番瀉葉苷A基于AMPK/Nox4信號(hào)通路對(duì)糖尿病腎病小鼠的作用

申 亮,王培珍,王 鑫

1.華北醫(yī)療健康集團(tuán)峰峰總醫(yī)院中醫(yī)科,邯鄲 056200;2.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥藥學(xué)部,滄州 061000;3.衡水市中醫(yī)院內(nèi)分泌腎病科,衡水 053000

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是由糖尿病引發(fā)的慢性微血管并發(fā)癥中危害性最大的一種疾病[1]。DN對(duì)于腎組織造成的損傷是不可逆的,主要病理表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)增生,最終發(fā)展為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[2]。番瀉葉苷A(sennoside A, SA)是大黃、番瀉葉等中草藥的主要活性成分,有報(bào)道稱SA可改善DN大鼠腎損傷和炎性反應(yīng)[3-4]。本研究則以高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)注射方法建立DN小鼠模型,進(jìn)一步探討SA對(duì)DN小鼠腎組織的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RM2235徠卡切片機(jī)(德國徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司);DxC700AU全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司);HA-8180全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀(日本愛科萊公司);AccuCheck血糖儀(德國羅氏公司);CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)、PowerPac電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 試藥

番瀉葉苷A(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,上海源葉生物科技有限公司);鏈脲佐菌素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%,北京諾其雅盛生物科技有限公司);轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和尿總蛋白(urine total protein, UTP)試劑盒均購自美國R&D公司;血清肌酐(serum creatinine, Scr)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assy,ELISA)試劑盒(英國Cayman公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)ELISA試劑盒均購自美國DSL公司;腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抗體、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase,p-AMPK)抗體均購自美國CST公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4, Nox4)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin,Ig G)均購自美國Abcam公司。

1.3 動(dòng)物

80只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠,10周齡,體質(zhì)量為(24±2) g,購自賽業(yè)模式生物研究中心(太倉)有限公司,許可證號(hào)為SCXK(蘇)2018-0003,12 h/12 h明暗交替,室溫飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 建模

取64只小鼠用STZ腹腔注射法建立DN模型。小鼠用高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周后,制備10 g·L-1STZ溶液(溶于pH值為4.4的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液中),按40 mg·kg-1·d-1的劑量注射,對(duì)照組注射檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液,連續(xù)7 d[5]。72 h后測(cè)空腹血糖,收集24 h尿液,測(cè)24 h UTP,血糖≥16.7 mmol·L-1、24 h UTP≥30 mg表明DN小鼠模型建立成功[6]。

2.2 干預(yù)方法

將建模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組及SA低、中和高劑量組4組,各16只。SA低、中和高劑量組分別以15、30、60 mg·kg-1劑量按3 mL·d-1腹腔注射SA[7],連續(xù)給藥28 d。對(duì)照組和模型組注射等體積生理鹽水。

2.3 一般指標(biāo)觀察

各組小鼠干預(yù)后禁食12 h后稱取體質(zhì)量,并通過尾靜脈采血,檢測(cè)各組小鼠血糖(fasting blood glucose, FBG)變化;收集各組小鼠干預(yù)結(jié)束24 h后尿液;用30 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉小鼠,腹主動(dòng)脈采集血液樣本后以3 000 r·min-1離心15 min,取上清,-80 ℃保存;斷頸處死小鼠后取雙側(cè)腎臟,去除脂肪組織,4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖洗,濾紙吸取水分后用電子天平稱定質(zhì)量,計(jì)算腎指數(shù)。腎指數(shù)=雙腎質(zhì)量(mg)/處死前總體質(zhì)量(g)。

2.4 腎功能、糖脂代謝指標(biāo)檢測(cè)

取各組小鼠2.3血清樣本,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、三酰甘油(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)和膽固醇(cholesterin, TC)水平;ELISA檢測(cè)血清Scr、BUN水平;用糖化血紅蛋白分析儀檢測(cè)糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin A1c, HbA1c)水平。取各組小鼠2.3尿液樣本用試劑盒檢測(cè)24 h UTP水平。

2.5 組織學(xué)觀察

取各組8只小鼠腎組織于40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h,經(jīng)梯度體積分?jǐn)?shù)的乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋、切片,常規(guī)HE染色,封片后于顯微鏡下觀察。

2.6 腎組織TGF-β1、TNF-α水平檢測(cè)

取各組剩余小鼠腎組織,將腎組織剪碎,加入預(yù)冷PBS緩沖液(固液比=1∶9)于冰上勻漿,勻漿液于4 ℃以8 000 r·min-1離心10 min,取上清低溫保存。取部分腎組織勻漿上清按照ELISA試劑盒說明書操作,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處樣品的吸光度(A)值,根據(jù)樣品A值計(jì)算TGF-β1、TNF-α質(zhì)量濃度。

2.7 腎組織SOD、MDA和CAT水平檢測(cè)

取腎組織勻漿上清,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒檢測(cè),用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定SOD的A值,在535 nm處測(cè)定MDA的A值,根據(jù)A值計(jì)算樣品SOD和MDA的水平。

2.8 腎組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

取腎組織勻漿上清用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量,取樣本20 μg與等量上樣緩沖液混勻進(jìn)行SDS-PAGE電泳,100 V電轉(zhuǎn)30 min,轉(zhuǎn)至PVDF膜上,適量封閉液室溫封閉2 h,將膜放入1∶1 000稀釋的AMPK、p-AMPK和Nox4一抗中,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,再放入1∶4 000稀釋的二抗中,室溫孵育1 h,TBST洗膜。向PVDF膜滴加適量顯影液,置于凝膠成像儀的顯影區(qū),設(shè)置參數(shù)后于暗室中曝光、顯影,Image J軟件分析。蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 腎臟指數(shù)和腎功能指標(biāo)的比較

模型組腎臟指數(shù)、BUN、Scr和24 h TUP水平較對(duì)照組升高,SA各劑量組腎臟指數(shù)、BUN、Scr和24 h TUP水平較模型組降低(P<0.05);腎臟指數(shù)、BUN、Scr和24 h TUP水平與SA呈劑量依賴性降低(P<0.05)。見表1。

表1 腎臟指數(shù)和腎功能指標(biāo)的比較

3.2 各組小鼠糖脂代謝指標(biāo)比較

模型組給藥后TC、TG、LDL-C、FBG和Hb Alc水平較對(duì)照組升高,HDL-C較對(duì)照組降低(P<0.05);SA各劑量組TC、TG、LDL-C、FBG和Hb Alc水平較模型組降低,HDL-C較模型組升高(P<0.05);TC、TG、LDL-C、FBG和Hb Alc水平與SA呈劑量依賴性降低,HDL-C與SA呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表2、表3。

表2 各組小鼠脂代謝指標(biāo)的比較

表3 各組小鼠糖代謝指標(biāo)的比較

3.3 腎組織病理學(xué)比較

對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)正常,未見明顯病理學(xué)變化;模型組腎小球增生肥大存在腫脹變形、組織結(jié)構(gòu)排列不均勻,腎小管上皮細(xì)胞可見大量炎性細(xì)胞浸潤,腔間隙縮小,SA低劑量、中劑量和高劑量組小鼠腎組織的不良形態(tài)有所改善,SA低劑量、中劑量和高劑量組小鼠腎小球變形減輕,上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。見圖1。

3.4 各組小鼠TGF-β1、TNF-α水平比較

模型組TGF-β1、TNF-α水平較對(duì)照組升高(P<0.05);SA各劑量組TGF-β1、TNF-α水平較模型組降低(P<0.05);TGF-β1、TNF-α水平與SA呈劑量依賴性降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠TGF-β1、TNF-α水平的比較

3.5 各組小鼠SOD、MDA水平的比較

模型組MDA水平較對(duì)照組升高,SOD水平較對(duì)照組降低(P<0.05);SA各劑量組MDA水平較模型組降低,SOD水平較模型組升高(P<0.05);MDA水平與SA呈劑量依賴性降低,SOD水平與SA呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組小鼠SOD、MDA水平的比較

3.6 腎組織中p-AMPK、Nox4蛋白的表達(dá)水平比較

模型組Nox4蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組升高,p-AMPK蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組降低(P<0.05);SA各劑量組Nox4蛋白的表達(dá)水平較模型組降低,p-AMPK蛋白的表達(dá)水平較模型組升高(P<0.05);Nox4蛋白的表達(dá)水平與SA呈劑量依賴性降低,p-AMPK蛋白的表達(dá)水平與SA呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表6、圖2。

注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.SA低劑量組;D.SA中劑量組;E.SA高劑量組。

表6 腎組織中p-AMPK、Nox4蛋白表達(dá)水平的比較

4 討論

DN初期病癥為腎小球?yàn)V過能力增高及尿白蛋白外排,故UTP和BUN可作為其診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。Scr是肌肉代謝產(chǎn)物,一般隨尿液排出,而當(dāng)腎組織出現(xiàn)功能障礙時(shí),Scr排出被抑制。DN的發(fā)生、發(fā)展與血糖、血脂水平紊亂有關(guān)。高糖導(dǎo)致各種細(xì)胞因子活化、激活,促進(jìn)腎臟系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成,高脂使脂肪存儲(chǔ)于腎臟增加了由LDL介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和腎小球巨噬細(xì)胞釋放化學(xué)介質(zhì)[9-10]。TGF-β1是糖尿病中導(dǎo)致腎臟ECM積累的關(guān)鍵細(xì)胞因子,可促進(jìn)炎癥因子TNF-α的分泌,導(dǎo)致ECM堆積從而加速DN進(jìn)展[11-12]。而腎臟氧化應(yīng)激是TGF-β1高表達(dá)和ECM增生的主要原因之一[13]。MDA的含量變化反映了過氧化程度[14],SOD是MDA主要的清除酶,反映機(jī)體的抗氧化損傷能力[15]。本研究中SA各劑量組腎臟指數(shù)、BUN、Scr、24 h TUP、TC、TG、LDL-C、FBG、HbAlc、TGF-β1、TNF-α和MDA水平較模型組降低,HDL-C、SOD水平較模型組升高,表明SA可有效促進(jìn)DN小鼠腎功能的恢復(fù),改善糖脂代謝,降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷,延緩腎臟纖維化從而保護(hù)腎臟。

AMPK不僅是細(xì)胞負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)機(jī)體的糖脂代謝和能量代謝的能量傳感器,還是調(diào)控細(xì)胞氧化平衡的傳感器[16]。作為AMPK調(diào)控氧化平衡的下游,Nox4在腎小球和腎小管細(xì)胞中廣泛表達(dá),介導(dǎo)Nox4可引發(fā)腎組織釋放大量活性氧,促進(jìn)腎纖維化損傷[17-18]。有研究報(bào)道,AMPK的激活可以阻斷Nox4活性,減少活性氧積累,抑制糖尿病腎臟肥大和ECM表達(dá)增加[19]。通過激活A(yù)MPK/Nox4信號(hào)通路,可保護(hù)單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的小鼠腎損傷[20]。本研究中SA各劑量組Nox4蛋白表達(dá)水平較模型組降低,p-AMPK蛋白表達(dá)水平較模型組升高,表明SA可改善DN小鼠的糖脂代謝紊亂,減少氧化應(yīng)激損傷,可能與AMPK/Nox4信號(hào)通路蛋白調(diào)控有關(guān)。

綜上所述,SA可有效恢復(fù)DN小鼠腎功能,改善糖脂代謝紊亂,降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷,其可能與調(diào)控AMPK/Nox4信號(hào)通路有關(guān)。