靶向抑制Myc對小鼠LLC全細(xì)胞疫苗免疫原性的影響

張學(xué)明 王惠 錢冬萌 王斌

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266071)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一,患者的發(fā)病率和死亡率持續(xù)攀升［1］。盡管手術(shù)、放療、化療等方法可延長患者生存,但副作用和治療失敗的問題仍然存在。腫瘤免疫療法,尤其是全細(xì)胞疫苗研究備受關(guān)注［2-3］。通過對患者癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和處理,可制備出保留免疫原性的非活性全癌細(xì)胞顆粒疫苗。然而,由于腫瘤細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的抑制作用,使腫瘤細(xì)胞制備的疫苗治療效果受到影響［4］。

MYC家族由c-MYC、N-MYC和L-MYC組成,其中c-MYC和N-MYC在許多人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色［5］。MYC可以促使腫瘤細(xì)胞增殖并抑制免疫細(xì)胞浸潤［6］。已有研究表明靶向抑制MYC可增強(qiáng)黑色素瘤及神經(jīng)母細(xì)胞瘤的免疫原性,但在肺腺癌(LUAD)領(lǐng)域相關(guān)研究尚缺乏［7］。(+)-JQ1以及I-BET151均可以靶向抑制小鼠細(xì)胞中c-Myc和N-Myc表達(dá),兩者聯(lián)合使用后,其抑制作用會增強(qiáng)［7-9］。本研究通過數(shù)據(jù)庫分析MYC擴(kuò)增對人類LUAD細(xì)胞免疫原性的影響,同時在小鼠模型中通過給予靶向抑制Myc的小鼠Lewis肺癌(LLC)全細(xì)胞疫苗,探索其在激活小鼠免疫系統(tǒng)殺傷LLC細(xì)胞方面的效果。

1 材料和方法

1.1 LUAD組織和癌旁正常組織中免疫細(xì)胞浸潤豐度的比較

獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD患者(包含501例LUAD組織樣本和54例癌旁正常組織樣本)的基因表達(dá)矩陣,以LUAD組織中c-MYC和N-MYC表達(dá)量的中位數(shù)為界,將LUAD患者分為c-MYC高、低表達(dá)組以及N-MYC高、低表達(dá)組。并采用CIBERSORT R腳本計算LUAD組織和癌旁正常組織中不同免疫細(xì)胞的浸潤豐度,比較N-MYC高、低表達(dá)組之間以及c-MYC高、低表達(dá)組之間不同免疫細(xì)胞浸潤豐度。

1.2 試劑及動物和細(xì)胞

(+)-JQ1和I-BET151購自上海陶術(shù)生物科技公司。RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒購自上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司,干擾素-γ(IFN-γ)ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。6周齡雌性C57BL/6N小鼠45只,體質(zhì)量17～18 g,購自北京維通利華公司,許可證號:SCXK(京)2021-0006。小鼠LLC細(xì)胞系(上海ATCC公司)置于含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、雙抗(100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)混合溶液中,于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 CCK-8實驗確定LLC細(xì)胞的最佳紫外線照射時長

將生長狀態(tài)良好并占據(jù)皿底面積大約40%～50%的LLC細(xì)胞分為處理組和對照組,置于直徑為10 cm的圓形培養(yǎng)皿當(dāng)中。處理組LLC細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基中加入0.4 μmol/L的(+)-JQ1和0.4 μmol/L的I-BET151,對照組LLC細(xì)胞置于常規(guī)DMEM培養(yǎng)基中,均培養(yǎng)4 d。然后將兩組細(xì)胞置于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài);在培養(yǎng)皿中將兩組細(xì)胞均制備成濃度1×1010/L、高度1 mm的均勻懸液,置于搖床上以50 r/min的速度晃動細(xì)胞懸液,同時用波長為254 nm的紫外線對其進(jìn)行照射,照射時長分別為0、5、10、15、20、25、30 min。在照射LLC細(xì)胞不同時長后的第0、12、24小時,使用CCK-8試劑盒檢測LLC細(xì)胞的吸光度值,以評估LLC細(xì)胞的增殖活性。操作嚴(yán)格遵循說明書執(zhí)行,實驗重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LLC細(xì)胞中Myc和PD-L1 mRNA的表達(dá)

將培養(yǎng)4 d的對照組和處理組LLC細(xì)胞,用PBS制備成濃度為1×1010/L的均勻細(xì)胞懸液,紫外線照射兩組LLC細(xì)胞15 min后,立即用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,加入含有c-Myc、N-Myc和PD-L1引物的預(yù)混液進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。采用2-△△CT方法計算LLC細(xì)胞中目標(biāo)mRNA的相對表達(dá)水平,引物名稱及其序列見表1。每次實驗設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

表1 引物名稱及其序列

1.5 小鼠腫瘤模型的構(gòu)建

將培養(yǎng)4 d的對照組和處理組LLC細(xì)胞,用PBS制備成濃度為1×1010/L的均勻細(xì)胞懸液。紫外線照射兩組LLC細(xì)胞15 min后,立即與PBS以1∶1混合,得到對照組和處理組的LLC全細(xì)胞疫苗,4 ℃下儲存。將45只C57BL/6N雌性小鼠隨機(jī)均分為未免疫組(PBS組)、單純紫外線疫苗組(Irra組)、紫外線試劑處理疫苗組(Irra處理組),每組15只。所有小鼠第1天于左腋窩皮下接種5×105個LLC細(xì)胞,PBS組小鼠第5、12、19天于右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射200 μL PBS,Irra組小鼠第5、12、19天于右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射5×109/L對照LLC全細(xì)胞疫苗200 μL,Irra處理組小鼠第5、12、19天于右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射5×109/L處理組LLC全細(xì)胞疫苗200 μL。所有小鼠注射完成后均常規(guī)飼養(yǎng)。

每組小鼠隨機(jī)取出5只,隔1 d測量1次體質(zhì)量,隔2 d測量1次腫瘤體積,均測量至第25天,計算腫瘤體積(V)。V=腫瘤最長徑×腫瘤最短徑2×0.52。每組小鼠再隨機(jī)取出5只,以腫瘤直徑達(dá)到倫理閾值(15～20 mm)時為死亡終點,分別行全麻后脫頸處死。記錄小鼠生存期,采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。

1.6 ELISA方法檢測各組小鼠血清中促炎性因子TNF-α和IFN-γ的表達(dá)水平

每組小鼠隨機(jī)取出5只,在接種LLC全細(xì)胞疫苗第25天時,麻醉后眼球取血,脫頸處死,解剖分離小鼠的脾臟和腫瘤組織。將小鼠血液樣本室溫下放置2 h,置于水平離心機(jī)上4 ℃下以3 000 r/min離心15 min,收集血清,使用ELISA試劑盒檢測血清中TNF-α和IFN-γ水平,測試步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書中的要求進(jìn)行。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟以及腫瘤組織中CD3+CD8+/CD3+ T細(xì)胞比值

將3組小鼠的脾臟和腫瘤組織研磨后,以200目銅網(wǎng)過濾得到單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于96孔板中,每孔約1×106個細(xì)胞,每孔細(xì)胞中加入混合抗體(PE anti-mouse CD3、PE anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD8),4 ℃下孵育30 min。置于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測,采用FlowJo軟件(版本10.8.1)分析CD3+CD8+/CD3+T細(xì)胞比值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 LUAD組織和癌旁正常組織中免疫細(xì)胞浸潤豐度比較

通過TCGA數(shù)據(jù)庫計算LUAD患者的LUAD組織與癌旁正常組織中免疫細(xì)胞的浸潤豐度,結(jié)果顯示,與癌旁正常組織相比,LUAD組織內(nèi)CD8+T細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞、NK細(xì)胞及M0巨噬細(xì)胞的浸潤豐度顯著性降低(W=9 276～20 086,P<0.05),調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的浸潤豐度顯著升高(W=18 672,P<0.05);相較于N-MYC低表達(dá)組,N-MYC高表達(dá)組的激活CD4+記憶T細(xì)胞與激活NK細(xì)胞的浸潤豐度顯著降低(W=28 233、27 990,P<0.05),Tregs細(xì)胞的浸潤豐度顯著性升高(W=36 074,P<0.05);c-MYC高、低表達(dá)組之間比較,免疫細(xì)胞的浸潤豐度均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 LLC細(xì)胞的最佳紫外線照射時長

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與對照組相比,處理組LLC細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,細(xì)胞聚集程度明顯降低(圖1)。重復(fù)測量方差分析顯示,測量時點、照射時長及兩者的交互作用對細(xì)胞的吸光度值均有顯著影響(F=5.51～188.97,P<0.05)。單獨效應(yīng)分析顯示,在相同測量時點下,各組LLC細(xì)胞在照射時長為0、5、10、15 min時的吸光度值比較,差異均有顯著性(P<0.05)。在相同測量時點下,各組LLC細(xì)胞在照射時長為15、20、25、30 min時的吸光度值比較,差異均無顯著性(P>0.05);在相同的照射時長下,即15、20、25、30 min,各組LLC細(xì)胞在第0、12、24小時時的吸光度值比較,差異均無顯著性(P>0.05),見圖2。因此在經(jīng)過紫外線照射15 min的后第0小時時,兩組LLC細(xì)胞均失去了活性,故后續(xù)采用紫外線照射15 min后第0小時的LLC細(xì)胞制備LLC全細(xì)胞疫苗。

A:對照組,B:處理組,200倍

A:對照組,B:處理組

2.3 Myc與PD-L1 mRNA在對照組和處理組中的表達(dá)差異

RT-qPCR結(jié)果顯示,與對照組相比較,處理組LLC細(xì)胞c-Myc、N-Myc、PD-L1 mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(t=6.26～13.51,P<0.05),見表2。

表2 兩組LLC細(xì)胞的c-Myc、N-Myc、PD-L1 mRNA相對表達(dá)水平比較

2.4 小鼠模型中體質(zhì)量、腫瘤體積和生存期的分析

各組小鼠在接種LLC全細(xì)胞疫苗4～5 d后,左側(cè)腋窩處均出現(xiàn)腫瘤腫塊。重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示,測量時間對小鼠體質(zhì)量具有顯著影響(F=288.08,P<0.05),而分組和分組與測量時間交互作用對小鼠的體質(zhì)量均無顯著影響(P>0.05);單獨效應(yīng)分析顯示,同一個測量時點,3組小鼠的體質(zhì)量比較無顯著差異(P>0.05)。見圖3A。分組、測量時間以及兩者交互作用對小鼠的腫瘤體積均有顯著性影響(F=2.32～908.04,P<0.05);單獨效應(yīng)分析顯示,在接種LLC細(xì)胞后第19、22、25天時,Irra組小鼠腫瘤體積均顯著小于PBS組,Irra處理組小鼠腫瘤體積均顯著小于Irra組(P<0.05),見圖3B。

A、B、C分別為各組小鼠體質(zhì)量、腫瘤體積和生存期比較

Kaplan-Meier法分析各組小鼠的生存率,經(jīng)過Log-rank檢驗,3組小鼠的生存曲線比較差異有顯著性(χ2=20.60,P<0.05),其中Irra組優(yōu)于PBS組,Irra處理組優(yōu)于Irra組(P<0.05),見圖3C。

2.5 各組小鼠血清TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平比較

PBS組、Irra組和Irra處理組小鼠血清TNF-α的表達(dá)水平分別為(5.81±0.47)、(9.76±1.01)、(19.82±1.09)ng/L,PBS組、Irra組和Irra處理組小鼠血清IFN-γ表達(dá)水平分別為(19.54±2.44)、(35.84±1.75)、(75.31±4.83)ng/L。3組小鼠血清中TNF-α和IFN-γ的表達(dá)水平比較均有顯著差異(F=320.70、381.10,P<0.05),其中Irra組兩個指標(biāo)均顯著高于PBS組,Irra處理組均顯著高于Irra組(P<0.05)。

2.6 各組小鼠脾臟和腫瘤內(nèi)CD3+CD8+/CD3+ T細(xì)胞比值比較

PBS組、Irra組和Irra處理組小鼠脾臟組織中CD3+CD8+/CD3+T細(xì)胞比值分別為0.12±0.02、0.16±0.01、0.22±0.02,3組小鼠腫瘤組織中分別為0.13±0.01、0.21±0.02、0.30±0.01。3組小鼠脾臟和腫瘤中CD3+CD8+/CD3+T細(xì)胞比值比較均有顯著統(tǒng)計意義(F=54.83、143.70,P<0.05),其中Irra組脾臟和腫瘤組織中CD3+CD8+/CD3+T細(xì)胞比值均顯著高于PBS組,Irra處理組均顯著高于Irra組(P<0.05)。見圖4。

A:小鼠脾臟組織,B:小鼠腫瘤組織

3 討 論

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病和死亡率不斷上升。傳統(tǒng)治療方法,如手術(shù)、放療和化療,受到副作用和治療失敗的嚴(yán)重制約。近年來,腫瘤全細(xì)胞疫苗因其保留腫瘤細(xì)胞所有抗原逐漸受到關(guān)注。然而,由于對免疫系統(tǒng)的抑制作用,全細(xì)胞疫苗的治療效果仍然受到很大限制。因此,尋找一種簡單有效的方法以提高腫瘤全細(xì)胞疫苗的免疫原性變得尤為重要。

已有的研究顯示,抑制致癌基因MYC可以提高黑色素瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的免疫原性。然而,在LUAD領(lǐng)域,相關(guān)研究仍然缺乏。本研究對LUAD細(xì)胞及其MYC擴(kuò)增表達(dá)在腫瘤微環(huán)境(TME)中對免疫細(xì)胞的影響進(jìn)行了探討。首先,本研究對比分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中的LUAD組織樣本和癌旁組織樣本間免疫細(xì)胞浸潤差異。研究發(fā)現(xiàn),LUAD組織中CD8+T細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞、NK細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞的浸潤豐度顯著性降低,而激活Tregs細(xì)胞的浸潤豐度顯著提高。在這些免疫細(xì)胞中,CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞具有直接殺死腫瘤的能力,而CD4+記憶T細(xì)胞參與長期免疫應(yīng)答,并且協(xié)助其他免疫細(xì)胞(如CD8+T細(xì)胞)發(fā)揮抗腫瘤作用［10-13］。然而,在TME中,Tregs細(xì)胞通常對腫瘤的增長和擴(kuò)散具有促進(jìn)作用［14］。這些研究結(jié)果表明,LUAD細(xì)胞能有效地抑制TME中的免疫細(xì)胞對其進(jìn)行的攻擊和持續(xù)免疫反應(yīng)。其次,本研究又進(jìn)一步在LUAD組織c-MYC高、低表達(dá)樣本以及N-MYC高、低表達(dá)樣本間進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)c-MYC高、低表達(dá)樣本間免疫細(xì)胞浸潤豐度無差異,而在N-MYC高表達(dá)樣本中,CD4+記憶T細(xì)胞和激活NK細(xì)胞浸潤豐度顯著降低,Tregs細(xì)胞浸潤豐度顯著提高。這表明N-MYC基因的過度表達(dá)可能會進(jìn)一步加強(qiáng)LUAD細(xì)胞抵抗TME中免疫細(xì)胞的攻擊和持久免疫響應(yīng)能力。

鑒于上述N-MYC在TME中的影響,將MYC視為提高LUAD全細(xì)胞疫苗免疫原性的潛在靶點具有重要的研究意義。為了對人類LUAD免疫治療提供參考,本研究在小鼠LLC細(xì)胞和小鼠模型中進(jìn)行了相關(guān)全細(xì)胞疫苗的實驗研究。

(+)-JQ1和I-BET151是兩種重要的Myc抑制劑,它們聯(lián)合使用會對Myc的抑制作用增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示,(+)-JQ1和I-BET151與LLC細(xì)胞共培育4 d后,LLC細(xì)胞中c-Myc和N-Myc的表達(dá)量顯著下降,并且PD-L1的表達(dá)量也顯著下降。PD-L1蛋白位于細(xì)胞表面,通過與其受體PD-1結(jié)合,可以抑制免疫細(xì)胞的活性,從而阻止其對腫瘤細(xì)胞的攻擊。研究表明,約30%～50%的LUAD患者腫瘤細(xì)胞中可以檢測到PD-L1的過度表達(dá)［15-16］。這表明(+)-JQ1和I-BET151通過靶向抑制Myc使LLC細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)量顯著下降,從而減輕LLC細(xì)胞對TME的抑制作用。

目前,制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的手段主要包括熱滅活和輻射滅活(如使用紫外線、伽馬射線或X射線等輻射源處理腫瘤細(xì)胞)［17］。熱滅活法因溫度控制困難導(dǎo)致腫瘤抗原蛋白變性受到限制,而γ或X射線輻射方法受設(shè)備沉重、昂貴的影響,也限制了其廣泛應(yīng)用。盡管紫外線設(shè)備輕便且廉價,但透射性差限制了其使用。本研究通過設(shè)定1×1010/L細(xì)胞懸液濃度、1 mm高度并在搖床上以50 r/min搖晃,并進(jìn)行15 min的紫外線照射后,成功制備出LLC全細(xì)胞疫苗。采用這種方法制備的全細(xì)胞疫苗能夠最大限度地保留LLC細(xì)胞表面的腫瘤抗原及其免疫原性。

然后,本研究在小鼠模型中評估了針對Myc靶向抑制的LLC全細(xì)胞疫苗抵抗LLC的效果。相比接種無抑制劑處理的LLC全細(xì)胞疫苗,接種抑制劑處理的LLC全細(xì)胞疫苗可以使小鼠腫瘤增長明顯減緩,生存期也得到顯著提高。并且,接種抑制劑處理的LLC疫苗后小鼠脾臟和腫瘤內(nèi)CD3+CD8+/CD3+T細(xì)胞比值以及血清TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平均有顯著提高。CD3+CD8+T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)的主要成分,在免疫監(jiān)視過程中起到關(guān)鍵作用。CD3+CD8+T細(xì)胞能夠識別腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原并結(jié)合,激活CTLs,進(jìn)而釋放細(xì)胞毒性分子如穿孔素和顆粒酶B,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡［18］。此外,CD3+CD8+T細(xì)胞還能分泌細(xì)胞因子如TNF-α和IFN-γ,進(jìn)一步增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤的攻擊能力［19］。TNF-α和IFN-γ由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞等)分泌產(chǎn)生,通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長、抗血管生成以及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性等作用共同促使免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的清除。這些研究結(jié)果均表明,通過抑制Myc,能夠顯著增強(qiáng)LLC全細(xì)胞疫苗對免疫系統(tǒng)的激活作用,進(jìn)而提升免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。

綜上所述,本研究成功制備了針對Myc靶向抑制的LLC全細(xì)胞疫苗。在小鼠模型中,接種這種LLC全細(xì)胞疫苗可以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對LLC的攻擊能力,從而顯著減緩腫瘤的生長速度,延長小鼠的生存期。這一發(fā)現(xiàn)為應(yīng)用全細(xì)胞疫苗治療人LUAD提供了數(shù)據(jù)參考。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學(xué)實驗動物福利倫理委員會的審核批準(zhǔn)(文件號20220405C5718-202206097)。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》規(guī)定進(jìn)行。

作者聲明：所有作者參與了研究設(shè)計及論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。