安徽省兩棲動(dòng)物新記錄種
——秉志肥螈

黃平倩， 汪帆， 魯航， 榮鵬， 肖祥寅， 張方， 黃松， 吳孝兵， 李冰欣 ， 陳進(jìn)民

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000）

肥螈屬PachytritonBoulenger， 1878 隸屬兩棲綱Amphibian有尾目Caudata蠑螈科Salamandridae，是中國(guó)的特有類群，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南的亞熱帶地區(qū)，包括浙江、江西、福建、安徽、湖南、廣東、廣西和貴州等，棲息于山區(qū)森林溪流中（中國(guó)兩棲類，2022）。目前，肥螈屬已知10 種，除秉志肥螈P. granulosus和黑斑肥螈P. brevipes外，其他8 種均為近10 余年發(fā)表的新物種（Liet al.，2018；Frost，2022；中國(guó)兩棲類，2022）。

安徽省的肥螈屬目前已知費(fèi)氏肥螈P. feii1種（Frost，2022；中國(guó)兩棲類，2022），其是2011 年根據(jù)安徽黃山標(biāo)本命名的新物種，目前分布于安徽南部及其相鄰的江西東北部地區(qū)（Nishikawaet al.，2011；Wu & Murphy，2015）。本研究在安徽省黃山市休寧縣馬金嶺自然保護(hù)區(qū)發(fā)現(xiàn)秉志肥螈，為安徽省兩棲類新記錄，此次發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探討肥螈屬同域物種分化提供了素材。此外，本研究將秉志肥螈的分布區(qū)域拓展至白際山脈，為肥螈屬的生物地理學(xué)研究提供了基礎(chǔ)資料，對(duì)皖南及其周邊地區(qū)生物區(qū)系與地質(zhì)史研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

6 號(hào)肥螈標(biāo)本（3♂3♀）于2022 年7—8 月采自安徽省黃山市休寧縣馬金嶺自然保護(hù)區(qū)（118°18′28.42″E，29°31′56.33″N，海拔445 m）。經(jīng)安樂(lè)死后，取肝臟組織保存于95%乙醇溶液中；整體標(biāo)本以10%甲醛溶液固定后，清水沖洗，75%乙醇溶液保存。標(biāo)本及組織樣品現(xiàn)均保存于安徽師范大學(xué)（ANU）。

1.2 形態(tài)鑒定與測(cè)量

形態(tài)測(cè)量指標(biāo)和外部形態(tài)描述主要參考費(fèi)梁等（2012）、Wu 等（2012）、Yuan 等（2016）、Li 等（2018）的方法。用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量標(biāo)本的24個(gè)形態(tài)指標(biāo)（精度0.1 mm）：頭體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、頭寬、頭高、吻長(zhǎng)、眼徑、眼間距、鼻眼距、鼻間距、肩寬、前肢長(zhǎng)、后肢長(zhǎng)、尾寬、尾高、第一指長(zhǎng)、第二指長(zhǎng)、第三指長(zhǎng)、第四指長(zhǎng)、第一趾長(zhǎng)、第二趾長(zhǎng)、第三趾長(zhǎng)、第四趾長(zhǎng)和第五趾長(zhǎng)。

1.3 DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

使用常規(guī)酚/氯仿抽提法（Sambrooket al.，1989）提取樣品基因組DNA 后，?20 ℃保存?zhèn)溆谩⒄誛u 等（2010）的方法進(jìn)行cyt b基因片段的PCR 擴(kuò)增和測(cè)序。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送安徽通用有限公司雙向測(cè)序。

1.4 分子系統(tǒng)發(fā)育研究

使用DNASTAR LASERGENE 7.0（Burland，2000）的SeqMan 對(duì)測(cè)序獲得的雙向序列峰圖進(jìn)行正反鏈互補(bǔ)和人工校對(duì)。將獲得的新序列在Gen?Bank上進(jìn)行BLAST 分析，然后搜索序列同源性，確保新獲得的序列是目標(biāo)DNA 片段。確認(rèn)后在Gen?Bank 中下載肥螈屬所有物種cyt b基因的代表序列，并以東方蠑螈Cynops orientalis和棕黑疣螈Tylototriton verrucosus為外群（表1），使用MEGA 7（Kumaret al.，2016）比對(duì)序列。使用貝葉斯法（BI 法）和最大似然法（ML 法）同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用JModelTest 0.1.1（Posada，2008）基于AIC標(biāo)準(zhǔn)選擇最適核苷酸替代模型。運(yùn)用MRBAYES 3.2（Ronquist & Huelsenbeck，2003）構(gòu)建BI 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，共運(yùn)行2 000 萬(wàn)代，每1 000 代進(jìn)行1 次抽樣。通過(guò)Tracer 1.7（Rambautet al.，2018）中的有效樣本量判斷結(jié)果是否收斂?；谑諗康那闆r，舍棄前25% 代數(shù)。運(yùn)用RaxML（Stamatakis & Hoover，2008）構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行1 000 bootstrap 重抽樣分析。肥螈屬物種間的遺傳距離采用MEGA 7基于P-distances距離模型進(jìn)行計(jì)算。

表1 樣品信息表Table 1 Information of samples used in this study

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)描述

標(biāo)本經(jīng)形態(tài)測(cè)量（表2）和檢視，均符合秉志肥螈的鑒定特征。體型肥壯；頭呈橢圓形、扁平，側(cè)面無(wú)棱脊，頭寬小于頭長(zhǎng)；吻部較長(zhǎng)，端圓；鼻孔小且距離吻端極近，吻長(zhǎng)大于鼻間距、鼻眼距；咽喉部有縱褶膚，頸部有明顯的褶皺；唇褶發(fā)達(dá)，上下頷有細(xì)齒，犁骨齒列呈“Λ”形，枕部有“V”形隆起，但不明顯。皮膚光滑，軀干至尾基部呈圓柱狀；背腹略扁平，脊背部位沒(méi)有隆起而略成縱溝；肋溝11 條左右，部分個(gè)體身體兩側(cè)有細(xì)的橫皺紋，腹部有橫皺溝。

表2 安徽馬金嶺自然保護(hù)區(qū)的秉志肥螈標(biāo)本的形態(tài)量度Table 2 Measurements of Pachytriton granulosus collected from the Majinling Nature Reserve， Anhui

頭體、四肢背面褐色，無(wú)黑色斑點(diǎn)；頭體腹面橘紅色，有少數(shù)不規(guī)則的褐色短紋或呈蠕蟲(chóng)狀斑；四肢腹面、肛孔，以及尾巴下緣、尾巴腹面橘紅色（圖1）。尾基部寬厚，后半段逐漸側(cè)扁，末端呈鈍圓狀，尾部有細(xì)的橫皺紋，尾背鰭?cǎi)捱_(dá)體背前方；雄性肛部有明顯隆起，肛孔縱長(zhǎng)，內(nèi)壁有乳突；雌性肛部隆起不顯著，肛孔較短，內(nèi)壁無(wú)乳突。四肢粗短，前肢比后肢短且細(xì)。指長(zhǎng)順序?yàn)?>2>4>1，第一指較其他指短小；趾長(zhǎng)順序?yàn)?>4>2>5>1，第一趾和第五趾較其他趾短??；指趾末端均具緣膜，無(wú)角質(zhì)鞘（圖2）。

圖1 安徽馬金嶺自然保護(hù)區(qū)的秉志肥螈活體照Fig. 1 Pachytriton granulosus from Majinling Nature Reserve， Anhui

圖2 安徽馬金嶺自然保護(hù)區(qū)的秉志肥螈手（a、 c）與足（b、 d）形態(tài)（標(biāo)本號(hào)：ANU000501）Fig. 2 Hand （a， c） and foot （b， d） of Pachytriton granulosus （voucher No. ANU000501）from the Majinling Nature Reserve， Anhui

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

cyt b基因序列長(zhǎng)1 107 bp?；贐I法和ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致（圖3）。本次采自安徽省黃山市休寧縣馬金嶺自然保護(hù)區(qū)的6號(hào)標(biāo)本屬于同一個(gè)譜系，與秉志肥螈的樣本聚為一支，且得到支持（BPP>95%；BS>70%），該譜系還包括浙江安吉龍王山、浙江臺(tái)州市天臺(tái)山、浙江寧海西天目山和浙江淳安金紫尖種群。此外，基于P?distance距離模型計(jì)算的肥螈屬的遺傳距離顯示，采自安徽黃山馬金嶺自然保護(hù)區(qū)的肥螈標(biāo)本與秉志肥螈的遺傳距離最近，與來(lái)自浙江寧海西天目山的遺傳距離只有0.1%（表3），分子系統(tǒng)學(xué)結(jié)果支持采自安徽省黃山市休寧縣馬金嶺自然保護(hù)區(qū)的6號(hào)標(biāo)本均為秉志肥螈。

圖3 基于線粒體cyt b基因序列構(gòu)建的肥螈屬貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Bayesian inference phylogenetic tree of the genus Pachytriton based on mitochondrial cyt b gene

表3 基于線粒體cyt b基因的肥螈屬物種間遺傳距離Table 3 Genetic distance among Pachytriton species based on mitochondrial cyt b gene

2.3 生境描述

本次采集到的秉志肥螈標(biāo)本分布在安徽省黃山市休寧縣馬金嶺自然保護(hù)區(qū)海拔445 m 瀑布下的深水潭里。深潭水流較緩，水質(zhì)清澈見(jiàn)底，水底多為落葉、石塊、泥沙等。水潭分布有小魚、水生無(wú)脊椎動(dòng)物等小型動(dòng)物。與其同域分布的兩棲類有棘胸蛙Quasipaa spinosa、黃山角蟾Boulenophrys huangshanensis、天目臭蛙Odorrana tianmuii等。植被和水體均保存較好，人為破壞程度較小。

3 討論

本文結(jié)合形態(tài)和分子證據(jù)揭示了安徽省兩棲類新記錄種：秉志肥螈，加上之前記錄的費(fèi)氏肥螈，目前安徽省記錄有2 種肥螈屬物種。形態(tài)上，費(fèi)氏肥螈和秉志肥螈的主要區(qū)別在體長(zhǎng)、腹面顏色和斑紋等（Nishikawaet al.，2011；費(fèi)梁等，2012）。在分子系統(tǒng)發(fā)育上，秉志肥螈與費(fèi)氏肥螈存在明顯的遺傳分化，證實(shí)了其形態(tài)學(xué)的鑒定。

本研究提示肥螈屬的物種分布格局值得進(jìn)一步研究，安徽省肥螈屬物種的分布情況有待厘清。秉志肥螈和費(fèi)氏肥螈可能存在同域共存現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，秉志肥螈分布區(qū)之前記錄的是費(fèi)氏肥螈（Wu & Murphy，2015；中國(guó)兩棲類，2022），這2個(gè)物種對(duì)棲息環(huán)境需求相似，是否存在同域物種分化及其進(jìn)化機(jī)制是未來(lái)的研究方向。

本次發(fā)現(xiàn)將秉志肥螈的分布區(qū)域拓展至白際山脈，為肥螈屬的生物地理學(xué)研究提供了重要基礎(chǔ)資料。秉志肥螈歷史記錄分布于浙江和福建山區(qū)（費(fèi)梁等，2012；Wu & Murphy，2015）。肥螈屬的物種分布格局與山脈水系變遷有著緊密的聯(lián)系，本發(fā)現(xiàn)對(duì)于皖南及其周邊地區(qū)生物區(qū)系與地質(zhì)史研究具有重要意義。