及其作用機(jī)制。方法：將30只6～8周齡健康Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和治療組，每組10只，三組大鼠足部人為造成潰瘍創(chuàng)口。采用流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)三組大鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；Image J對(duì)創(chuàng)口照片進(jìn)行分析計(jì)算傷口愈合率；HE染色和組織病理學(xué)分析潰瘍創(chuàng)口處皮膚愈合情況；ELISA測定大鼠足部潰瘍創(chuàng)口組織中TNF-α和IL-1β的水平。結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型組大鼠CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下調(diào)，Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高（P＜0.05）；模型組大鼠足部潰瘍創(chuàng)口愈合不佳，沒有形成完整的新生表皮組織和肉芽組織，未見膠原沉積；模型組大鼠創(chuàng)口處組織中TNF-α和IL-1β的水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，治療組大鼠CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯回升，Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯回落（P＜0.05）；治療組大鼠足部潰瘍創(chuàng)口愈合良好，有較為完整的新生表皮組織、肉芽組織和一定的膠原沉積；治療組大鼠創(chuàng)口處組織中TNF-α和IL-1β的水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：應(yīng)用人源化PD-1抗體治療糖尿病大鼠足潰瘍具有明顯的療效。

[關(guān)鍵詞]糖尿病足潰瘍；PD-1抗體；CD8+T細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β

[中圖分類號(hào)]R587.2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）06-0094-04

Efficacy of PD-1 Antibody Regulating the Balance of CD8+T Cells and Treg Cells in Diabetic Rats and Promoting the Healing of Diabetic Foot Ulcers

HUANG Yalian1，LIU Ying2，LAI Shuchang1，F(xiàn)U Maoxiong1

（1.Department of Endocrinology，the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College，Haikou 570311，Hainan ，China; 2.Drug Safety Assessment Center of Hainan Medical College，Haikou 570216，Hainan，China）

Abstract： Objective? To investigate the efficacy and mechanism of PD-1 antibody in the treatment of diabetic foot ulceration in rat model. Methods? 30 Rats were randomly divided into control group， model group and treatment group， each group has 10 rats， artificial ulcer wounds on the feet of three groups of rats. Flow cytometry was used to count CD8+T cells and regulatory T cells （Treg） cells in the spleens of the three groups of rats. Image J was used to analyze wound photos and calculate wound healing rates. HE staining and histopathological analysis was used to analyze ulcer wounds healing. ELISA was used to determine the levels of TNF-α and IL-1β in rats foot ulcer wound tissues. Results? Compared with the control group， the CD8+T cell count in the model group was significantly down-regulated， and the Treg cell count was significantly increased （P＜0.05）. The wounds of the foot ulcers of the rats in the model group did not heal well with no complete structure of new epidermal tissue and granulation tissue were formed， and no collagen deposition was found. The levels of TNF-α and IL-1β in the wound tissue of rats in the model group were significantly increased （P＜0.05）. Compared with the model group， the CD8+T cell count in the treatment group increased significantly， and the Treg cell count decreased significantly （P＜0.05）. The wounds of the foot ulcers of the rats in the treatment group healed well， with relatively complete structure of new epidermal tissue and granulation tissue were formed， and certain collagen deposition was found. The levels of TNF-α and IL-1β in the wound tissues of the rats in the treatment group were significantly decreased （P＜0.05）. Conclusion? The application of humanized PD-1 antibody in the treatment of diabetic rat foot ulcer has good curative efficacy.

Key words： diabetic foot ulcer; PD-1 antibody; CD8+ T cells; Treg cells; tumor necrosis factor-α; interleukin-1β

炎癥的反應(yīng)性和耐受性之間的精細(xì)平衡主要由T細(xì)胞調(diào)節(jié)，同時(shí)還受細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞因子控制。在動(dòng)物模型中，CD8+T細(xì)胞具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)和促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的雙重功能；與之相對(duì)比的是，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg）具有抑制CD8+T細(xì)胞的功能[1-3]。已有研究顯示，在糖尿病患者中觀察到其外周血Treg細(xì)胞數(shù)量明顯上升[4]。T細(xì)胞上表達(dá)的PD-1與其配體PD-L1相互作用，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化和免疫耐受性過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。本次研究擬通過給予PD-1抗體治療，探討此療法對(duì)糖尿病大鼠CD8+T細(xì)胞和Treg之間平衡的影響及其對(duì)糖尿病足潰瘍愈合是否能夠產(chǎn)生積極作用。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：30只6～8周齡健康Sprague-Dawley（SD）大鼠，購自海南藥物研究所有限責(zé)任公司。標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料和60 kcal的高脂飲食（HFD）購自MP Biomedicals（美國）公司。硫噴妥鈉購自上海源葉生物（中國）?？勾笫驝D16/32抗體（ab223200）購自Abcam（美國）。PE標(biāo)記的抗大鼠CD8a抗體（87922），PE標(biāo)記的抗大鼠Foxp3抗體（65210）和APC標(biāo)記的抗大鼠CD25抗體（36055）購自CST（英國）。蛋白酶抑制劑（539134）購自Sigma-Aldrich（美國）。TNF-α（CSB-E11987r）和IL-1β（CSB-E08055r）ELISA試劑盒購自武漢華美生物（中國）。流式細(xì)胞儀（FACS Aria Ⅲ）購自美國BD公司，光學(xué)顯微鏡（ECLIPSE Ni-E）購自日本Nikon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只6～8周齡健康SD大鼠，體質(zhì)量（160±30）g，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)鼠房，恒溫[（23±2）℃]恒濕，具備以12 h為周期的光照/黑暗循環(huán)，每3只大鼠一個(gè)鼠籠。大鼠開始飼喂HFD飲食構(gòu)建糖尿病大鼠模型前，在鼠房預(yù)先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，所有大鼠喂食標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，大鼠可以自由飲水和進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)為202109-08。

1.3 構(gòu)建糖尿病大鼠模型：將大鼠隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組（n=10），2型糖尿病模型組（n=10），給予PD-1抗體治療的治療組（n=10）。對(duì)照組喂食標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，模型組和治療組大鼠持續(xù)喂食8周的高脂飲食（HFD），然后令大鼠禁食過夜，次日9時(shí)對(duì)其腹腔注射鏈脲佐菌素（35 mg/kg），隨后喂食4周標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，使大鼠發(fā)展為2型糖尿病。

1.4 產(chǎn)生糖尿病足部潰瘍：麻醉各分組大鼠（50 mg/kg硫噴妥鈉）后，使用手術(shù)剪和6 mm穿刺活檢器械在大鼠后足背部形成足部潰瘍創(chuàng)口。大鼠足部形成潰瘍創(chuàng)口后，治療組從形成潰瘍創(chuàng)口的第0天開始，每隔1 d腹腔注射一次人源化的PD-1抗體（4 mg/kg 100 ?l），共注射4次；在治療組注射PD-1抗體的同一天，對(duì)照組和模型組大鼠腹腔注射100 ?l無菌生理鹽水。

1.5 足部潰瘍創(chuàng)口愈合率的計(jì)算：在形成創(chuàng)口后每隔24 h，用數(shù)碼相機(jī)對(duì)傷口進(jìn)行拍照，然后使用ImageJ v1.8.0軟件分析傷口大小。傷口愈合百分比（%）=（初創(chuàng)口面積-測量當(dāng)天傷口面積）/最初創(chuàng)口面積×100%。足部創(chuàng)面愈合第7天，拍照記錄創(chuàng)面后，向大鼠腹腔注射過量硫噴妥鈉（80 mg/kg）對(duì)其進(jìn)行安樂死。取大鼠足部創(chuàng)面處皮膚組織進(jìn)行后續(xù)HE染色和病理學(xué)分析。

1.6 流式細(xì)胞

1.6.1 分離大鼠脾臟淋巴細(xì)胞：足部創(chuàng)面愈合第7天，手術(shù)摘取大鼠脾臟。然后將新鮮分離的大鼠脾臟置于冰預(yù)冷的無菌PBS緩沖液中，將脾臟用無菌手術(shù)刀切成2 mm3的組織小塊。同樣在無菌條件下，將組織小塊放置于70μm細(xì)胞篩網(wǎng)的上面，使用組織研磨棒擠壓摩擦組織，使細(xì)胞通過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)制備單細(xì)胞懸液。用冰預(yù)冷的無菌PBS緩沖液沖洗組織，收集通過篩網(wǎng)的單細(xì)胞懸液。合并上述單細(xì)胞懸液，以1 500 rpm，于4℃離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，即為脾臟淋巴細(xì)胞。

1.6.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞：重懸并計(jì)數(shù)脾臟淋巴細(xì)胞懸液，加入冰預(yù)冷的PBS調(diào)整細(xì)胞懸液，使懸液的細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/毫升。將細(xì)胞懸液置于冰上，并加入抗大鼠CD16/32抗體封閉30 min。對(duì)于CD8+T細(xì)胞檢測，加入PE標(biāo)記的抗大鼠CD8a抗體，置于冰上避光孵育1 h。對(duì)于Treg細(xì)胞檢測，加入PE標(biāo)記的抗大鼠-Foxp3抗體和APC標(biāo)記的抗大鼠CD25抗體，置于冰上避光孵育1 h。上機(jī)BD流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.6.3 HE染色和病理學(xué)分析：收集大鼠足部創(chuàng)口皮膚組織（每組5只），立即浸入10%中性福爾馬林固定液中，在4℃下固定組織超過48 h，待組織充分固定后，經(jīng)石蠟包埋，然后切成厚度為5μm的切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化，然后使用蘇木精染色液染細(xì)胞核，使用1%的鹽酸乙醇進(jìn)行分化，再使用伊紅染色液染細(xì)胞質(zhì)。最后自來水沖洗去除多余染色液，中性樹膠封片，Nikon光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

1.7 ELISA：收集大鼠足部創(chuàng)口皮膚組織（每組5只），立即使用液氮對(duì)組織速凍，并在液氮中制備組織勻漿。然后向每份組織勻漿，加入1 ml冰預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液，以12 000 rpm，于4℃離心15 min，收集上清液。上清液置于冰上，使用大鼠TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒測定創(chuàng)口皮膚組織勻漿中的TNF-α和IL-1β的水平，具體實(shí)驗(yàn)操作方法根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x ?±s）的形式表示。使用GraphPad Prism v8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。三組間比較，采用單向方差分析。以P＜0.05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 PD-1抗體能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠脾臟CD8+T細(xì)胞和Treg平衡：與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞的比例明顯下降，而Treg細(xì)胞的比例明顯上升（P＜0.05）；而經(jīng)過PD-1抗體治療后，與模型組大鼠相比，治療組大鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞的比例明顯回升，而Treg細(xì)胞的比例明顯下降（P＜0.05）。見圖1。

2.2 PD-1抗體能夠促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合：經(jīng)過7 d的愈合，對(duì)照組大鼠愈合了約51.30%，而模型組大鼠僅愈合了約33.70%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；給予PD-1治療的治療組大鼠潰瘍愈合了約45.50%，顯著高于模型組（P＜0.05）。對(duì)愈合了7 d的大鼠足部潰瘍組織進(jìn)行HE染色和病理學(xué)分析，可見對(duì)照組和治療組潰瘍處有較為完整的新生表皮組織、肉芽組織和一定的膠原沉積，而模型組潰瘍處無完整的新生表皮組織和肉芽組織，未見膠原沉積。見圖2。

2.3 PD-1抗體能夠抑制糖尿病足潰瘍處TNF-α和IL-1β的表達(dá)：結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，模型組大鼠足部潰瘍組織處炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平顯著升高（P＜0.05），而給予PD-1治療的治療組大鼠足部潰瘍處炎癥因子水平明顯較低，顯著低于模型組大鼠（P＜0.05）。見圖3。

3? 討論

糖尿病的患病率在全球范圍內(nèi)以驚人的速度增長。下肢截肢是糖尿病相關(guān)發(fā)病率和死亡率高的主要原因之一，是糖尿病足潰瘍（Diabetic foot ulceration，DFU）的結(jié)果[6-7]。與正常個(gè)體傷口愈合的過程相比，慢性糖尿病患者的傷口愈合過程緩慢甚至無法愈合。這種愈合缺陷是由糖尿病相關(guān)的神經(jīng)病變、微血管病變和免疫功能障礙造成的[8-9]。糖尿病患者呈現(xiàn)出全身性炎癥環(huán)境，白細(xì)胞介素IL-1β和腫瘤壞死因子TNF-α的水平持續(xù)高于正常個(gè)體[10]。在本次研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組大鼠足部潰瘍組織處炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平顯著升高（P＜0.05），這與前人研究結(jié)果一致。TNF-α糖尿病患者外周血中的水平高于正常健康個(gè)體[11]。多種糖尿病足的針對(duì)性療法都旨在降低患者足部組織中TNF-α等炎癥因子的水平[11-12]。NLRP3炎癥小體促進(jìn)IL-1β的分泌介導(dǎo)2型糖尿病患者的全身性炎癥反應(yīng)越來越受到研究者的重視[13]。二甲雙胍能夠抑制NLRP3炎癥小體和IL-1β的水平發(fā)揮保護(hù)2型糖尿病心肌病的作用[14]。而且這種炎癥環(huán)境將延伸到皮膚等各種其他組織，造成糖尿病患者免疫系統(tǒng)功能紊亂，出現(xiàn)抗菌能力被抑制和對(duì)組織再生無法作出有效免疫應(yīng)答的現(xiàn)象[15-16]。因此，全身性高炎癥水平引起的免疫功能紊亂是一個(gè)核心問題，單方面僅針對(duì)性地降低足部組織的炎癥水平，無法從根本上解決DFU的病因，也就無法達(dá)到徹底治愈DFU的目標(biāo)。

眾所周知，CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在器官和組織損傷后的傷口愈合過程中扮演著雙重調(diào)節(jié)的重要角色[17-18]。CD8+T細(xì)胞缺乏將導(dǎo)致心機(jī)梗死小鼠心肌壞死面積擴(kuò)大、瘢痕形成不良和心臟破裂風(fēng)險(xiǎn)增加[17]。有研究顯示，DFU患者外周血中，幼稚T細(xì)胞數(shù)量和T細(xì)胞受體（T cell receptors，TCRs）多樣性降低，效應(yīng)性T細(xì)胞（Effector T cells）大量擴(kuò)增[19]，高血糖降低效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的抗病毒功能[20]。在本次的研究結(jié)果中顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠脾臟CD8+T細(xì)胞數(shù)量發(fā)生了明顯的降低，Treg細(xì)胞的數(shù)量明顯升高。同時(shí)，模型組大鼠足部潰瘍的傷口愈合能力明顯低于對(duì)照組。有研究顯示二甲雙胍能夠促進(jìn)記憶樣抗原-缺乏的CD8+、CXCR3+T細(xì)胞群的擴(kuò)增，從而增強(qiáng)2型糖尿病患者或模型小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌攻擊的抵抗能力[21]。綜合這些結(jié)果可以猜測，在本次研究的模型組大鼠體內(nèi)，某些亞型的免疫細(xì)胞（Treg）被過度激活，而CD8+T細(xì)胞則發(fā)生了耗竭，導(dǎo)致模型組大鼠潰瘍處免疫反應(yīng)能力降低，傷口愈合不良。

已知PD-1在常規(guī)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及Treg細(xì)胞上被誘導(dǎo)表達(dá)[22]。PD-1/PD-L1在腫瘤治療中已被用來調(diào)節(jié)和改善患者免疫系統(tǒng)活性。PD-1抑制劑可用以調(diào)節(jié)2型糖尿病患者的T細(xì)胞衰竭[23]。而在本次研究中，向糖尿病大鼠腹腔注射人源化PD-1抗體進(jìn)行治療，試圖探索阻滯PD-1/PD-L1信號(hào)是否能夠緩解糖尿病大鼠過度活化的Treg細(xì)胞，改善糖尿病足潰瘍的免疫功能缺陷狀態(tài)。結(jié)果顯示，與模型組相比，給予PD-1抗體治療后的治療組大鼠，CD8+T細(xì)胞明顯回升，說明CD8+T細(xì)胞耗竭得到了緩解；同時(shí)，Treg細(xì)胞數(shù)量也明顯回落。進(jìn)一步地對(duì)對(duì)照組、模型組和治療組大鼠的糖尿病足潰瘍組織進(jìn)行了HE染色和病理學(xué)分析結(jié)果顯示，與模型組相比，治療組大鼠的潰瘍創(chuàng)口明顯長出新生表皮組織和肉芽組織，傷口愈合程度明顯好于模型組。這一結(jié)果說明，腹腔注射PD-1抗體，能夠阻滯Treg細(xì)胞表面PD-1的免疫調(diào)節(jié)信號(hào)，使其調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和促進(jìn)組織再生過程中發(fā)揮更為積極的作用。

高血糖不僅可以引起大血管、微血管病變，導(dǎo)致新生血管發(fā)生障礙，還能在慢性炎癥的持續(xù)過程中，通過組織中高水平的TNF-α和IL-1β激活基質(zhì)金屬蛋白酶，破壞組織的基底膜，導(dǎo)致破損的組織難以愈合[24]。根據(jù)ELISA結(jié)果顯示，與模型組相比，治療組大鼠創(chuàng)口處TNF-α和IL-1β的水平明顯降低。這很有可能是因?yàn)檫^度活化的Treg細(xì)胞被有力抑制后，其調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方向由促炎性免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)向了抑制炎癥和促進(jìn)傷口愈合的方向，具體表現(xiàn)為TNF-α和IL-1β的分泌水平的下降。這一結(jié)果進(jìn)一步說明了PD-1抗體在治療糖尿病足潰瘍中具有積極的作用。

盡管在本次研究中，未對(duì)模型組和治療組大鼠脾臟中各種分化后的T細(xì)胞類型進(jìn)行全面檢測，以探討PD-1抗體治療對(duì)幼稚T細(xì)胞分化的具體影響，及這種影響是否會(huì)作用于糖尿病足潰瘍的愈合過程。但本研究的結(jié)果初步顯示了DP-1抗體治療糖尿病大鼠模型足部潰瘍的價(jià)值。同時(shí)，由于人源化PD-1抗體在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用，其安全性也得到了肯定，進(jìn)一步將其應(yīng)用于治療糖尿病足潰瘍，具有很大的臨床應(yīng)用潛力。總之，本次研究初步證明，應(yīng)用人源化PD-1抗體能夠明顯升高糖尿病大鼠模型的CD8+T細(xì)胞、下調(diào)Treg細(xì)胞數(shù)量，抑制足部潰瘍處TNF-α和IL-1β的分泌并促進(jìn)創(chuàng)口愈合。

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[收稿日期]2022-07-11

本文引用格式：黃亞蓮，劉瑩，賴舒暢，等.PD-1抗體調(diào)節(jié)糖尿病大鼠CD8+T細(xì)胞和Treg平衡促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合的療效研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2023，32（6）：94-98.