牛支原體診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

汪夢(mèng)竹，蒲飛洋，趙澤陽，馮茜莉，王慧慧，李易聰，李倬，趙永清

（1西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，蘭州 730030；2西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730010）

0 引言

支原體屬于柔膜細(xì)菌綱，革蘭氏染色呈陽性，無細(xì)胞壁，廣泛分布于自然界中。迄今為止，從動(dòng)物體內(nèi)分離并鑒定出的支原體數(shù)量繁多，但大部分對(duì)動(dòng)物不致病，其中僅有少部分支原體在牛身上具有不同程度的臨床意義[1]。牛支原體是公認(rèn)的與牛疾病有關(guān)的最重要的支原體之一，1961年美國一個(gè)爆發(fā)乳腺炎的奶牛場(chǎng)中分離出的牛支原體菌株P(guān)G45，目前作為牛支原體國際參考株，已完成了全序測(cè)定[2]。另外，包括加利福尼亞支原體、牛生殖道支原體、牛鼻支原體、牛眼支原體、Leachii 支原體、殊異支原體、犬支原體、canadense支原體、產(chǎn)堿支原體、精氨酸支原體和文氏支原體[3]等也在不同程度上對(duì)牛具有一定的致病作用。

支原體感染牛后可引起多種疾病，包括乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、中耳炎和生殖紊亂等[4]。臨床上支原體感染所致的乳腺炎特點(diǎn)是多感染區(qū)，并對(duì)治療無反應(yīng)，且存在亞臨床乳腺感染表現(xiàn)[5]；成年牛和犢牛會(huì)同時(shí)受到關(guān)節(jié)炎[6]和肺炎[7]的影響，而中耳炎通常只在小牛身上發(fā)生[8]；有關(guān)支原體感染所致的生殖疾病包括外陰陰道炎、不孕癥、子宮內(nèi)膜炎、難產(chǎn)等[9]。支原體傳染性強(qiáng)、變異性強(qiáng)、對(duì)治療的反應(yīng)性差、易與其他病原混合感染，而支原體的診斷結(jié)果對(duì)后續(xù)撲殺影響極大，因此，快速且準(zhǔn)確的診斷對(duì)于控制和預(yù)防相關(guān)疾病的暴發(fā)非常重要。本研究將對(duì)牛支原體不同診斷方法的發(fā)展和應(yīng)用進(jìn)行闡述（表1）。

表1 牛支原體不同診斷方法的優(yōu)缺點(diǎn)

1 微生物培養(yǎng)

通過微生物培養(yǎng)的方式對(duì)牛支原體鑒定和檢測(cè)是比較傳統(tǒng)且較常用的。支原體的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，G+C含量低(23%～40%)，編碼氨基酸的基因數(shù)量很少，合成脂肪酸的能力也較低[10]。培養(yǎng)支原體需考慮到其生物合成力低的特點(diǎn)，為其提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，需選用特異性的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基應(yīng)富含牛心浸液、血清、酵母抽提物、蛋白胨和其他營養(yǎng)物質(zhì)，酸堿度控制在pH 7.3～7.8[11]。將接種后的培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下孵育7～10 d后，可在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌落呈“煎蛋”狀。

傳統(tǒng)的支原體培養(yǎng)鑒定方法操作簡(jiǎn)單、成本低，但也有一定局限性，如支原體的樣本收集、處理和儲(chǔ)存要求比較嚴(yán)格，樣品活性易喪失，培養(yǎng)周期長(zhǎng)并易受雜菌污染等。為避免其活性喪失或被雜菌污染，在采樣時(shí)，應(yīng)迅速將采集到的樣品收集至無菌容器中，可于4℃條件下短暫保存，盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。如果在2 d內(nèi)不能培養(yǎng)，需將樣品冷凍，但這會(huì)使支原體菌落形成單位明顯降低[12]。同時(shí)，重復(fù)解凍也會(huì)導(dǎo)致活菌的減少，且無論樣品是否冷藏或冷凍，支原體的回收率都會(huì)隨著保存時(shí)間的增加而降低。如果樣品收集和儲(chǔ)存不當(dāng)，可能會(huì)有假陰性結(jié)果。在適當(dāng)?shù)臉颖静杉蛢?chǔ)存方案下，支原體生長(zhǎng)速度依舊緩慢，菌落出現(xiàn)需要5～10 d。而想要通過培養(yǎng)來診斷支原體感染，必須采集有活力的支原體樣本。對(duì)支原體感染的病例實(shí)際情況觀察研究后，發(fā)現(xiàn)慢性和亞臨床支原體乳腺炎病例的牛支原體通常間歇性脫落，為了提高慢性或亞臨床乳腺炎病例以及BTM樣本中檢測(cè)支原體的可能性，應(yīng)在數(shù)天內(nèi)采集多個(gè)樣本，一般采集3 個(gè)樣品至少收集3～4 d，再進(jìn)行培養(yǎng)[13]。

為防止其他細(xì)菌干擾，分離培養(yǎng)時(shí)可向培養(yǎng)基中添加抗菌劑如醋酸鉈或抗生素[14]。雖然添加的抗菌劑通常會(huì)抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，但支原體生長(zhǎng)培養(yǎng)基仍有可能出現(xiàn)幾種柔膜綱類。其中，無膽甾原體和支原體形態(tài)均呈“煎蛋”狀，不能單靠培養(yǎng)鑒別，易導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)，可應(yīng)用洋地黃素的敏感性作為鑒別支原體和無膽甾原體屬的附加步驟[15]。為保證分離培養(yǎng)菌株為支原體，在分離后應(yīng)進(jìn)一步通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)培養(yǎng)的陽性菌株進(jìn)行物種鑒定。

2 分子水平的診斷

2.1 常規(guī)PCR檢測(cè)

與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基診斷方法相比，利用PCR檢測(cè)不同樣本類型支原體的方法具有高效性、特異性和敏感性。目前已有可識(shí)別單個(gè)及多個(gè)支原體物種的PCR檢測(cè)方法。以16S rRNA基因?yàn)榘悬c(diǎn)的常規(guī)PCR檢測(cè)方法始于20世紀(jì)90年代[16]，早期PCR檢測(cè)的檢測(cè)限在肉湯培養(yǎng)基中為4×102cfu/mL，于24 h內(nèi)可得到結(jié)果，比培養(yǎng)法更高效。雖然這些針對(duì)牛支原體16S rRNA基因的PCR檢測(cè)可檢出大多數(shù)支原體物種，但是對(duì)于無乳支原體（一種影響小型反芻動(dòng)物的物種）的特異性較弱[17]。因此，提高支原體檢測(cè)的特異性也成為科學(xué)家不斷探索的目標(biāo)。一種利用牛支原體p81基因設(shè)計(jì)出的多重PCR 檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該檢測(cè)方法通過PCR-RFLP法對(duì)牛支原體p81基因進(jìn)行測(cè)序和分析，極大地提高了支原體檢測(cè)的特異性[18]。

由于牛支原體不是唯一對(duì)牛有診斷價(jià)值的支原體物種，PCR檢測(cè)方法的進(jìn)一步發(fā)展使其在檢測(cè)其他支原體種類上也取得了較大進(jìn)展。其中，16S rRNA基因已被用作靶標(biāo)，開發(fā)了殊異支原體和無乳支原體的種特異性PCR[19]。為了檢測(cè)多個(gè)物種，以16S～23S rRNA間隔區(qū)為靶點(diǎn)的PCR 檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生，16S～23S rRNA基因間隔區(qū)是位于2個(gè)核糖體RNA之間的結(jié)構(gòu)區(qū)域，對(duì)蛋白質(zhì)合成至關(guān)重要[20]。雖然這種設(shè)計(jì)不是專門針對(duì)牛的支原體，但它作為廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法對(duì)牛支原體同樣適用。DNA擴(kuò)增后，所得產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行后產(chǎn)生的帶型可區(qū)分支原體和無膽甾原體。

鑒定多種支原體物種的方法通常是使用多種引物，由瓊脂糖凝膠上的產(chǎn)物確定物種[21]。用該方法測(cè)定產(chǎn)堿支原體、牛生殖道支原體、牛鼻支原體、牛支原體的檢出限分別為1.4×103、1.7×102、1.1×102、4×102cfu/mL，低于培養(yǎng)基法（其檢測(cè)限分別為1.4×104、1.7×103、1.1×103、1×103cfu/mL）。最近的一項(xiàng)研究證明了傳統(tǒng)PCR和序列分析法(sequence analysis)可對(duì)幾種支原體和無膽甾原體進(jìn)行鑒別，包括精氨酸支原體、產(chǎn)堿支原體、牛生殖道支原體、canadense支原體、牛鼻支原體、加利福尼亞支原體、laidlawii支原體和無膽甾原體[22]。

2.2 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

隨著技術(shù)的進(jìn)步，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)支原體的方法得到了發(fā)展，SYBR green染料法和熒光探針法作為常用的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方式，在支原體檢測(cè)中也發(fā)揮著巨大的作用。

SYBR green染料在游離狀態(tài)下可發(fā)出微弱熒光，但其可與所有雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合后在特定波長(zhǎng)的光激發(fā)下產(chǎn)生520 nm 的熒光信號(hào)。隨著PCR 循環(huán)的進(jìn)行，目標(biāo)雙鏈DNA 的數(shù)量增加，染料發(fā)出的光量按比例增加，可實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR產(chǎn)物[23]。由于SYBR green并不針對(duì)特定的目標(biāo)序列，不需要合成特定的寡核苷酸序列，因此其相對(duì)方便快捷[24]。然而，由于SYBR green 能與所有雙鏈DNA 結(jié)合，與基于探針的實(shí)時(shí)PCR 方法相比，其特異性較差[25]。這種方法在牛的支原體檢測(cè)中不太常用，但可基于支原體屬的16S～23 S基因間隔區(qū)檢測(cè)散裝牛奶樣品中的多個(gè)支原體屬。早期PCR檢測(cè)的檢測(cè)限在肉湯培養(yǎng)基中為4×102cfu/mL，在牛奶樣品中提取過的DNA為5×102cfu/mL。

為了提高特異性，實(shí)時(shí)PCR熒光探針法的應(yīng)用也受到了重視[26]，其中常用的是水解探針。由于水解探針特異性結(jié)合目標(biāo)序列，使背景信號(hào)顯著降低，這種方法特異性高且定量準(zhǔn)確。不同的探針也可以與不同的染料和猝滅劑分子結(jié)合，可在單一反應(yīng)中進(jìn)行復(fù)驗(yàn)，從而節(jié)省時(shí)間和試劑[27]，目前已開發(fā)了幾種新的牛支原體實(shí)時(shí)PCR探針檢測(cè)法[28]?；跓晒馓结樀膶?shí)時(shí)PCR測(cè)定靶標(biāo)16S rRNA 基因時(shí)會(huì)與無乳分枝桿菌表現(xiàn)出交叉反應(yīng)[29]，而DNA修復(fù)基因uvrC具有某些與無乳分枝桿菌不同的獨(dú)特序列，在后續(xù)的研究測(cè)定中這些序列作為設(shè)計(jì)新的引物探針的靶標(biāo)意義重大[30]。Cezar等[31]基于RD4的引物建立了新型實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)，該方法可以從奶樣和血樣直接檢測(cè)牛分枝桿菌。Ziv等[32]設(shè)計(jì)了一種基于TaqMan探針的雙靶標(biāo)測(cè)定方法，靶向牛支原體的管家基因fusA和oppD/F進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

此外，探針實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展成功探索出了牛體內(nèi)其他支原體的鑒定方法。隨著技術(shù)不斷發(fā)展，科研人員開發(fā)出了3 種新型的探針實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)牛奶和組織樣本中的牛支原體、加利福尼亞支原體和牛生殖支原體[33]。根據(jù)每種支原體的特異性選擇了3 個(gè)不同的靶基因，其中牛支原體的靶基因是fusA編碼的延伸因子G，該基因在mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)的過程中發(fā)揮著重要的作用。牛乳中牛支原體、加利福尼亞支原體和牛生殖道支原體的檢出限分別為(10±0)、(22.4±20)、(20±0)cfu/mL[34]。該檢測(cè)限比先前描述的PCR 檢測(cè)更為敏感，此外，本研究表明，3種新開發(fā)的探針檢測(cè)方法比作為比較金標(biāo)準(zhǔn)的16S rRNA 基因測(cè)序更準(zhǔn)確。在發(fā)展探針PCR 技術(shù)的同時(shí)，實(shí)時(shí)多重PCR 測(cè)定也在實(shí)踐中，目前的測(cè)定方法可在單一反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)牛支原體和其他病原體，如多殺性瘧原蟲、溶血分枝桿菌和睡眠嗜血桿菌[35]。

2.3 遺傳鑒定與分型

隨著遺傳鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)分析(multiple locus variable number tandem repeat analysis，MLVA)和多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)等方法對(duì)牛支原體分離株進(jìn)行遺傳鑒定的技術(shù)日趨成熟。

PFGE被認(rèn)為是細(xì)菌分型的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[36]，目前已廣泛應(yīng)用于支原體菌株的分型和鑒定。AFLP是一種基于PCR的技術(shù)，也可用于DNA指紋分析，與其他流行的DNA 標(biāo)記相比，它在時(shí)間、經(jīng)濟(jì)性、可重復(fù)性、信息性、分辨率和靈敏度方面更有效[37]。利用這項(xiàng)技術(shù)，Thomas 等[38]證明牛支原體分離株的病理背景（乳腺炎、肺炎和關(guān)節(jié)炎）與它們粘附不同宿主細(xì)胞系的能力沒有相關(guān)性。MLVA通過分析基因組中獨(dú)特序列的差異，確定分離株的親緣關(guān)系，可進(jìn)行感染溯源。MLST是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法，能夠準(zhǔn)確地從亞種水平進(jìn)行菌株分類，在鑒定物種的遺傳多樣性方面發(fā)揮重要作用[39]，可用于研究牛支原體的種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和傳播。對(duì)于牛支原體分離株的基因分型，可先使用MLST 來確定菌株，然后使用MLVA 來進(jìn)行精細(xì)的分型。Tardy 等[40]應(yīng)用該技術(shù)對(duì)1981—2016 年在丹麥?zhǔn)占呐７种U菌分離株進(jìn)行了遺傳分析，監(jiān)測(cè)了分離株隨時(shí)間推移的遺傳相關(guān)性。Manso等[41]開發(fā)的MLST 方案基于4 個(gè)管家基因（fusA、gyrB、lepA和rpoB），研究了17年間在丹麥分離出的牛支原體菌株的遺傳異質(zhì)性，分辨力可達(dá)到0.833。MLST具有較高的分辨率且具有高準(zhǔn)確性[42]，但其檢測(cè)時(shí)需要充足的樣本，耗時(shí)長(zhǎng)且成本較高。不同的鑒定方法優(yōu)勢(shì)各有不同，也存在著不足之處，因此在實(shí)際應(yīng)用中要根據(jù)具體情況選擇適宜的分子生物學(xué)鑒定分型技術(shù)進(jìn)行分析。

2.4 全基因組測(cè)序

隨著高通量測(cè)序變得快捷便利，全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)成為研究細(xì)菌基因組序列的一種廣泛使用的工具。WGS 是指對(duì)所選菌株的全部基因組進(jìn)行測(cè)序，以便對(duì)其結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)一步研究，可用于臨床診斷、疾病暴發(fā)調(diào)查和耐藥性控制[43]。全基因組測(cè)序已被用于5種牛支原體分離株和2種加利福尼亞支原體分離株，以及單個(gè)的精氨酸支原體、牛生殖道支原體、canadensen支原體、牛眼支原體和leachii支原體分離株[44]。雖然這種方法可以獲取更詳細(xì)的支原體信息，揭示相關(guān)毒性基因的遺傳進(jìn)化規(guī)律，但其很少用于研究大量分離株之間的遺傳多樣性。

3 血清學(xué)診斷

雖然微生物培養(yǎng)法和PCR 診斷可以完成對(duì)支原體的檢測(cè)，但間接ELISA 可檢測(cè)在血漿、血清和牛奶樣本中存在的支原體抗體。該方法可以鑒別那些接觸過病原體并產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)的動(dòng)物，針對(duì)牛支原體的許多開發(fā)和研究都已投入使用，包括用于血清和牛奶樣本的Bio-X 診斷法(Rochefort，Belgium)檢測(cè)牛支原體抗體的市售間接ELISA試劑盒，已用于若干現(xiàn)場(chǎng)和分析驗(yàn)證研究[45]。

間接ELISA檢測(cè)方法（圖1）是將抗原或抗體結(jié)合到固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)，克服了培養(yǎng)法和PCR分析的難點(diǎn)。ELISA可以以體液抗體反應(yīng)的形式測(cè)量檢測(cè)前被檢動(dòng)物是否接觸過支原體，因?yàn)樵诟腥竞笠欢螘r(shí)間動(dòng)物體內(nèi)仍保持著一定水平的抗體反應(yīng)，且不受支原體間歇排泄的影響。所以，相對(duì)于其他檢測(cè)方法，應(yīng)用ELISA 檢測(cè)到的患病率通常比PCR 或培養(yǎng)法檢測(cè)到的患病率高出許多。然而，可以檢測(cè)到牛支原體抗體并不能說明動(dòng)物感染了牛支原體。這一觀點(diǎn)在牛支原體乳腺炎爆發(fā)的養(yǎng)殖場(chǎng)中得到了證明，雖然接觸牛支原體的動(dòng)物數(shù)量可能很高，但死于疾病或主動(dòng)脫落支原體的動(dòng)物比例通常要低得多[46]，這表明僅根據(jù)ELISA 結(jié)果撲殺動(dòng)物會(huì)導(dǎo)致過度撲殺。因此，ELISA結(jié)果應(yīng)結(jié)合其他診斷方法進(jìn)行綜合評(píng)估。雖然ELISA不受牛支原體間歇脫落的影響，但因?yàn)檠遛D(zhuǎn)化的時(shí)間不夠可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。幾項(xiàng)涉及感染性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，血清IgG 抗體轉(zhuǎn)化需2～3 周，這是影響ELISA結(jié)果的重要因素[47]。

圖1 間接ELISA檢測(cè)方法

而與血清樣本相比，牛奶樣本中牛支原體抗體水平更低可能無法檢測(cè)到。這是因?yàn)镮gG通常是ELISA的檢測(cè)的關(guān)鍵，血液中生成的IgG 抗體經(jīng)一系列傳遞進(jìn)入牛奶后，其含量降低，且存留時(shí)間也較短。一般不用于檢測(cè)單一牛奶樣本，但可用于檢測(cè)大量的牛奶樣品[48]。由于散裝牛奶樣品(BTM)易于收集，且能代表哺乳牛群，因此通常用PCR或培養(yǎng)法分析作為監(jiān)測(cè)工具以測(cè)量不同地區(qū)和國家的支原體在牛群中的流行程度。在使用BTM 樣本進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)，了解BTM 樣本變異相關(guān)的因素也很重要。Petersen 等[49]研究發(fā)現(xiàn)丹麥奶牛群中抗體陽性的幼畜患病率和牛的規(guī)模沒有顯著相關(guān)。雖然關(guān)于使用間接ELISA 診斷牛支原體仍存在一些問題，但在分析BTM 樣本時(shí)，ELISA 和PCR結(jié)合最實(shí)用，可以從不同的生物學(xué)角度分析牛群感染狀況。

近年來，牛支原體ELISA抗體檢測(cè)的方法不斷更新，中國也在此方面取得了一定成果，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所辛九慶團(tuán)隊(duì)研發(fā)的牛支原體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒于2017年獲得了國家新獸藥注冊(cè)證書[50]。

4 總結(jié)

隨著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，牛支原體已經(jīng)在世界范圍內(nèi)傳播，一些早期沒有該病原體的國家也受到了波及，中國作為養(yǎng)牛大國及牛產(chǎn)品進(jìn)口大國，近年來也受到了一定影響。支原體病不僅對(duì)牛群造成嚴(yán)重危害，也對(duì)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)福利造成了負(fù)面影響。因此，需要方便快捷的診斷方法以迅速控制和預(yù)防相關(guān)疾病。

分離培養(yǎng)法提供了一種實(shí)用的支原體分離方式，可用于DNA提取及其分型，以調(diào)查感染源與其他支原體菌株的親緣關(guān)系。聚合酶鏈反應(yīng)可以快速提供診斷結(jié)果，有助于及時(shí)做出有關(guān)臨床感染牛的進(jìn)一步處理決策，以減少疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。血清學(xué)診斷為評(píng)估不同畜群的病原接觸史提供了便捷，為支原體感染的控制提供了科學(xué)指導(dǎo)。在生產(chǎn)實(shí)踐中，診斷方法的應(yīng)用要結(jié)合實(shí)際情況，充分考慮預(yù)算及成本、檢測(cè)的可行性與緊迫性以及樣本的存放和處理。結(jié)合診斷結(jié)果，在疫情初期就應(yīng)盡快隔離病牛，并對(duì)其他牛進(jìn)行緊急接種和預(yù)防性用藥。在治療階段，嚴(yán)禁使用違禁藥品，科學(xué)合理地使用抗生素，并嚴(yán)格遵守休藥期，避免藥物殘留，保證肉、奶等動(dòng)物源性產(chǎn)品質(zhì)量。但目前相關(guān)藥物難以發(fā)揮出很好的作用，達(dá)不到治療目的，所以高效快捷的檢測(cè)方法仍是研究的重點(diǎn)。在之后的研究中，應(yīng)積極探索新興技術(shù)，使之與現(xiàn)有檢測(cè)方法更好融合，以達(dá)到防控支原體感染的最終目標(biāo)。