種子微創(chuàng)取樣關鍵技術與裝備研究進展

周鳴川 劉傳杰 郭祥雨 舒慶堯 蔣煥煜,4 應義斌,4

(1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院, 杭州 310058; 2.浙江大學山東(臨沂)現(xiàn)代農業(yè)研究院, 臨沂 276000;3.浙江大學農業(yè)與生物技術學院, 杭州 310058; 4.浙江省農業(yè)智能裝備與機器人重點實驗室, 杭州 310058)

0 引言

隨著社會和經(jīng)濟的發(fā)展,我國對于農作物產(chǎn)品的需求快速增加,但是農作物產(chǎn)量無法跟上快速增長的需求,導致部分農作物缺口逐年加大,對國外進口依賴度持續(xù)攀升[1]。從2017年到2021年,我國玉米進口依賴度從1.29%提升到9.42%,小麥進口依賴度從0.34%驟升至6.67%[2-4],大豆進口依賴度常年80%以上[5]。如何提升農作物產(chǎn)量,降低糧食進口依賴成為農業(yè)面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。

種子被譽為農業(yè)的“芯片”,其中蘊含著植株性狀信息,是提升農作物產(chǎn)量,破解我國農業(yè)發(fā)展面臨的資源短缺和環(huán)境約束的關鍵[6]。在分子生物學迅速發(fā)展的大背景下,育種已經(jīng)從經(jīng)驗和大田實驗統(tǒng)計為主的傳統(tǒng)育種時代轉向更為精準化、高效化、智能化的設計生物育種時代[7-8]?；驑颖咎崛∽鳛樵O計生物育種的核心環(huán)節(jié),其取樣效率與質量會對后續(xù)基因檢測、幼苗培育環(huán)節(jié)產(chǎn)生直接影響。傳統(tǒng)種子樣本提取主要依賴人工操作,存在取樣強度大、切割一致性差等缺陷,制約了采樣品質的進一步提高[9]。種子切片裝備是借助機器視覺、機器人等技術,將混沌的種子群經(jīng)過種子分離、識別、運輸、取樣和樣品存放工序依次實現(xiàn)樣本精準采樣、有序存放的全流程自動化操作,相較傳統(tǒng)人工操作在效率和精度上都有顯著提升。因此,著力開發(fā)快速、方便、精準的種子切片裝備,實現(xiàn)在育種取樣中對種子遺傳信息的快速獲取,是促進育種行業(yè)高質量發(fā)展的重要保障。當前,孟山都科技公司(Monsanto Technology LLC)、先鋒高級育種公司(Pioneer Hi-Bred International,Inc.)等育種企業(yè)已研發(fā)出The Mega Chipper等規(guī)?；瘧玫姆N子切片機[10-11],并基于此建立了完善的育種基因檢測生產(chǎn)線,達到了降低育種成本與縮短周期的目標[12-13],提升了其商業(yè)競爭力。國內對于種子切片裝備的自主研發(fā)起步較晚、技術積累少,與國外相比技術上仍存在差距。

本文首先介紹國內外育種切片技術的歷史背景和裝備發(fā)展現(xiàn)狀,進而對種子分離、位姿調整、夾持輸送、取樣、樣品收集及清潔等技術方案的基本概況及存在問題進行闡述,最后結合種子切片裝備研發(fā)的困難和挑戰(zhàn),提出展望和建議。

1 種子切片檢測發(fā)展歷程

19世紀以來,隨著對遺傳學認知的深入,生命科學與生物技術的飛速發(fā)展,作物性狀與遺傳物質的內在聯(lián)系逐漸顯現(xiàn),分子生物育種技術迅速發(fā)展和成熟[14-15]。蛋白質組學(proteomics)、代謝組學(metabolomics)、高通量測序技術(next-generation sequencing technology)、轉錄組學(transcriptomics)等一系列底層技術的研發(fā),為分子層面育種提供了技術上的支持[16];農作物遺傳圖譜的陸續(xù)繪制,為基因性狀的篩選提供了理論參考[17]。因此,基于低成本高通量測序的分子育種技術已逐步成為當今最有效的育種途徑之一[18-19],推動育種向精準化、高效化、智能化方向發(fā)展。

分子育種的測序環(huán)節(jié)通常需要將待測定的種子萌發(fā)并培養(yǎng)至幼苗階段,對幼苗葉片的特定區(qū)域采集樣品,隨后送入實驗室進行相關的提取和分析。根據(jù)基因檢測所得到的結果,對樣品進行溯源,找到對應植株并做出特定培養(yǎng)[13]。植株在培養(yǎng)的過程中需要占用大量時間和場地,并且在育種群體中有80%以上的植株因基因型不符合預期需要丟棄[9],造成了資源的浪費。

以小麥種子為例,其主要由種皮、胚乳和胚3部分組成(圖1),其中胚乳是由胚珠經(jīng)過傳粉受精形成,其基因型與植株自身基因型保持一致,只需要提取單粒種子的胚乳進行基因檢測即可獲知該種子的全部基因信息[20]。因此,直接面向作物種子的無損切片基因樣本提取可以節(jié)省大量的土地水肥資源,縮短育種檢測周期[21]。

早在20世紀80年代,就有研究人員開展了面向種子直接采樣測序的研究[22]。期間,研究人員采用手工直接切割、鉆孔等方案獲得組織樣品粉末,進而檢測其基因型。針對水稻、大豆等種子的樣品檢測數(shù)據(jù)均表明,其結果與萌發(fā)后植株的基因序列基本無異,基因型一致性達99%以上[23-24],為種子切片檢測的科學性提供了理論依據(jù)。

面向種子的眾多取樣方法中,半粒種子法是最簡單,也是手工取樣中最常用到的方法。其步驟是將種子的一部分斬斷,沒有胚芽的一側粉碎后作為樣品送檢,有胚芽的一側則標記并存儲。若樣品檢測結果為目標基因型,會將有胚芽的一側挑選出來培養(yǎng)。

為了解半粒種子法切割后的種子活性情況,國內外學者分別對小麥、水稻、玉米、大豆等切割后的種子進行培養(yǎng)和觀察[23-30]。研究表明,切割后的種子生長和發(fā)育會存在一定程度延遲,但是存活率與正常種子基本無異,滿足大田培育的要求。CHUNWONGSE等[26]就小麥種子半切后的發(fā)芽率變化進行了對照試驗,結果表明,小麥半粒種子在8周后發(fā)芽率與完整種子相近,達到85%以上,若在種子萌發(fā)過程中添加適量殺菌劑可以減少種子傷口處真菌的污染,有助于半粒種子萌發(fā)率的提高(圖2a)。文獻[31]將浸泡后的大豆種子子葉和胚乳處分別切取大約5%的組織,調查記錄不同取樣部位對種子發(fā)芽情況的影響。試驗結果表明:與未處理的種子相比,微創(chuàng)取樣后的種子發(fā)芽率雖然有所下降,但總體發(fā)芽率仍能達到80%以上,與未處理的種子的發(fā)芽率相近,且發(fā)芽率與種子胚乳切割點位無明顯相關性(圖2b)。

圖2 種子萌發(fā)率統(tǒng)計

半粒種子法通常適用于粒徑較長或體積較大、胚芽集中在一側的種子,例如小麥、大麥、水稻,但是對于大豆等圓形種子,其外表光滑且不利于夾持,難以切割下樣品;對于番茄種子,其胚胎呈螺旋形狀,在對種子切割過程中難免損害到胚胎[26]?；诖祟惽闆r,一些研究人員開展了鉆孔法、刮取法等取樣操作形式。

比如VON POST等[32]使用直徑為1 mm的鉆頭從干燥的大麥種子中鉆孔,經(jīng)檢測種子提取樣品與葉片提取樣品的基因檢測結果相近。MOTOKAZU等[33]用電鉆在大豆子葉中央鉆孔,鉆孔后的大豆種子發(fā)芽率為98%,可以正常生長。SUASTE-DZUL等[34]使用雕刻切割機在棉花種子鉆取2.4 mm深的孔洞獲取到3.5 mg子葉樣品,鉆孔后的種子發(fā)芽率可達到98%。夏正俊等[35]針對水稻、大豆和玉米種子等作物鉆孔取樣時的鉆頭尺寸參數(shù)與獲取到的樣品質量進行統(tǒng)計,為鉆孔工具的選型提供了參考。綜上,使用鉆孔工具在種子胚乳區(qū)域鉆孔,可以避免對種子的胚軸造成傷害,每次可獲得3～30 mg樣品粉末,滿足樣本DNA總量的要求。這種方法解決了半切法種子難以徹底粉碎的問題,且取樣形式更為靈活,對種子形態(tài)適應性廣,取樣位置、取樣形狀可控,減少了對種子的傷害。

2 種子切片裝備研究進展

手工切片取樣的方式存在耗時長、效率低、取樣質量差等問題,不能滿足高通量育種檢測的需求,在分子育種規(guī)?？焖僭鲩L的背景下,迫切需要研發(fā)自動化種子切片裝備。

國外種子切片裝備起步較早,21世紀初,先鋒高級育種公司和孟山都科技公司就開展了相關裝備研發(fā)。2001年,先鋒高級育種公司率先在美國提出了自動化高通量種子樣品處理方案[36]。在此基礎上,孟山都科技公司于2003年在加拿大遞交了高通量自動化種子分析系統(tǒng)的專利申請[37],這是世界上公布的第一款功能完善的種子切片裝備。隨后美國陶氏益農公司(Dow AgroSciences LLC)[38]、先正達公司(Syngenta Participation Ag)[39]、利馬格蘭歐洲公司(Limagrain Europe S.A.)[40]、科迪華農業(yè)科技公司(Corteva Agriscience LLC)[41]等育種企業(yè)也加入了研發(fā)的隊列,種子切片裝備的研究趨于白熱化,各大育種企業(yè)爭相占領技術高地。但是種子切片裝備結構的復雜度高、集成難度大,樣機的制造進展緩慢。

直到2009年在安大略省伍德斯托克舉行的“Rural Coopavel”農場展上,孟山都科技公司首次對外展示了一款種子切片機(圖3a),該種子切片機可以快速準確地從單個種子上切下一小片樣品,然后進行DNA分析[42]。同年,孟山都科技公司在位于密蘇里州圣路易斯的總部內展出了另一款種子切片機“The Mega Chipper”(圖3b),該切片機主要用于玉米和大豆種子切片以進行基因型測試[11]。2012年,孟山都科技公司在巴西舉辦的“Rural Coopavel 2012”展會上展示了與“INTACTA RR2 PRO”作物研發(fā)配套的種子取樣系統(tǒng)(圖3c),該系統(tǒng)針對轉基因大豆種子無損取樣,縮短了作物育種周期[43]。2013年孟山都旗下的DEKALB Asgrow Deltapine公司展示了其Breeding HQ種子切片-基因檢測實驗室(圖3d、3e),該實驗室實現(xiàn)了種子從取樣、標記歸納、基因提取、檢測再到幼苗培育全流程自動化操作,每年可檢測超過1 300萬粒玉米種子的基因[44]。

圖3 國外種子切片裝備及其效果

目前,孟山都公司已研制玉米、大豆、棉花、甜瓜等多種農作物種子的自動化取樣裝備,取樣效果如圖3f所示[45],針對其它作物,如小麥、蔬菜的育種取樣機也在研發(fā)當中[42]。在種子切片裝備的助力下,孟山都的育種材料檢測效率從原先的3～4個月縮減至半個月以內[12-13]。

雖然國外已有成熟的種子切片裝備,但是其一直被種業(yè)巨頭內部壟斷,不對外提供任何技術服務和技術轉讓[7],國內長時間面臨無機可用的窘境,研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的種子切片裝備至關重要。近些年,隨著我國對育種技術的重視,種子切片裝備的相關研發(fā)逐漸提上日程。

2013年,中科院戰(zhàn)略性先導專項“作物種子激光切削與DNA快速提取技術”,開啟了我國種子取樣裝備研究,項目期間先后研制了“戰(zhàn)略先導一代”、“戰(zhàn)略先導二代”樣機[46](圖4a、4b),其采用機器人及相關控制技術設計了集種子精確送料、定位、分揀、存儲于一體的自動化設備,實現(xiàn)對種子的精細定位及切削操作,日切削能力達到水稻1 000粒、小麥2 000粒、玉米/大豆4 000粒[47]。2017年第四屆國際農業(yè)基因組大會上,中玉金標記公司公布了我國第一套商品化的種子切片機及挑選機(圖4c、4d),標志著我國分子育種在群體取樣技術和目標種子挑選技術方面實現(xiàn)了突破。該機型每天可至少完成4 000粒種子切片取樣,種子對照發(fā)苗率達95%以上[48]。2021年,福建建成作物全基因組選擇育種創(chuàng)新平臺,搭建出全國首臺國產(chǎn)商業(yè)化水稻種子切片機與高通量基因分型設備(圖4e),建成了近3 000 m2的水稻表型自動采集設施,每天可自動采集3×104個水稻基因及生長情況的相關數(shù)據(jù)[49]。2022年,由浙江大學牽頭的山東省重點研發(fā)計劃“小尺寸異形種子高通量全自動微創(chuàng)取樣關鍵技術研究及裝備研發(fā)”獲得立項[50],團隊提出了小尺寸異形種子取樣解決方案(圖4f),該方案基于機械臂搭建10軸力控切片平臺,可實現(xiàn)取樣、存儲、挑選于一體的全流程高效無損小麥種子取樣。

圖4 國內種子切片裝備樣機及方案

綜上,種子切片裝備的研發(fā)已成為業(yè)界共識,但是微創(chuàng)切割、高通量樣本輸送等關鍵技術尚不夠成熟,造成取樣精度差、樣品純度低等缺陷,限制了裝備的市場推廣和應用。

3 種子切片裝備關鍵技術

按照工藝流程,種子切片裝備的關鍵技術可分為種子分離、位姿調整、夾持輸送、種子取樣、樣品收集等關鍵技術(圖5)。其基本工作原理為:通過種子分離技術將種子群體分離成均勻的單粒種子流,位姿調整技術對單粒種子的姿態(tài)進行識別,獲取其外形和胚胎方向信息。隨后,通過夾持輸送技術應用機械臂將種子按照目標姿態(tài)送入取樣技術的既定取樣位點;取樣完成后的種子母體和分離開的種子樣品會由機械臂或其它物料輸送機構放入樣品收集裝置中,控制系統(tǒng)存儲樣品及種子所在料盤序號及孔位坐標。

圖5 種子切片裝備工藝流程

3.1 種子分離技術

種子分離技術可以將零散、無規(guī)則的種子群轉化為均勻連續(xù)的單粒種子,以便于姿態(tài)的識別和機械臂的精確抓取。常用的單?；N子分離技術按照其分離原理可大致分為機械式分離、氣力式分離、振動式分離。

3.1.1機械式分離

機械式分離采用機械限位的方法獲得所需種子流,主要包括充種、清種、投種等流程。充種環(huán)節(jié)使用槽穴等結構容納一定數(shù)量的種子;清種過程則使用氣流、毛刷等方式去除多余的種子,直至每個槽穴僅容納一粒種子;投種過程會將取出的單粒種子投放至下一工序。文獻[51]發(fā)明了一款分揀裝置(圖6a),采用臥式圓盤的結構,在圓盤的圓周分布有充種缺口,而每個充種缺口恰好只可以容納一顆種子,當充種缺口攜帶單粒種子旋轉到投種口時,種子從充種缺口分離投出。該方案結構簡單,但是通用性不足,多適用于大豆等外形規(guī)則的大顆粒種子。文獻[52]發(fā)明的自動種子取樣器(圖6b),使用活塞制動器進行取樣。單?；》N時,制動器驅動活塞伸入種子的料斗內,提取出一粒種子,提取到的種子在氣流下移動到料斗隔間,完成取種工作。

圖6 機械式分離典型結構圖

3.1.2氣力式分離

氣力式分離主要是利用真空氣泵產(chǎn)生的負壓為動力源,實現(xiàn)單粒種子的拾取和分離。文獻[53]在種子切片裝備的種子分離階段采用了分離輪結構(圖7a),分離輪沿周向均勻布置有真空氣孔,分離輪轉動時,真空氣孔依次通過充種室,將單粒種子吸附并固定,隨分離輪轉動。當真空氣孔轉動到對側的收集器時,氣孔的負壓停止,單粒種子釋放。文獻[54]在分離輪結構的進種口位置增加計數(shù)器,進一步實現(xiàn)了對種子數(shù)量進一步監(jiān)測與調整。由于分離輪結構的多個真空氣孔針共用負壓源,真空氣孔的負壓無法獨立調節(jié),易產(chǎn)生漏吸、多吸等缺陷。針對此類問題,文獻[55]發(fā)明了一款真空吸盤結構,通過單個吸盤負壓的精準調控,真空吸盤在料筒中可恰好吸取一粒作物籽粒。為了實現(xiàn)對種子分離過程工作質量的監(jiān)控,JAHNKE等[56]在設計移動拾取裝置的吸盤時,引入真空力反饋機制,吸嘴處壓力傳感器獲取吸盤實時氣壓,通過設定壓力閾值判斷吸盤是否完成落料或堵塞(圖7b)。文獻[57]將多個吸盤并聯(lián)在同一個機械臂上工作,在保證吸取質量的前提下,其工作效率得到極大提升。綜上,氣力式分離減少了機械式分離過程中對種子的機械力,在降低種子潛在損傷的同時具備較高的效率和單?；细衤?。

圖7 氣力式分離典型結構圖

3.1.3振動式分離

振動式分離單?；瘷C構通常采用電磁激振器或電磁鐵作為振動源,種子在滑槽運動的過程中,雜亂的種子堆會在振動力的作用下發(fā)生種子與種子、種子與滑槽間的相互作用,直至每粒種子都均勻平躺排列,達到其重心最低的狀態(tài)。劉彩玲等[58]研究的振動供種型孔輪式非圓種子精密排種器(圖8a),采用直線V型導槽,所容納的種子會在振動力的作用下調整為“側臥”姿態(tài),而導槽上方的梳種針會將多余的種子清理,僅容納單粒種子通過。研制的一種超級雜交稻壓電振動式勻種裝置(圖8b)[59],使用壓電振子對種盤施加高頻振動,水稻種子在振動板表面導槽的約束下,逐漸形成單列穩(wěn)定連續(xù)輸送的種子流,具有結構簡單、對種子損傷小、適應性強、工作效率高等優(yōu)點。

圖8 振動分離典型結構圖

導槽作為振動式分離的核心部件,起到引導種子均勻排序的作用。通常,導槽的長度越長,其出口處的種子排列質量越高。使用螺旋形的導槽代替直線導槽可以在單粒化機構保留較長導槽同時結構更為緊湊。黃小毛等[60]設計了一種螺旋導槽式振動供種裝置,主要由振動底座和料斗兩部分組成。工作時,電磁振動器發(fā)生高頻振動,種子沿導向槽緩慢移動。導向槽的結構為入口向出口逐漸收窄的喇叭狀,收至槽口僅可容納一粒稻種(圖8c),多余的種子在周期性高頻扭擺振動的作用力下從槽口掉落,實現(xiàn)單粒排列,該排種器對多品種種子均有良好的適應性。為了對種子單?；|量進行識別與分析,文獻[61]在螺旋供種裝置的上方加裝視覺相機,在出種口加裝門形檢測計數(shù)裝置(圖8d)。視覺相機用于判斷排種單?；|量,若質量不合格,則種子槽內部的止擋條會將種子清回充種室;門形檢測計數(shù)裝置用于統(tǒng)計輸種信息,控制器可以基于輸種信息對輸種間隔與速度進行調節(jié),供種精度進一步提高。

對于水稻、玉米等種子,由于其自身的形狀以及物理特性,振動排種器亦可以在單?；耐瑫r實現(xiàn)種子朝向的初步定位,且精度較高,定位率可達到89%以上。常見的方法有基于重心定向、基于外形定向、基于摩擦特性定向等。

例如,玉米種子的重心不位于形狀中心,在跌落時發(fā)生翻轉的概率也不盡相同。在種子滑動路徑設置合適尺寸的“臺階”,順行的種子跌落后保持原先姿態(tài),逆行的種子翻轉,從而實現(xiàn)方位的重新排布。王應彪等[62]基于電磁振動設計的玉米種子定向排序輸送裝置(圖9a)順行定向成功率為93.5%,逆行定向成功率為89.4%。張東興等[63]則是基于玉米種子的三角外形設計了判斷種子朝向的復合式調向機構,復合式調向機構安裝于振動排序裝置的軌道中部,種胚朝向符合的種子通過,種胚朝向不符的種子則被動調整方向或重新掉落到種倉。試驗表明該機構所選用馬齒形玉米種子的胚面定向成功率均大于91%(圖9b)。張斌等[64]對水稻種子摩擦特性及其對振動的響應進行研究發(fā)現(xiàn),水稻種子表面分布有由胚胎向種尖方向生長的種毛,其在不同方向運動時所受的摩擦力具有各向異性,即粗糙的平面上沿種尖方向的摩擦力小于指向胚胎方向受到的摩擦力。在受激振力、重力和摩擦力的復合作用下,稻種會沿觸點產(chǎn)生一定扭矩并發(fā)生轉向,朝向摩擦力較小的種尖方向?；谠摍C理,開發(fā)了可以實現(xiàn)稻種沿其長軸按胚胎方向定向排列的供種裝置,在振動試驗臺上測定定向排序成功率達95%以上(圖9c)。

圖9 定向排序單?；瘷C構

振動單?；b置具有較高的精度,但是對作業(yè)條件的要求更高。如果環(huán)境中有振動的干擾,會導致單?；认陆?。因此其使用范圍較為受限,需要安裝在隔振良好的平臺,且與易產(chǎn)生振動的機構有時間上或空間上的間隔。

3.2 位姿調整技術

如何避免胚的機械損傷,保證種子在取樣后順利萌發(fā)是種子取樣裝備設計的核心與難點。借助位姿調整技術,可以使取樣工具避開種胚的位置從而提高取樣效率以及保證取樣后種子的活性。種子因基因和生長環(huán)境的差異,每粒種子的尺寸與形狀都存在區(qū)別,因此種子的姿態(tài)調整具有一定的難度。位姿調整技術的研究集中在兩個方向,一是機械調整,即通過機械結構(例如型孔或仿形槽)實現(xiàn)種子按照單一或某種特定形式的朝向均勻排列,表1展示了機械調整典型技術原理及特點。另一個方向是視覺反饋控制法,基于圖像識別技術獲取種子的形態(tài)、顏色、紋理等特征并借助計算機完成種子的姿態(tài)估計,將種子姿態(tài)信息反饋給控制器驅動機械結構完成種子姿態(tài)的調整,實現(xiàn)機器視覺技術與自動化操作的精準對接。

表1 機械調整法典型技術原理與特點

視覺反饋控制法是以視覺技術為基礎,配合自動化操作完成種子姿態(tài)調整的方法。通過實時識別種子的姿態(tài),調整機械臂的末端執(zhí)行機構,完成種子姿態(tài)角度的閉環(huán)控制,從而保證較高的姿態(tài)調整精度。視覺控制法以圖像識別為核心,即快速準確地識別出種子的特征輪廓,進而解算其姿態(tài),因而具有適用場景廣、抗干擾能力強等優(yōu)勢。經(jīng)過研究人員的不斷積累與探索,已憑借其精準高效的優(yōu)勢在小麥、水稻、玉米等作物中廣泛應用。

圖10展示了視覺控制法在圖像識別環(huán)節(jié)的整體分類。按照成像設備類型,分為可見光成像、雷達成像、激光成像、紅外成像、X-射線數(shù)字成像、X-射線CT成像等。雷達成像和激光成像主要用于外部三維形態(tài)的直接獲取,受技術水平限制,存在分辨力偏低、耗時長等缺點,在毫米尺度成像的應用較少。由于可見光成像、雷達成像和激光成像等技術受限于提取種子表層顏色及輪廓特征,更深層次的內部組織分布無法解析。X-射線數(shù)字成像、X-射線CT成像等可以根據(jù)種子內部密度分布判斷空間內胚的位置,對種子胚的無損取樣有重要指導意義。由于X-射線傳感器安裝改造過程繁瑣復雜、測量不連續(xù),限制了其近些年的研究應用和推廣。表2總結了國內外種子成像研究成果,從表中可以看出,可見光成像是當今使用最普遍的方法,通過種子的二維可見光圖像,基于特征點算法可以快速獲取種子位置姿態(tài)等信息。

表2 國內外種子成像技術研究成果

圖10 圖像識別分類

傳統(tǒng)圖像處理可以對圖像進行顏色通道二值化、灰度化、分離顏色通道、閾值分割等處理,從而得到所需特征區(qū)域并獲取所需信息[75]。經(jīng)典機器學習起源于20世紀中期[76],是通過計算機算法來學習數(shù)據(jù)中包含的內在規(guī)律和信息,從而獲得新的經(jīng)驗和知識[77],發(fā)掘出高維數(shù)據(jù)背后隱藏的統(tǒng)計規(guī)律[78]。深度學習則是近年來由機器學習發(fā)展而來,作為數(shù)據(jù)中學習表示的一種新方法,強調從連續(xù)的深度網(wǎng)絡模型中進行學習,相較于經(jīng)典機器學習在分類預測的準確率、精確率、召回率有一定提升[79]。表3總結了種子姿態(tài)識別的研究進展。

表3 種子姿態(tài)識別研究進展

3.3 夾持輸送技術

種子經(jīng)位姿調整之后,為保證微創(chuàng)取樣的準確性,需要將種子可靠夾持并準確輸送到指定工作臺上。由于種子體積小,形狀各異,且易遭受機械損傷,如何提升夾持輸送的效率和質量是需要重點考慮的問題。

為解決上述問題,早期學者們嘗試使用往復或回轉運動機構來實現(xiàn)種子的夾持與輸送。孟山都公司[92]設計了一種自動無污染種子取樣器(圖11a),它由種子保持器提供的壓縮力固定種子,通過圓盤回轉運動將種子輸送至預定取樣位置,隨后機械手爪插入種子保持器并向兩邊擴張,種子不再受到壓縮力而釋放。這是自動化種子夾持輸送機構的雛形,適合流水線式作業(yè)。在此基礎上,先鋒公司對夾持和輸送的結構做出改進(圖11b),其采用負壓將定向后的種子夾持,隨后種子隨輸種滾筒旋轉輸送到切割位點。得益于多機構并聯(lián)工作,其工作效率進一步提升[93],但是夾持可靠性低、輸送成功率偏低的缺陷沒有得到解決。

圖11 夾持輸送技術

隨著數(shù)字化、自動化等相關技術的快速發(fā)展,機器人平臺不斷成熟并在生產(chǎn)中推廣普及,眾多學者將機器人系統(tǒng)引入到種子夾持與輸送環(huán)節(jié)當中,提高了輸送的效率和精準性。

文獻[57]基于直線式三軸機械臂實現(xiàn)了取種、運輸至切割臺再運動到種盤落料的全流程操作。針對直線式三軸機械臂動作范圍相對較小,設備空間因數(shù)較低的問題,文獻[94]使用SCARA四軸水平關節(jié)機械臂,基于視覺伺服技術對機械臂抓取與搬運軌跡矯正,提高了種子輸送精度。文獻[95]設計了雙臂協(xié)同運動的機器人系統(tǒng),當種子完成切割后,兩個機械臂分別抓取種子母體和切下的樣品放入對應編號的容器內,該方案抓取可靠,樣品不易發(fā)生丟失,但多機械臂協(xié)同運動控制會提高系統(tǒng)復雜度。

機械手爪作為機械臂的末端執(zhí)行機構,決定了夾持的可靠性。常見的微型手爪結構有二指機械手爪、三指機械手爪、負壓式手爪、液滴機械手爪等,如表4所示。由于種子體積普遍微小,傳統(tǒng)的機械手爪已很難準確可靠夾持單粒種子,因此需要對機械臂末端手爪的結構升級優(yōu)化,增加抓取穩(wěn)固性,同時減少對種子的機械損傷。國內科研團隊紛紛展開技術攻關,針對種子等小粒徑物料的特性研究出多種手爪結構。

表4 適用于微小物料的手爪典型結構

針對傳統(tǒng)二指機械手爪對于不規(guī)則物體夾持可靠度差、易損傷等缺點,方海峰等[100]基于仿生學原理設計了仿鳥喙軟體二指機械手爪,手爪為由外至內錐形空腔的結構,在充入一定量的正壓后,兩指尖能像剪刀狀張開,反之,在充入一定量的負壓后實現(xiàn)指尖的閉合,從而完成整個抓取動作。該結構對于體積較小且形狀不規(guī)則的物料具有良好的適應性。彭瀚旻等[97]使用IPMC薄膜材料設計了一款三指微型柔性手爪,在IPMC薄膜表面施加低電壓后,其材料基體會發(fā)生大變形,驅動手爪收縮。當材料基體電壓為零時手爪張開,該技術解決了傳統(tǒng)三指機械手爪傳動鏈復雜、微型化程度低等缺陷。對抓取力進行監(jiān)控是預防抓取損傷的有效手段,為此研究人員開展了力敏微型機械手[102]、二維力反饋機械手夾持器[103]等研究,對抓取力和沿機械手軸向的壓力的監(jiān)控,實現(xiàn)了手爪基于力比例控制實時調整,進而保證物體與手爪之間不發(fā)生相對滑動。負壓式手爪在微小農業(yè)物料的輸送中亦有廣泛應用,其抓取合格率取決于吸嘴氣孔的形狀、孔徑、負壓等[104-106],在使用此類結構時可通過Fluent-EDEM耦合分析,研究吸嘴作用下氣流場特性,明確種子與吸嘴形態(tài)、負壓之間的相互作用機理,提高抓取可靠性。

綜上所述,不同的夾持輸送技術各有特點,使用時需綜合考慮易用性、易操作程度以合理選擇、設計。柔性機構的設計以及力控、視覺伺服技術的綜合利用可以有效避免種子的機械損傷,這是未來研發(fā)的重點和難點。

3.4 取樣技術

種子取樣技術需要從種子中取出一小塊樣品用于基因檢測。根據(jù)其取樣方式可分為沖切法、打孔法、拉削法和激光法,典型種子取樣技術如表5所示。

表5 種子微創(chuàng)取樣技術典型方法

從目前國內外樣機研發(fā)結果看,激光法適用范圍廣,且切割方式靈活,切割參數(shù)可以根據(jù)種子類型與環(huán)境適時調整,但是激光切割可能會使樣品切口橫截面碳化,影響樣本基因的檢測精度。沖切法因其結構緊湊、效率高、設計簡單等因素,受到國內外廣大學者的青睞,使用案例較多,但是該方法對于種子有一定損傷,同時種子與刀片需要有一定接觸面積,難適用于油菜等小顆粒種子。打孔法和拉削法可以直接獲取粉末狀樣品,免去后續(xù)的樣品粉碎操作,但是存在粉末易發(fā)生飄散和黏附等缺陷,不利于樣品的收集和刀具的清潔。

3.5 樣品收集與清潔技術

3.5.1樣品收集

完成種子取樣后,需要對所得樣品進行基因檢測,進而篩選出符合目標基因型的種子,挑選并培育。因此,種子母體和取下的樣品需要定點分類存放,以便系統(tǒng)將種子和樣品的坐標編號與種盒上的盒孔編號關聯(lián)。

為了實現(xiàn)樣品的對應收集和存儲,研究人員提出了3種方案。第1種是對于使用機械臂操作的種子取樣機,可以在種子切削完成后,直接驅動機械臂將種子母體放入收種盒對應位置[95]。這種設計減少了裝置的機構數(shù)量,簡化了設計,但是工作速度較慢。

第2種是收種盒固定,落料口隨十字滑臺運動的方案[51](圖12a),樣品通過固定的落料口落入指定樣品槽中并記錄樣品坐標,隨后XY滑臺移動漏斗至底部對準相鄰樣品槽,等待樣品下落。重復此步驟直至遍歷整個收種盒的樣品槽后即完成單個收種盒的收集。為了縮短滑臺的結構,進一步提高滑臺的結構緊湊性,文獻[111]設計了一種圓柱關節(jié)-直線關節(jié)復合式平面滑臺(圖12b),外圈轉盤轉動,內部嵌入直線滑臺,實現(xiàn)種子的精確安置。由于這類方案依靠重力落料,落料口上方的輸種管道的傾角不得小于種子摩擦角,因而取樣裝置與收種盒高度上要保持較大距離,增加了樣品在輸種管道中的滑落時間。

圖12 樣品收集裝置原理圖

第3種是收種盒隨十字滑臺運動的方案[70,94,112],其基本結構如圖12c所示。收種盒安裝于十字滑臺之上,其兩端固定,隨十字滑臺移動。該方案實現(xiàn)效果與“落料口隨十字滑臺運動”相近,豎直方向空間和種子滑落時間都有所減少,但是平面結構尺寸有所增加,且移動部分需要承載收種盒及配套零部件,運動慣量較大,增加了對驅動性能的要求。

3.5.2污染預防及清潔技術

高通量取樣過程中,樣本基因的污染會影響基因檢測的準確度從而影響目標種子的挑選,污染預防及清潔技術能夠有效解決這一問題。為滿足種子基因樣品純度要求,國內外研究人員分別從種皮DNA的污染和樣品間的交叉污染兩方面開展了一系列研究,力圖提升樣品純凈度,提高基因提取檢測精度。

由于種皮來源于母本,基因型與母本一致,而種子的胚、胚芽等結構的基因型取決于父本和母本,這導致取樣時易發(fā)生胚乳與種皮混合,進而出現(xiàn)樣本的污染,即引入了種皮DNA的污染[113]。而樣品間的污染則源于取樣過程中上一個種子的樣品在各部件之間由于黏附等情況發(fā)生殘留積聚,并與下一個樣品混合后流入樣品管中。

為了減少種皮DNA的污染,研究者提出先去除種皮后取樣的方案。例如先通過除磨裝置去除種子的一部分種皮,露出種子內部的胚乳,然后應用取樣工具再次在胚乳區(qū)域取樣[92]。

對于樣品間的交叉污染,可能是由于多個環(huán)節(jié)造成,因而選取合適的技術進行清潔是預防污染的重要前提。例如在取樣階段,為了減少切割工具本身殘留的組織,文獻[52,114]設計了略寬于刀片尺寸的溝槽結構,基于干涉原理在刀片穿越溝槽時將刃口處組織試樣除去。針對在鋸齒、鉆頭等結構難以深度清潔的問題,文獻[92]設計了取樣刀頭清洗組件,利用氣壓將閑置的取樣刀頭進行吹洗以便準備進行下一次取樣操作。在樣品的收集階段,文獻[92]提出了一種無污染樣品收集方案:收集管將種子取樣后得到的粉末收集,收集管利用負壓將粉末吸入管體,隨后將注射針插入相應收集管的尖端內并注入溶液,形成樣本懸濁液排到檢測試管中。該方案利用水流清洗的方式在每次取樣后對收集管進行清潔,保證了每次取樣樣品的純凈度。樣品收集管、收集漏斗等零部件也可能沉積有殘留組織,設計移動式吹掃裝置對工作部件正壓吹掃,負壓收集污染物,可以一次性清潔多個零部件[30,46]。

總體而言,目前污染預防及清潔技術研究較少,相關的資料較為匱乏,需要在頂層設計時加強污染物的預防研究,從減少組織碎屑產(chǎn)生、飄散,提升清潔部件清洗能力,做好樣品存儲密封等方面把污染降到最低。

4 發(fā)展展望

種子切片裝備的研制和推廣可以顯著提升我國育種實力,是解決種子芯片“卡脖子”難題的重要支撐。目前,我國種子切片裝備正處于快速、健康發(fā)展時期。隨著科技的進步與種業(yè)的發(fā)展,種子切片裝備將迎來新的發(fā)展機遇。本文通過對國內外各類種子切片技術與裝置的研究現(xiàn)狀分析,結合我國育種行業(yè)存在的問題與需求,提出以下展望:

(1)加強種子切片裝備基礎理論研究

種子切片取樣作為一項新興的技術,涉及自動化、機械、生物、農業(yè)等多學科交叉研究。薄弱的基礎理論會制約種子切片裝備制造過程中結構與參數(shù)的選取,阻礙切割精度與質量的提升。隨著模擬仿真分析技術的發(fā)展,基于動力學、運動學、力學的模擬仿真理論分析研究將有效擴展基礎理論研究的深度與廣度,為種子取樣過程中的物料-刀具交互機理、胚向識別等基礎理論研究提供有效指導,進而建立科學的育種切割體系,形成系統(tǒng)而全面的參數(shù)指導手冊,為全面分析各參數(shù)對切片質量的影響提供更準確更全面技術參考。

(2)多尺度通用化種子切片平臺開發(fā)

國內外已有學者研制出大豆、玉米作物種子的切片裝備,經(jīng)過調試后能達到較優(yōu)的切割效果。由于這類育種切片機械適用作物種類單一,局限于小麥、水稻、玉米等普通農作物的切片,尚未進行其余糧食和經(jīng)濟作物種子的技術攻關與研發(fā),無法滿足育種科研機構與企業(yè)的需要。研制適用于多尺度、多形態(tài)的通用型種子切片機是擴展種子切片裝備應用場景的有效手段。多尺度是指從油菜、芝麻等毫米尺度到大豆、花生等厘米尺度的種子均可以進行切割取樣,且在取不同的種子時一套機械即可完成,無需更換零部件或僅需要更換簡單的零件;多形態(tài)是指對于球形、條形、棋形、錐形等多種形態(tài)的種子均可以準確可靠的抓取、切割,且不對種子造成傷害。多尺度通用化種子切片平臺的開發(fā),可以提高切片平臺的易用性和通用性,減少設備采購數(shù)量,適應多種作物的檢測需求。

(3)發(fā)展全生產(chǎn)環(huán)節(jié)智慧取樣檢測系統(tǒng)

種子切片取樣過程是一個融合了物理加工和信息控制的過程。將物理加工和信息控制深度融合成數(shù)字化取樣檢測系統(tǒng),能夠進一步提高高通量種子精準切片取樣的能力。全生產(chǎn)環(huán)節(jié)智慧取樣檢測系統(tǒng)是基于育種切片取樣和基因提取的方法,探索信息融合技術原理,打通種子基因檢測各環(huán)節(jié)的技術壁壘,實現(xiàn)從種子取樣、檢測、挑選、培育到云端大數(shù)據(jù)綜合分析的基因檢測技術智慧體系,為種子切片裝備智能化、精準化作業(yè)奠定基礎。