豬鏈球菌分離鑒定及耐藥性與毒力基因分析

文│趙鳳利［遼寧省臺(tái)安縣農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心（動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）］

豬鏈球菌（Streptococcus suis，S. suis）作為一種重要的人畜共患病原微生物，可引起豬肺炎、敗血癥、腦膜炎及關(guān)節(jié)炎等疾病。我國分別在1998年和2005年暴發(fā)了人感染豬鏈球菌的疾病，使得全世界對(duì)該疾病格外關(guān)注。豬鏈球菌1型（SS1）、2型（SS2）、7型（SS7）和9型（SS9）是臨床分離率最高的四個(gè)血清型，也是其眾多血清型中毒力較強(qiáng)的。由于豬鏈球菌菌株的血清型繁雜，長久以來疫苗的保護(hù)效果不理想，豬鏈球菌病也成為困擾我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的最重要的細(xì)菌性傳染病之一。

近年來，豬鏈球菌病在我國的流行呈明顯上升趨勢，特別是在豬群發(fā)生豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒病或副豬嗜血桿菌病后極易繼發(fā)或并發(fā)豬鏈球菌感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)從遼寧省鞍山市某豬場疑似豬鏈球菌感染的死亡豬體內(nèi)采集不同臟器，從中分離培養(yǎng)細(xì)菌，并進(jìn)行染色、鏡檢、生化試驗(yàn)，采用16s rRNA鑒定法和血清型鑒定法對(duì)分離菌株進(jìn)行病原學(xué)鑒定，進(jìn)一步利用藥敏試驗(yàn)和毒力基因檢測對(duì)分離株的耐藥性和攜帶毒力基因的情況進(jìn)行分析，以期對(duì)豬鏈球菌病的防治提供數(shù)據(jù)參考。

一、材料和方法

1.樣品來源。所有樣品均采集自遼寧省鞍山市某豬場疑似感染豬鏈球菌的病死豬的淋巴結(jié)、脾、肝和肺。

2.主要試劑與儀器。血瓊脂平板購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，新生牛血清和Todd-Hewitt broth（THB）培養(yǎng)基均購自北京索萊寶科技有限公司，藥敏紙片購于青島水生環(huán)境科技有限公司，革蘭氏染色試劑盒購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

臺(tái)式離心機(jī)購自湘儀離心機(jī)儀器設(shè)備有限公司；核酸電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

3.引物的設(shè)計(jì)與合成。參照文獻(xiàn)合成豬鏈球菌的16S rRNA序列引物用于分離菌株的PCR鑒定試驗(yàn)，根據(jù)莢膜多糖基因序列cps1I、cps2J、cps7H和cps9H進(jìn)行設(shè)計(jì)鑒別豬鏈球菌1、2、7、9四種主要致病血清型的引物用于血清分型試驗(yàn)，參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)5對(duì)毒力基因溶血素（Sly）、谷氨酸脫氫酶（gdh）、溶菌酶釋放蛋白（m rp）、毒力相關(guān)因子（Orf2）和細(xì)胞外蛋白因子（ef）的擴(kuò)增引物，上述引物均由吉林省長春市庫美生物科技有限公司合成。本試驗(yàn)所用引物序列詳見表1。

表1 引物序列信息

4.豬鏈球菌的分離培養(yǎng)及革蘭氏染色。無菌剪取病豬的淋巴結(jié)、脾、肝和肺等病料，將樣品編號(hào)、勻漿后，按1∶50轉(zhuǎn)接至含5毫升THB培養(yǎng)基的試管中，37℃ 230轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)8小時(shí)后，將菌液接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16～20小時(shí)。挑取特征性單菌落進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢觀察。

5.豬鏈球菌的PCR鑒定。選取革蘭氏染色陽性的、鏈狀的單菌落接種至THB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)16～20小時(shí)后進(jìn)行菌液PCR鑒定。PCR擴(kuò)增體系如下：依次加入5×Buffer 4微升、Prime STARRHS聚合酶0.5微升，2.5毫摩/升 dNTPs2微升、上、下游引物各0.5微升、菌液模板1微升，最后加滅菌的ddH2O至終體積為20微升。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，觀察結(jié)果。

6.豬鏈球菌的生化試驗(yàn)。取適量豬鏈球菌分離株的菌液接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，37℃條件下靜置培養(yǎng)48小時(shí)，觀察反應(yīng)管的顏色變化，分析該菌株的生化反應(yīng)特性。

7.豬鏈球菌的血清型鑒定。采用PCR方法，利用表1中的引物序列對(duì)分離得到的豬鏈球菌進(jìn)行血清分型。

8.豬鏈球菌的耐藥性分析。將鑒定得到的豬鏈球菌菌株按照1∶100接種于THB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)16～20小時(shí)，用滅菌的PBS調(diào)整濁度為0.5MCF后均勻涂布于血瓊脂平板上，37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)后，采用紙片擴(kuò)散法對(duì)分離到的豬鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)分析。

9.豬鏈球菌的毒力基因檢測。選擇豬鏈球菌的5種主要毒力因子作為鑒定基因，以分離到的豬鏈球菌的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：Prime STARRHS聚合酶0.5微升，5×Buffer 4微升，2.5毫摩爾/升 dNTPs 2微升，DNA 1微升，上、下游引物各0.5微升，補(bǔ)齊ddH2O至20微升。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10分鐘，95℃變性40秒，50～58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘。將擴(kuò)增得到的PCR陽性產(chǎn)物送庫美生物技術(shù)有限公司測定序列，登錄NCBI對(duì)所測序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

二、結(jié)果與分析

1.豬鏈球菌分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果。從病死豬的臟器中分離出的細(xì)菌在THB培養(yǎng)基和血平板上均能很好的生長，進(jìn)行革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)菌體呈藍(lán)紫色、短桿狀，且多是3個(gè)以上形成鏈狀，而分離的菌株在血平板上生長時(shí)出現(xiàn)典型的β溶血環(huán)。挑取單菌落經(jīng)16S rRNA鑒定后，確認(rèn)分離出的細(xì)菌為豬鏈球菌。進(jìn)一步的生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株可分解乳糖、蔗糖等多種糖類，不分解山梨醇和甘露醇，觸酶試驗(yàn)等均為陰性，這與豬鏈球菌的生化特性相符（表2）。血清型PCR鑒定結(jié)果顯示，該分離菌株為血清9型。

表2 豬鏈球菌分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.豬鏈球菌的耐藥性結(jié)果。利用藥敏試驗(yàn)分析豬鏈球菌分離株對(duì)13種抗菌藥物的耐藥情況，結(jié)果顯示，該分離株對(duì)先鋒、菌必治等6種抗菌藥物敏感，而對(duì)強(qiáng)力霉素、乙酰螺旋霉素、林可霉素、磺胺異惡唑和新霉素這5種抗菌藥物均表現(xiàn)出耐藥，且呈多重耐藥（表3）。

表3 分離的豬鏈球菌的藥敏結(jié)果

3.豬鏈球菌的毒力基因分析結(jié)果。對(duì)分離得到的豬鏈球菌分離株進(jìn)行5對(duì)毒力基因的擴(kuò)增，結(jié)果顯示，該分離株攜帶的毒力基因有Sly、gdh、mrp和Orf2。

三、討論和結(jié)論

豬鏈球菌是當(dāng)前豬場中一種常見的細(xì)菌性病原，豬鏈球菌的無毒和強(qiáng)毒株均可從豬群中分離。近年來，隨著大規(guī)模集約化養(yǎng)豬模式發(fā)展，給豬鏈球菌的感染和傳播提供了可乘之機(jī)，造成了豬鏈球菌病的發(fā)生和流行。在本試驗(yàn)中，通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、16S rRNA鑒定和生化試驗(yàn)分析的方式確定從病豬不同病料中分離到的細(xì)菌是一株豬鏈球菌。PCR作為豬鏈球菌的鑒定方法具有很高的準(zhǔn)確性，而生化反應(yīng)結(jié)果是常規(guī)細(xì)菌鑒定的一個(gè)重要參考，對(duì)PCR方法起到很好的佐證作用。進(jìn)一步經(jīng)血清型鑒定，該株豬鏈球菌為血清9型，而該血清型屬于主要的人畜共患血清型之一。雖然我國至今尚未有SS9感染人的報(bào)道，但近年來SS9在臨床中的分離率逐年遞增，且有擴(kuò)大流行的趨勢，應(yīng)引起養(yǎng)豬場的高度關(guān)注。由于豬鏈球菌滅活疫苗的免疫效果不夠理想，臨床中防治豬鏈球菌仍然依靠抗菌藥物，養(yǎng)豬場可根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果首選高敏感藥物。有研究證實(shí)，豬鏈球菌對(duì)常用的抗菌藥物有較高的耐藥性，且存在多重耐藥性和耐藥基因遺傳的情況。本試驗(yàn)的藥敏檢測結(jié)果顯示，該分離株呈現(xiàn)多重耐藥，表明該豬場的豬只感染的豬鏈球菌耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重。豬鏈球菌的致病性強(qiáng)弱與其攜帶的毒力基因有密切聯(lián)系，其中細(xì)胞外蛋白因子、溶血素和溶菌酶釋相關(guān)蛋白是其主要的毒力因子。在之前的研究中，關(guān)于SS9的毒力因子研究很少，而大多數(shù)SS9菌株很少檢出上述3種毒力基因。但近年來，在不同國家的SS9分離株中分別檢測出了Sly基因和mrp基因，而本研究中從遼寧分離到的這株SS9也攜帶這兩種主要毒力基因，提示這株分離株可能具備較強(qiáng)的毒力和致病性，但還需要進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行致病力分析才能得到確認(rèn)。