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    從lncRNA NEAT1和IRE1α/XBP1信號(hào)通路探討透骨消痛膠囊改善膝骨關(guān)節(jié)炎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究

    2023-07-31 07:49:46付長(zhǎng)龍梅陽陽謝新宇涂海水葉錦霞鄭春松馬德尊
    福建中醫(yī)藥 2023年6期
    關(guān)鍵詞:透骨軟骨膠囊

    付長(zhǎng)龍,梅陽陽,謝新宇,涂海水,葉錦霞,鄭春松,馬德尊*

    (1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建 福州 350122;2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350122;3.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,福建 福州 350101)

    關(guān)節(jié)軟骨退行性變是膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)的主要病理特點(diǎn)[1-2]。關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可顯著加劇KOA病情[3],其中跨膜蛋白肌醇激酶1α(IRE1α)/X盒結(jié)合蛋白1(XBP1)途徑是導(dǎo)致KOA關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生ERS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn),KOA關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生ERS與長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的調(diào)控密切相關(guān),尤其lncRNA NEAT1功能的發(fā)揮將影響KOA病理進(jìn)程[6]。

    KOA的核心病機(jī)是“本痿標(biāo)痹”,因此對(duì)KOA的治則宜行補(bǔ)肝腎祛風(fēng)濕之法[7]。透骨消痛膠囊(由巴戟天、白芍、川芎、腫節(jié)風(fēng)組成)作為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑,具有補(bǔ)腎柔肝、活血祛風(fēng)的功效,臨床治療KOA療效顯著[8]。但lncRNA NEAT1與IRE1α/XBP1的調(diào)控關(guān)系在KOA的作用及透骨消痛膠囊的效用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

    1 材 料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 8周雄性C57BL/6小鼠(SPF級(jí))48只,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予以分籠飼養(yǎng),自由飲水,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,使用許可證號(hào):SYXK(閩)2019-0007,實(shí)驗(yàn)過程及方法均符合福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求(倫理審批號(hào)FJTCMIACUC-2022120)。透骨消痛膠囊(閩藥制備字Z20190010000,福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院,生產(chǎn)批號(hào):202205005);?;切苋パ跄懰幔ㄒ獯罄愃沟洗笏帍S,批號(hào):1918)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 XBP1、ER伴侶蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、GAPDH(美國SAB公司,批號(hào):9N29,9N29,4612,9306);IRE1α(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號(hào):00101005);Superkine超敏型ECL發(fā)光液(Abbkine生物公司,批號(hào):ATVAP 2501);ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,批號(hào):027E2201 CA);lncRNA NEAT1(Forward:GCAGGTGGCACTA CTTTGAG;Reverse:GTGACAACCATCTATTGAGCA ACT)、GAPDH(Forward:ACGGCAAGTTCAACGGCA CAG,Reverse:GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC)引物均由福州尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 微量紫外分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司);熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司),凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

    2 方 法

    2.1 動(dòng)物分組、造模與干預(yù) 48只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組12只、造模組36只。造模組動(dòng)物經(jīng)5%異氟醚吸入麻醉后,采用Hulth法誘導(dǎo)KOA模型[9],待KOA模型建立后,再用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組12只、對(duì)照組12只、透骨消痛膠囊組12只。對(duì)照組予以牛磺熊去氧膽酸500 mg/kg進(jìn)行灌胃[10];透骨消痛膠囊組選擇透骨消痛膠囊臨床等效劑量368 mg/kg進(jìn)行灌胃[11];空白組和模型組給予等量生理鹽水灌服,灌胃劑量依據(jù)小鼠體質(zhì)量按周計(jì)算調(diào)整,4組均連續(xù)灌注胃4周。

    2.2 組織取材與處理 于末次灌胃結(jié)束后,經(jīng)5%異氟醚吸入麻醉后處死。收集其余小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織,置于液氮中轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱冷凍保存。

    2.3 觀察指標(biāo)

    2.3.1 軟骨組織病理改變 將待測(cè)小鼠膝關(guān)節(jié)固定于小動(dòng)物Micro-CT的檢查槽中,開始掃描,設(shè)置的條件為:電壓60 kV,電流666 μA,分辨率為50 μm,掃描時(shí)間為30 min,獲得不同斷面的圖片,經(jīng)圖像二值化,對(duì)膝關(guān)節(jié)的掃描圖片進(jìn)行三維圖像重構(gòu)。

    2.3.2 軟骨組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況 提取各組軟骨組織總蛋白,BCA進(jìn)行蛋白定量,配制12%分離膠和5%濃縮膠,上樣后進(jìn)行電泳,后經(jīng)轉(zhuǎn)膜(半干式),封閉2 h后洗膜,再將各條膜放入預(yù)先配置好的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP的一抗后置于4 ℃冰箱搖床過夜進(jìn)行充分震蕩反應(yīng),待二抗反應(yīng)處理后,使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影,于凝膠成像儀下進(jìn)行曝光成像,后分析儲(chǔ)存。

    2.3.3 軟骨組織lncRNA NEAT1表達(dá)情況 按Trizol操作說明提取軟骨中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布,數(shù)據(jù)采用()表示,多組間比較采用方差分析,若方差齊,多組間兩兩比較采用LSD-t法;若方差不齊,多組間兩兩比較則采用Games-Howell法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié) 果

    3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況 本次實(shí)驗(yàn)過程入組動(dòng)物無出現(xiàn)意外死亡。

    3.2 軟骨組織影像學(xué)改變情況 拍攝Micro-CT觀察膝關(guān)節(jié)的形態(tài)變化,結(jié)果顯示與空白組比較,模型組半月板結(jié)構(gòu)缺失,脛骨平臺(tái)軟骨面欠光滑,呈現(xiàn)凹凸不平狀,并伴有明顯的骨贅增生;對(duì)照組、透骨消痛膠囊組小鼠內(nèi)側(cè)半月板結(jié)構(gòu)缺失,與模型組比較,其關(guān)節(jié)軟骨退變程度明顯減輕。見圖1。

    圖1 膝骨關(guān)節(jié)炎模型Micro-CT鑒定結(jié)果

    3.3 軟骨組織中相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 Western blot結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,透骨消痛膠囊組與對(duì)照組的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

    表1 4組軟骨組織中IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)量情況()

    表1 4組軟骨組織中IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)量情況()

    注:與空白組比較,1) P<0.05;與模型組比較,2) P<0.05。

    CHOP/GADPH 0.49±0.09 1.09±0.041)0.77±0.121)2)0.91±0.091)2)組別空白組模型組對(duì)照組透骨消痛膠囊組IRE1α/GADPH 0.54±0.06 1.06±0.011)0.76±0.031)2)0.83±0.021)2)XBP1/GADPH 0.49±0.01 1.21±0.011)0.83±0.071)2)0.94±0.041)2)GRP78/GADPH 0.50±0.04 1.07±0.051)0.74±0.011)2)0.87±0.011)2)

    圖2 4組小鼠關(guān)節(jié)軟骨中相關(guān)蛋白條帶圖

    3.4 小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平比較 qPCR結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,透骨消痛膠囊與對(duì)照組中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

    表2 小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1水平比較()

    表2 小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1水平比較()

    注:與空白組比較,1) P<0.05;與模型組比較,2) P<0.05。

    lncRNA NEAT1 1.00±0.00 3.21±0.321)2.34±0.162)2.09±0.182)組別空白組模型組對(duì)照組透骨消痛膠囊組

    4 討 論

    研究證實(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可加劇OA軟骨退變[12]。ERS發(fā)生時(shí),未折疊蛋白的異常堆積可促使GRP78從膜蛋白上解離,與結(jié)合未折疊蛋白結(jié)合,而IRE1α發(fā)生磷酸化后,可剪接并激活轉(zhuǎn)錄因子XBP1,XBP1的持續(xù)活化又可上調(diào)CHOP基因表達(dá),而后者又可促使半胱天冬酶3(Caspase-3)表達(dá),最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡[13-14]。此外,GRP78也是XBP1靶點(diǎn),受XBP1激活后發(fā)揮調(diào)控ERS作用[15-16]。?;切苋パ跄懰嶙鳛橐环NERS抑制劑,本研究結(jié)果亦證實(shí),其可抑制KOA軟骨的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,改善軟骨退變程度。

    lncRNA NEAT1作為一種與KOA發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的非編碼長(zhǎng)鏈RNA,在調(diào)控軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面充當(dāng)了重要的角色[17]。研究表明,在KOA軟骨和軟骨細(xì)胞中,lncRNA NEAT1含量表達(dá)顯著增高[18];有研究證實(shí),過表達(dá)lncRNA NEAT1可顯著上調(diào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)蛋白的XBP-1S/XBP-1U比值與GRP78表達(dá)[19]。而NEAT1下調(diào)可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控的細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示,在KOA模型小鼠軟骨組織中,lncRNA NEAT1基因水平較空白組顯著升高,IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白含量顯著升高,而經(jīng)透骨消痛膠囊干預(yù)后,小鼠軟骨組織中上述指標(biāo)表達(dá)呈顯著下降趨勢(shì),進(jìn)而可以有效延緩KOA小鼠軟骨退變,這亦與本研究Micro-CT結(jié)果相一致。

    綜上,本研究結(jié)果表明,透骨消痛膠囊可以有效延緩KOA小鼠軟骨退變,其機(jī)制與下調(diào)KOA小鼠軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1水平及IRE1α/XBP1信號(hào)通路相關(guān)蛋白含量表達(dá),進(jìn)而緩解ERS密切有關(guān)。同時(shí),本研究仍存在一定的局限性,即透骨消痛膠囊與lncRNA NEAT1和IRE1α/XBP1的內(nèi)在靶向調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

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