復合微生物腐解菌劑的制備及其菌渣堆肥性能

李方向,王 濤,常小箭,張?zhí)锪?武占省,陶治東

(1.西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,陜西 西安 710048;2.西安工程大學 環(huán)境與化學工程學院,陜西 西安 710048)

0 引 言

隨著綠色健康飲食趨勢的增長,蘑菇因其含有豐富的營養(yǎng)已成為大眾喜愛的食物。但隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展,我國每年產(chǎn)生約千萬噸的食用菌菌渣[1]。菌渣已被公認為廉價和可持續(xù)的生物肥料的原料,具有容重小、質(zhì)地疏松、顆粒結(jié)構(gòu)豐富、透氣性好、水分和養(yǎng)分保持性高等特點,菌渣堆肥腐熟后施用于田間,有效改善了土壤微生物群落和土壤理化結(jié)構(gòu)。目前大量菌渣不科學的堆放而造成的環(huán)境污染和資源浪費等問題越發(fā)嚴重,實現(xiàn)菌渣的資源化利用迫在眉睫。文獻[2]通過添加纖維素酶進行食用菌菌渣堆肥,改善了堆肥產(chǎn)品質(zhì)量,提高了堆肥中腐殖質(zhì)含量,促進了堆肥過程中硝酸鹽的合成,制備了高質(zhì)量的有機肥料產(chǎn)品,但是因為纖維素酶成本較高,限制了大規(guī)模的推廣應(yīng)用。

為了提高堆肥腐熟度和產(chǎn)品質(zhì)量,文獻[3]篩選來自不同生態(tài)位的纖維素降解菌,檢測到分泌較多的纖維素降解酶,但由于香菇菌渣C/N極不平衡,堆肥過程中投加普通的纖維素降解菌無法降解廢棄的菌渣。為了追求更好的菌渣堆肥的生化過程,文獻[4]在堆肥基質(zhì)中接種微生物復合菌劑,提高了堆肥的營養(yǎng)含量。文獻[5]研制了一種有利于中草藥殘渣堆肥的復合微生物劑,提高了堆肥的總營養(yǎng)含量,并且增加了微生物群落的豐度及多樣性。文獻[6]接種商品復合菌劑,發(fā)現(xiàn)其促進了腐殖質(zhì)的形成,提升了堆肥產(chǎn)品的穩(wěn)定性并增加了營養(yǎng)含量。以上研究通過添加外源微生物制劑提升了堆肥腐熟的穩(wěn)定性,提高了營養(yǎng)物質(zhì)含量,但未能從堆肥原料中進行高效纖維素降解菌株的篩選,導致微生物菌劑無法快速適應(yīng)堆肥的環(huán)境。

本文從廢棄香菇菌渣中分離篩選出高效纖維素降解菌株,結(jié)合濾紙條崩解和酶活性復篩實驗,通過16S rDNA分子生物學技術(shù)菌種鑒定,得到可有效降解香菇菌渣高效纖維素降解菌株YD4,并結(jié)合具有溶磷、固氮作用的菌株,復配出5種用于香菇菌渣堆肥的高效復合微生物菌劑,分析堆肥過程中溫度、pH、電導率、E4/E6、種子萌發(fā)指數(shù)(GI)、有機質(zhì)及效磷含量等腐熟指標變化,提高了纖維素降解效率和堆肥產(chǎn)品質(zhì)量,確定了最優(yōu)的堆肥菌劑組合。

1 實 驗

1.1 材料

1.1.1 菌株及纖維素降解菌培養(yǎng)基

1) 枯草芽孢桿菌SL-44是從植物根部土壤的微生物群落中分離的、具有生物防治及植物促生作用的菌株[7]。假單胞菌Rs-198[8]、里氏木霉DGW1菌株分泌單糖多氧酶等蛋白,能夠更好地降解木質(zhì)纖維素[1]。商品菌劑包含枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、側(cè)胞芽孢桿菌及植物乳桿菌等纖維素降解菌,纖維素降解菌購于益加益生物工程有限公司。

2) 培養(yǎng)基選用實驗室前期配制的羧甲基纖維素鈉、濾紙條崩解、產(chǎn)酶培養(yǎng)基[1]。

1.1.2 堆肥材料

使用的堆肥材料為香菇菌渣(陜西省延長縣綠農(nóng)合作社贈送)、雞糞(河北邯鄲養(yǎng)雞場)。將香菇菌渣和雞糞碾碎至2～3 cm用于后續(xù)堆肥,香菇菌渣和雞糞的理化參數(shù)見表1。

表 1 堆肥材料理化參數(shù)

1.2 實驗方法

1.2.1 濾紙崩解實驗

移取2 mL菌懸液注入100 mL濾紙條崩解培養(yǎng)基中,添加等量無菌水作為對照,在初篩溫度28 ℃相同條件下靜置培養(yǎng)7 d,觀察濾紙條崩解程度,判斷菌株纖維素的降解能力[9]。

1.2.2 纖維素降解菌酶活性測定

通過纖維素降解菌酶活性測定判斷分離出的菌株纖維素的降解潛力[10]。取培養(yǎng)后的新鮮菌液以體積分數(shù)為2%的接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,28 ℃、170 r/min培養(yǎng)4 d后,發(fā)酵液8 000 r/min離心8 min,取上清液作為粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸法測定FPase[11],通過測定濾紙釋放的還原糖確定其酶活性。

1.2.3 菌株鑒定

將分離并且純化后的具有較強纖維素降解能力的菌株YD4送至上海生工生物公司進行分子生物學鑒定。測序結(jié)果在NCBI上用BLAST程序與GenBank中微生物基因序列進行同源性分析,在NCBI中下載比對相似度高的序列及種屬參考序列,采用Mega軟件進行序列比對分析后,通過Phylogeny菜單中的Construct/Test Neighbor-joining Tree方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 堆肥菌劑

從香菇菌渣中篩選出纖維素降解菌株YD4和DGW1,挑選實驗室保存的SL-44和Rs-198優(yōu)勢菌株,接種量和體積分數(shù)均為2%,配置SL-44+Rs-198+YD4、SL-44+Rs-198+DGW1、Rs-198+DGW1+YD4、SL-44+DGW1+YD4、SL-44+Rs-198+YD4+DGW1等5組微生物菌劑。

1.2.5 堆肥設(shè)計及樣品采集

堆肥實驗在帶有強制通氣系統(tǒng)的120 L泡沫堆肥箱中進行,在堆肥泡沫箱中放入32 kg堆肥原料,通過加入自來水和雞糞,將堆肥原料含水率和C/N比分別調(diào)整至60%和20。為了確保整個堆肥過程中微生物的生存條件,在堆肥泡沫箱底部放置曝氣盤,曝氣速率為0.4 L·min-1。為確保堆體有足夠的氧氣消耗,前兩周每周翻堆2次,之后每周翻動1次。所有堆肥實驗持續(xù)進行30 d。根據(jù)堆肥過程中溫度的變化情況,堆肥過程分為升溫期、嗜溫期、降溫期、腐熟期。在堆肥不同時期進行取樣,分別在堆肥第0、1、5、20、30 d采用四分法取樣,取出的樣品均勻混合獲得樣本,取100 g樣品放置4 ℃冰箱下保存用于生理化學參數(shù)分析。取300 g樣品風干,細碎(100目篩),儲存在室溫下用于進一步的理化性質(zhì)分析。

將微生物菌劑培養(yǎng)至對數(shù)生長期,然后等比混合至640 mL,在堆肥初期時接種到堆體中。取等量蒸餾水作為對照組,接種商品菌劑作為參考,商品菌劑為益加益生物菌肥發(fā)酵劑。

1.2.6 理化指標測定

1) 溫度溫度。每天在早(9:00)、晚(17:00)2個時間點采用紅水溫度計在堆體上中下3個位置進行溫度測量,記錄堆肥的溫度變化,同時記錄室內(nèi)溫度,取平均值用于后續(xù)分析。

2) pH和電導率測定。稱取10 g樣品與100 mL去離子水均勻混合,在30 ℃、180 r /min震蕩2 h后,取上清液用于測定pH及電導率。pH采用pH計進行測定,電導率使用電導率儀進行測定。

3) E4/E6及GI測定。E4/E6是堆肥浸提液在465、665 nm處光密度的比值,用于評估堆肥腐熟程度,E4/E6比值越小,說明堆肥越成熟穩(wěn)定[12]。按照參考文獻[2]的方法計算GI(公式記為IG):

式中:M為處理組種子萌發(fā)率(%);R為處理組種子根長(cm);m為對照組種子萌發(fā)率(%);r為對照組種子根長(cm)。

4) 有機質(zhì)及有效磷。有機質(zhì)含量的測定采用重鉻酸鉀-濃硫酸氧化比色法。有效磷含量測定采用碳酸鈉提取后,通過鉬銻抗顯色紫外分光光度法測定。

1.2.7 實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理

通過Origin軟件繪圖,用IBM SPSS Statistics進行統(tǒng)計分析,并采用Mega軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株YD4分子生物學和理化特性鑒定

提取菌株YD4的基因進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增,對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳(圖1)。利用BLASTN進行序列相似性比對,對YD4菌株進行分類鑒定(圖2)。YD4菌株被鑒定為微桿菌屬,推斷微桿菌屬YD4屬于氧化微桿菌。

圖 1 16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose-gel electrophoresis picture of 16S rDNA

圖 2 菌株YD4的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains YD4

通過對菌株YD4進一步的生理生化特征測定,發(fā)現(xiàn)菌株YD4在接觸酶、明膠、VP、檸檬酸鹽、氧化酶和硝酸鹽還原實驗為陽性;尿素、木糖、硫化氫、靛基質(zhì)實驗為陰性;通過葡萄糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖等判斷菌株YD4為氧化微桿菌(表2)。

表 2 菌株YD4生理生化特征

2.2 菌株的纖維素降解、濾紙崩解和酶活性

纖維素解孢菌C-1菌株進行誘變篩選出的CF-2612菌株FPase為17.8 U/mL,土壤中分離篩選出纖維素降解菌(菌株8E1A),其FPase為0.903 U/mL,嗜熱真菌與經(jīng)典菌株育種方法相結(jié)合篩選出菌株M36,其FPase為4.89 U/mL[13-15]。雖然現(xiàn)在有很多種纖維素降解菌株,但用來堆肥香菇菌渣的微生物卻較少,且FPase大都較低。本文通過羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基初篩,YD4、DGW1、SL-44、Rs-198等4個菌株均產(chǎn)生了明顯的透明圈。為了分析4個株菌的濾紙崩解和纖維素降解能力,培養(yǎng)7 d后,發(fā)現(xiàn)4個株菌均能將濾紙基本降解至糊狀,故對YD4、DGW1、SL-44、Rs-198作酶活性測定。株菌的濾紙條降解程度和酶活性見表3,菌株DGW1的FPase明顯高于其他菌株(p<0.05),超出菌株YD4的FPase(12.06 U/g)9倍多,而且SL-44(95.25 U/g)也有較高的纖維素降解酶活性,這和濾紙崩解結(jié)果大致相同,表明菌株DGW1在濾紙酶活性均高于其他3種菌株。

表 3 株菌的濾紙條降解程度和酶活性

2.3 堆肥溫度

堆肥溫度變化如圖3所示。

圖 3 堆肥溫度變化Fig.3 Temperature change during composting

從圖3可以看出,在環(huán)境溫度無較大波動下,依據(jù)有機質(zhì)的降解情況及堆肥溫度的變化,堆肥過程可分為升溫期、嗜溫期、降溫期和腐熟期4個時期。對照組和商品菌劑組在第3 d溫度超過55 ℃(嗜溫期),其他微生物接種組溫度均在第2 d進入嗜溫期。這是因為微生物菌劑可以加速有機物質(zhì)降解并且促進堆體溫度加速升高,SL-44+Rs-198+YD4和SL-44+Rs-198+YD4+DGW1的高溫期保持時間最長(6 d),SL-44+Rs-198+YD4、Rs-198+DGW1+YD4和SL-44+DGW1+YD4高溫期保持時間較長(5 d),嗜溫期最短的是對照組(3 d)和商品菌劑(4 d)。實驗過程中微生物菌劑組的嗜溫期超過5 d,達到了堆肥無害化處理標準[16]。此外,當堆體溫度低于40 ℃時,表明堆肥已趨于成熟[17]。在所有實驗中,SL-44+Rs-198+YD4+DGW1最快進入腐熟期(13 d),比對照組縮短了2 d,說明復合菌劑的添加明顯促進了堆肥過程。

2.4 堆肥pH和電導率

堆肥中pH和電導率的變化如圖4所示。

(a) pH

從圖4(a)可以看出,各實驗組的pH值從弱酸性變化為弱堿性。pH呈弱酸性是由于微生物的脫氫作用和礦化作用及酸性細菌將含碳物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有機酸,pH呈弱酸性是由于堆肥過程中含氮物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與氨有關(guān),導致堆肥期間pH的變化。在堆肥的嗜溫期,SL-44+Rs-198+YD4+DGW1和商品菌劑的pH值升高更快,表明2種菌劑微生物活性更高。根據(jù)GB/T 18877—2020有機無機復混肥料標準,腐熟堆肥pH值應(yīng)在5.5～8.5之間,每組實驗的pH值均能滿足要求。

從圖4(b)可以看出, 電導率反映了堆肥的含鹽量及堆肥產(chǎn)品的毒性。當電導率<4 mS·cm-1時堆肥產(chǎn)品無毒。堆肥結(jié)束時,每組實驗的電導率都降至3.3 mS·cm-1以下,電導率下降可能與溫度升高引起的氮損失有關(guān)。溫度升高引起大量的氨損失,導致水溶性鹽含量下降,從而引起電導率下降。但堆肥初期電導率值升高的原因可能是因為大量有機質(zhì)的降解產(chǎn)生大量的可溶性鹽。SL-44+Rs-198+YD4+DGW1實驗組的電導率下降幅度最大,說明SL-44+Rs-198+YD4+DGW1在腐熟期會將大量的小鏈有機酸和各種離子轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的化合物,因此與其他5組實驗相比,SL-44+Rs-198+YD4+DGW1微生物菌劑能更好地促進堆肥的腐熟。

2.5 堆肥腐熟度

堆肥產(chǎn)品中的腐殖質(zhì)主要包括腐植酸和富里酸。E4/E6反映腐殖質(zhì)芳香結(jié)構(gòu)的結(jié)合程度,表明腐殖質(zhì)的水平和堆肥腐熟水平[18]。堆肥期間,有機酸通過微生物作用形成穩(wěn)定的腐殖質(zhì),導致E4/E6的減少,提高了堆肥腐熟度。E4/E6值越低,表明腐殖質(zhì)的縮合度和芳構(gòu)化程度越高,分子量越大,即堆肥腐熟度更好,堆肥中E4/E6和GI的變化如圖5所示。

(a) 光密度比值

從圖5(a)可以看出,在升溫期,E4/E6小幅度升高,隨后趨于降低。堆肥腐熟后各實驗組的E4/E6值在6.1至7.1之間。接種組的E4/E6較對照組處理更低,表明在堆肥中接種微生物菌劑促進腐殖質(zhì)形成,提高了堆肥腐熟程度,其中SL-44+Rs-198+YD4+DGW1實驗組的堆體E4/E6最低,表明SL-44+Rs-198+YD4+DGW1的菌劑組合有效提高了堆肥腐熟度。

從圖5(b)可以看出,每組實驗的GI均呈逐漸上升的趨勢,表明隨著堆肥的逐漸腐熟,堆體中的生物毒性正在逐漸降低。由于選取的干雞糞和菌渣生物毒性本身不高,故各個實驗組GI值在堆肥初期均超過80%[19]。SL-44+Rs-198+YD4+DGW1實驗組的GI在堆肥末期達到最高,表明該處理接種的微生物菌劑促進了堆肥腐熟并減少了堆肥毒性。

2.6 堆肥末期有機質(zhì)分析

堆肥末期有機質(zhì)含量如圖6所示。

圖 6 堆肥末期有機質(zhì)含量Fig.6 Content of organic matter at the end of compost

從圖6可以看出,SL-44+Rs-198+YD4+DGW1組的有機質(zhì)含量明顯低于其他組。SL-44+Rs-198+YD4+DGW1菌劑組合的有機質(zhì)損失率最高,表明堆肥期間微生物分解有機質(zhì)用于自身的生長和繁殖,說明SL-44+Rs-198+YD4+DGW1實驗組延長了堆肥嗜溫期。當堆肥的有機質(zhì)含量消耗掉40%左右時,表明堆肥中不穩(wěn)定有機物已完全降解,堆肥成熟且穩(wěn)定。因此,本文中所有實驗組均可認定為已達到腐熟,所有接種組均能加快堆體中有機質(zhì)的降解速度,因為不同微生物菌劑的接種影響了堆肥的微生物群落、堆肥的腐熟程度及營養(yǎng)含量,微生物菌劑中含有的嗜熱和嗜中溫細菌促進了有機質(zhì)的分解。

2.7 堆肥末期有效磷分析

堆肥末期有效磷含量如圖7所示。

圖 7 堆肥末期有效磷含量Fig.7 Content of Olsen-P at the end of compost

從圖7可以看出,SL-44+Rs-198+DGW1+YD4實驗組的有效磷含量最高,養(yǎng)分含量越高,植物在堆肥土中生長的響應(yīng)就越好,微生物菌劑的接種會加速群落的演替從而加速礦化作用,將有機質(zhì)轉(zhuǎn)化為氮、磷、鉀等金屬礦鹽。由于SL-44+Rs-198+DGW1+YD4實驗組的菌劑組合導致的有機質(zhì)降解率最高,所以SL-44+Rs-198+DGW1+YD4處理的有效磷含量最高,但沒有顯著高于其他微生物復合菌劑的處理。接種微生物菌劑處理的堆體,其有效磷含量明顯高于對照組,因為接種的微生物菌與土著微生物菌群之間可能存在一定的協(xié)同作用,能更好地發(fā)揮磷的釋放作用。

3 結(jié) 論

1) 從廢棄香菇菌渣中篩選出的菌株YD4鑒定為氧化微桿菌,具有較強的濾紙降解能力和酶活性。

2) 選用具有降解濾紙纖維素能力的里氏木霉DGW1、枯草芽孢桿菌SL-44和假單胞菌Rs-198與YD4菌株復配,構(gòu)建了優(yōu)異的降解木質(zhì)纖維素的微生物腐熟菌劑組合。

3) 構(gòu)建的5組復合微生物腐熟菌劑(SL-44+Rs-198+YD4、SL-44+Rs-198+DGW1、Rs-198+DGW1+YD4、SL-44+DGW1+YD4、SL-44+Rs-198+YD4+DGW1)均能加速菌渣有機質(zhì)的降解,尤其是SL-44+Rs-198+YD4+DGW1復合菌劑能夠延長堆肥嗜溫期、促進堆肥腐熟,與對照組相比提高了堆肥營養(yǎng)含量和腐熟度。