湖北花楸種胚離體培養(yǎng)與快繁技術研究

劉良夢, 趙桃娟, 黃 振, 劉 欣, 丁 婷, 陳 炙, 左燕平

(四川省林業(yè)科學研究院/森林和濕地生態(tài)恢復與保育四川省重點實驗室, 成都 610081)

湖北花楸(Sorbushupehensisc. K. Schneid.)別名雪壓花,薔薇科花楸屬落葉喬木,耐寒冷,天然分布于中國中西部地區(qū),常以單株形式混生于闊葉林中,尚未發(fā)現(xiàn)湖北花楸種群。湖北花楸是阿壩州著名的彩葉樹種,秋季滿樹紅葉,葉落后白果滿枝頭,極具觀賞價值,是彩葉林帶的骨干樹種。

發(fā)展生態(tài)旅游,優(yōu)化彩葉林帶樹種結構,是阿壩州鄉(xiāng)村振興的重要內容,而培育以湖北花楸為代表的彩葉樹種種苗是彩葉林高質量發(fā)展的基礎。目前,尚未有湖北花楸種苗批量化培育的報道,花楸屬種子的休眠[1]現(xiàn)象是種子繁育的主要障礙。因此,開展湖北花楸組織培養(yǎng)研究,建立黑水花楸組培再生技術體系,是實現(xiàn)黑水花楸規(guī)模化育苗的有效途徑。目前,花楸屬的組織培養(yǎng)僅在少數(shù)種上獲得成功,朱虹等[2]以當年生嫩梢為外植體、馬盈等[3]以腋芽為外植體、盧芹[4]以帶芽莖段和葉片為外植體,建立了歐洲喬木花楸組織培養(yǎng)再生體系;劉行等[5]、張成霞等[6]以種子為外植體,將無菌苗的嫩芽作為增殖材料獲得了黑果腺肋花楸生根苗,而湖北花楸組織培養(yǎng)尚未見報道。本研究以湖北花楸種子為外植體,研究了激素類型和濃度對種胚萌發(fā)、叢生芽誘導、幼苗生根的影響,建立湖北花楸組培再生技術體系,為湖北花楸優(yōu)樹資源的開發(fā)和利用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

采樣母株位于阿壩州黑水縣沙石多鄉(xiāng)干斯壩村302省道邊(32°5′21.10″N,102°46′58.61″E),挑選無病害、圓潤飽滿的果實,搓洗掉果肉,在超凈工作臺上把種子放入0.1%氯化汞消毒10 min,無菌水洗4次后,剝離種皮,取出完整種胚,轉入MS+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠的初代培養(yǎng)基中暗培養(yǎng),7 d后淘汰污染材料,無菌種胚轉入誘導培養(yǎng)基。

1.2 誘導培養(yǎng)基篩選

無菌種胚平鋪在添加不同濃度(0.25 mg/L和0.5 mg/L)6-芐基腺嘌呤(6-BA)、(0.05 mg/L和0.1 mg/L)吲哚丁酸(IBA)或(0.05 mg/L和0.1 mg/L)萘乙酸(NAA)組合的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d,每瓶接種1個種胚,每個處理接種10瓶,重復4次。30 d后統(tǒng)計平均萌發(fā)率并觀察生長表現(xiàn)。

1.3 增殖培養(yǎng)基篩選

將1.2獲得的萌芽切成1.5 cm長,帶有2～3個腋芽的莖段,把莖段轉入添加了不同濃度(0.25,0.5 mg/L和1.0 mg/L)6-BA和(0.02,0.04 mg/L和0.06 mg/L)IBA組合的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d,每瓶接種10個帶芽莖段,每個處理接種5瓶,重復4次。30 d后統(tǒng)計每個處理平均增殖率和平均芽誘導數(shù)并觀察生長表現(xiàn)。

1.4 生根培養(yǎng)基篩選

將有效芽苗(高≥1.5 cm、葉片數(shù)≥3)從莖段上切下轉入添加了不同濃度(0,0.1,0.5,1.0 mg/L)NAA和(0,0.04,0.1 mg/L)IBA組合的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d。每個處理接種5瓶,每瓶10株,重復4次。30 d后統(tǒng)計各處理的平均生根率、平均生根數(shù),綜合芽苗生長表現(xiàn),篩選最佳生根培養(yǎng)基。

1.5 培養(yǎng)條件

除特殊說明外,培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度(25±2)℃,光照強度為2 500 lx,光照周期12 h/d。培養(yǎng)基均添加30.0 g/L蔗糖和7.0 g/L卡拉膠,pH值為5.8。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

平均萌發(fā)率/%=(每瓶芽正常萌發(fā)的苗總數(shù)/每瓶種胚數(shù))×100%;

平均芽誘導數(shù)=每瓶上誘導出的芽總數(shù)/每瓶外植體數(shù);

平均增殖率/%=(每代有效莖段數(shù)/初始接種莖段數(shù))×100%;

平均生根率/%=(每瓶中能生根的芽苗數(shù)量/接種芽數(shù))×100%;

平均生根數(shù)=每株苗基部萌發(fā)的長度≥1.5 cm、清洗不脫落的不定根數(shù)/生根芽苗數(shù)。

采用DPS 16.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進行Tukey法單因素方差分析,百分數(shù)采用反正弦平方根轉換后再進行方差分析。

2 實驗結果

2.1 誘導培養(yǎng)基篩選

飽滿的湖北花楸種子去種皮后種胚完整度高(圖2 B),沒有敗育現(xiàn)象,說明自然狀態(tài)下的種子難萌發(fā)不是由于種胚發(fā)育不完全所致,組培前處理去掉的外種皮可能是抑制種子萌發(fā)的主要障礙之一。而培養(yǎng)在不含激素的ck處理中的種胚平均萌發(fā)率僅5%,說明種胚存在休眠現(xiàn)象,需要外源激素的刺激打破休眠。

種胚接種到誘導培養(yǎng)基上2 d后開始萌動(圖2 C),子葉伸展,隨后子葉顏色逐漸由白變綠(圖2 D),15 d時下胚軸生長出胚根,胚根往下彎曲生長至培養(yǎng)基內部,胚軸延長將子葉往上抬,使得子葉脫離培養(yǎng)基表面(圖2 E黑三角處),同時胚芽發(fā)育出真葉(圖2 E箭頭處)。

萌發(fā)的種胚在不同誘導培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)差別較大,不同誘導培養(yǎng)基的種胚平均萌發(fā)率存在顯著差異(表1)。IBA對種胚的萌發(fā)率影響較大,6-BA則對種胚萌發(fā)后芽的生長影響較大,NAA對種胚的萌發(fā)或有抑制作用,ck的種胚萌發(fā)率僅為5%。

表2 湖北花楸莖段在不同增殖培養(yǎng)基中的生長表現(xiàn)Table 2 Growth performance of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. stems in different proliferation media

1～4號誘導培養(yǎng)基中添加的6-BA濃度為0.25 mg/L。1號培養(yǎng)基添加0.05 mg/L IBA,芽生長正常(圖1 A),平均萌發(fā)率達90%;隨著IBA濃度升高為0.1 mg/L,2號培養(yǎng)基中芽正常生長,平均萌發(fā)率降低至85%,但與1號培養(yǎng)基的種胚平均萌發(fā)率差異不顯著。3號培養(yǎng)基添加0.05 mg/L NAA,平均萌發(fā)率為12.5%,已萌發(fā)胚芽的頂芽在長出1～2片真葉后生長停滯(圖1 C),胚根逐步變黑并死亡(圖1 D),隨著NAA濃度升高為0.1 mg/L,平均萌發(fā)率降至5%;4號培養(yǎng)基中,下胚軸稍微膨大后即褐化死亡(圖1 E箭頭處)。

注:A為誘導培養(yǎng)基1中胚芽明顯伸長的外植體;B為誘導培養(yǎng)基2中的外植體,胚芽伸長不明顯;C為誘導培養(yǎng)基3中的外植體,黑三角示未伸長的胚芽;D為誘導培養(yǎng)基3中的異常外植體,箭頭示胚根黃化,黑三角示胚芽未伸長;E為誘導培養(yǎng)基4中的外植體,箭頭示下胚軸褐化死亡;F為誘導培養(yǎng)基5中的外植體,胚芽伸長生長,黑色框為兩個新芽特寫;G為誘導培養(yǎng)基6中的外植體,下胚軸生長快,胚芽伸長生長,箭頭示新生葉片易枯黃;H為誘導培養(yǎng)基7中的異常外植體,胚芽未發(fā)育(黑三角處),子葉和下胚軸發(fā)育;I為誘導培養(yǎng)基8中的死亡外植體,胚芽稍伸長,子葉褐化,箭頭示頂芽。圖1 湖北花楸種胚在不同誘導培養(yǎng)基中的典型表現(xiàn)Fig.1 Typical performance of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. seed embryos in different induction media

注:A為帶種皮的湖北花楸種子;B為去掉種皮的湖北花楸種胚,箭頭示下胚軸;C為湖北花楸種胚接種2 d,箭頭示子葉;D為湖北花楸接種7 d,箭頭示子葉變綠;E為湖北花楸接種15 d,箭頭示真葉。圖2 湖北花楸種胚在5號誘導培養(yǎng)基上的萌發(fā)過程Fig.2 Germination process of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. embryo on No.5 induction medium

5～8號誘導培養(yǎng)基中添加的6-BA濃度為0.5 mg/L。5號培養(yǎng)基添加0.05 mg/L IBA,平均萌發(fā)率可達95%,顯著高于除1號誘導培養(yǎng)基以外的其他誘導培養(yǎng)基,部分胚苗頂芽的腋芽也會萌發(fā),腋芽強健,稍小于頂芽(圖1 F),胚苗長出4～8片深綠色真葉,胚根白色或淡黃色,根長2.0～4.0 cm;隨著IBA濃度升高為0.1 mg/L,平均萌發(fā)率降為82.5%,腋芽發(fā)生數(shù)減少,大部分只是頂芽萌發(fā),初始2片真葉翠綠,后續(xù)新芽發(fā)育異常,易枯黃,下胚軸下半部稍膨大,與培養(yǎng)基接觸部位呈黑灰色(圖1 G);7號培養(yǎng)基添加0.5 mg/L NAA,平均萌發(fā)率為10%,大部分胚芽不發(fā)育,子葉畸形,胚根不萌發(fā)(圖1 H),隨著NAA濃度升高為0.1 mg/L,平均萌發(fā)率為2.5%,種胚不萌發(fā)或種胚萌發(fā)中褐化死亡(圖1 I)。

綜上所述,5號誘導培養(yǎng)基為誘導湖北花楸種胚萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基。

2.2 增殖培養(yǎng)基篩選

由于在種胚誘導培養(yǎng)階段,NAA對胚芽的生長起抑制作用,而IBA促進胚芽的生長,故而在增殖階段設計6-BA與IBA組合試驗,在誘導培養(yǎng)基中添加0.25 mg/L 6-BA的基礎上,增加了IBA濃度的培養(yǎng)基組合,以篩選適宜于腋芽分化和生長的激素組合。

結果表明,湖北花楸莖段轉入不同增殖培養(yǎng)基后,平均增殖率和平均芽誘導數(shù)差異顯著。

1～3號增殖培養(yǎng)基中均添加了0.25 mg/L 6-BA,其中以添加0.04 mg/L IBA的2號增殖培養(yǎng)基中的莖段長勢最好,生長較快,莖長2.5～4.0 cm,芽豎直向上生長,適合作為生根材料,每個芽可切作2～3份增殖材料,平均誘導出2.08個芽,平均增殖率490.5%,老葉有黃化現(xiàn)象(圖3 B箭頭處),但不影響繼續(xù)培養(yǎng)。1號增殖培養(yǎng)基添加IBA濃度0.02 mg/L的芽生長相對緩慢,莖段細小,高度較2號增殖培養(yǎng)基矮,芽叢基部易褐化(圖3 A箭頭處),僅葉柄伸長并向上生長,平均增殖率為112.5%,幾乎沒有新的增殖材料;IBA濃度為0.06 mg/時L,莖段和芽幾乎不生長,葉彎曲生長(圖3 C箭頭處)。

注:A為增殖培養(yǎng)基1中的外植體,箭頭示莖段細且短;B為增殖培養(yǎng)基2中的外植體,植株健壯呈綠色,箭頭示植株基部葉變黃;C為增殖培養(yǎng)基3中的外植體,箭頭示葉彎曲;D為增殖培養(yǎng)基4中的外植體,箭頭示葉變黃;E為增殖培養(yǎng)基5中的外植體,黑三角示同一莖段出芽;F為增殖培養(yǎng)基6中的外植體,箭頭示葉寬大影響植株生長;G為增殖培養(yǎng)基7中的外植體,箭頭示葉彎曲變黃;H為增殖培養(yǎng)基8中的外植體,箭頭示葉卷曲枯黃死亡;I為增殖培養(yǎng)基9中的外植體。圖3 湖北花楸莖段在不同增殖培養(yǎng)基中的典型表現(xiàn)Fig.3 Typical performance of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. stems in different proliferation media

4～6號增殖培養(yǎng)基中均添加了0.5 mg/L 6-BA。5號增殖培養(yǎng)基添加0.04 mg/L IBA,莖段平均誘導4.1個芽,顯著高于其他處理,但莖段伸長并不明顯,莖長1.5～2.5 cm,大部分新芽在下一次的增殖中不能切為2份增殖材料,芽向上或向培養(yǎng)基內生長(圖3 E黑三角處);4號增殖培養(yǎng)基中的IBA濃度為0.02 mg/L,此時莖段伸長明顯,莖長2.5～3.0 cm,但葉片彎曲出現(xiàn)黃化(圖3 D箭頭處),平均芽誘導數(shù)1.34個;6號增殖培養(yǎng)基中的IBA濃度為0.06 mg/L,葉片變得寬大影響植株生長,甚至部分葉片接觸培養(yǎng)基后生長失控并將芽苗頂出培養(yǎng)基(圖3 F箭頭處),莖段幾乎不伸長生長,平均誘導出1.02個芽。

7～9號增殖培養(yǎng)基添加的6-BA濃度為1.0 mg/L時,莖段和芽均不生長,且葉卷曲黃化(圖3 G箭頭處),隨著IBA濃度升高,葉黃化加劇(圖3 H箭頭處),9號培養(yǎng)基中添加0.06 mg/L IBA,整個植株枯黃(圖3 I),植株生長受到抑制。

綜上所述,2號增殖培養(yǎng)基(MS+0.25 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IBA)、5號增殖培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IBA)為適宜的增殖培養(yǎng)基。

2.3 生根培養(yǎng)基篩選

由于增殖培養(yǎng)基中的芽叢誘導率高,為避免芽苗在生根中腋芽萌發(fā)增殖,因此在生根培養(yǎng)基中未添加6-BA,在增殖培養(yǎng)階段,IBA濃度0.04 mg/L的基礎上進行了調整(表3),并根據(jù)生根效果,增加了含NAA的組合。

表3 湖北花楸生根培養(yǎng)基篩選Table 3 Screening of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. rooting medium

1～3號生根培養(yǎng)基不添加NAA,1號生根培養(yǎng)基中未添加外源激素,結果表明,平均生根率僅為2%,芽苗幾乎不生根。2號生根培養(yǎng)基中含有與增殖培養(yǎng)基相同濃度的0.04 mg/L IBA,平均生根率為36.5%,但根系不完整,根數(shù)少,平均為1.52條根,多數(shù)芽苗僅產生1條根(圖4 A黑三角處)。IBA濃度為0.1 mg/L時,芽苗平均生根率降至1.5%;不添加IBA,芽苗平均生根率僅為2%。

注:A為生根培養(yǎng)基2中的芽苗,黑三角示一條根;B為生根培養(yǎng)基5中的芽苗,黑三角示不定根;C為生根培養(yǎng)基7中的芽苗,白色框為不定根和白色愈傷特寫;D為生根培養(yǎng)基7中的芽苗,黑三角示不定根;E為生根培養(yǎng)基8中的芽苗,箭頭示葉片透明;F為生根培養(yǎng)基10中的芽苗,箭頭示葉卷曲,黑三角示不定根。圖4 湖北花楸芽苗在不同生根培養(yǎng)基中的典型表現(xiàn)Fig.4 Typical performance of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. bud in different rooting media

4～6號生根培養(yǎng)基在1～3號生根培養(yǎng)基的基礎上,分別添加了0.1 mg/L NAA。結果發(fā)現(xiàn),4號生根培養(yǎng)基與1號生根培養(yǎng)基相比差異不顯著,芽苗基部亦無不定根分化。

5號生根培養(yǎng)基平均生根率為33%,與2號生根培養(yǎng)基相比差異不顯著,但芽苗平均根數(shù)為2.11條,顯著高于2號生根培養(yǎng)基中的芽苗平均根數(shù),但出根慢,培養(yǎng)30 d莖段已伸長至3.0～5.0 cm,才開始產生不定根,少數(shù)芽苗產生3條不定根(圖4 B黑三角處),而6號培養(yǎng)基中IBA濃度為0.1 mg/L,平均生根率反而下降至5%。繼續(xù)提高生根培養(yǎng)基中NAA濃度至0.5 mg/L,發(fā)現(xiàn)平均生根率顯著提高。7號生根培養(yǎng)基中未添加IBA,平均生根率達84%,芽苗基部先產生白色愈傷組織,然后愈傷組織分化出數(shù)條不定根(圖4 C白色框部分),芽苗平均根數(shù)可達4.41條,隨后不定根伸長生長,同時葉展開,芽苗向上生長,植株高3.5～5.0 cm,根長4.0～6.0 cm(圖4 D黑三角處)。8號生根培養(yǎng)基在此基礎上添加0.04 mg/L IBA后,平均生根率降低至43.5%,芽苗平均根數(shù)降至2.53條,說明芽苗生根受到抑制,同時葉片顏色變淺(圖4 E箭頭處);隨IBA濃度升高為0.1 mg/L,平均生根率下降至1%。

當生根培養(yǎng)基中NAA濃度為1.0 mg/L時,10～12號生根培養(yǎng)基中的芽苗生長均不正常,10號生根培養(yǎng)基中的芽苗葉片容易卷曲,基部先產生白色愈傷組織,隨后白色愈傷組織慢慢變黃,部分黃色愈傷分化出不定根(圖4 F黑三角處),平均根數(shù)為2.52條,根長2.0～4.0 cm,但不定根生長慢,隨IBA濃度升高,平均生根率和平均生根條數(shù)降低。

綜上所述,7號生根培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L NAA)為湖北花楸最佳生根培養(yǎng)基。

3 討 論

花楸屬植物樹型挺拔、葉色多變、果實宿存,是四季可賞的園林景觀優(yōu)良樹種[7],黑水花楸是川西高原地區(qū)原生花楸屬植物,是高原地區(qū)打造彩葉林的理想樹種。培育成片湖北花楸林是建設高質量“萬山紅遍,層林盡染”的有效途徑,因此,有必要通過組培快繁的方法,解決湖北花楸實生繁育困難的難題。

種子萌發(fā)是種胚培養(yǎng)獲得成功的關鍵[8]。沈海龍等[9]研究發(fā)現(xiàn),低溫沙藏可以解除花楸種子休眠;梁立東等[10]研究表明,西伯利亞花楸種子萌發(fā)率僅38.25%。本研究發(fā)現(xiàn),在合適的培養(yǎng)基中,離體胚可正常萌發(fā)成苗,而在不含激素的培養(yǎng)基中,種胚平均萌發(fā)率很低,需要外源激素打破休眠,誘導種胚萌發(fā)。

花楸屬植物增殖培養(yǎng)階段,激素類型和濃度不適應,幼苗葉片容易發(fā)生卷曲,或出現(xiàn)玻璃化等現(xiàn)象[11-12],導致有效芽數(shù)量低使得生根材料不足,既影響生根芽苗質量,也不利于繼續(xù)增殖培養(yǎng)。本研究發(fā)現(xiàn),IBA對芽生長的影響較大,且解決了湖北花楸增殖培養(yǎng)時出現(xiàn)的葉卷曲和玻璃化現(xiàn)象。

生根培養(yǎng)是組培快繁的最后環(huán)節(jié),是決定組培苗出圃時根系數(shù)量和活力的關鍵,生長素是植物生根的主要影響因素[13]。本研究通過添加不同濃度的NAA與IBA,發(fā)現(xiàn)芽苗在含有0.5 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基中可誘導出不定根,而IBA對芽苗不定根的誘導效果不明顯,在后續(xù)的研究中需要進一步優(yōu)化配方,減少愈傷組織的發(fā)生,直接誘導不定根從芽苗基部萌發(fā)。

本研究建立了湖北花楸種胚組培再生技術,與其他花楸屬植物組織培養(yǎng)研究結果不同,祁爽[14]研究表明,歐亞花楸芽苗在1/2 MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA培養(yǎng)基中生根最好;以一年生黑果腺肋花楸嫩枝為外植體誘導出腋芽,轉入MS+1.0 mg/L 6-BA+0.08 mg/L NAA培養(yǎng)基中增殖,該研究認為NAA和IBA組合有利于黑果腺肋花楸生根,芽苗在1/2 MS+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA培養(yǎng)基上平均生根率95%[15-16];陸爽等[17]認為,添加0.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基中黑果腺肋花楸芽苗生根率最高100%;陳士剛等[18]發(fā)現(xiàn),2.8 mg/L IBA適合艷麗花楸生根。說明不同花楸屬植物組培快繁技術之間的借鑒作用不大。

在構建了湖北花楸種胚快繁技術的基礎上,課題組將開展輕基質育苗試驗,并在川西高原開展無性系造林試驗,以構建完整的湖北花楸組培快繁和栽培技術體系。