縮宮素對流產(chǎn)大鼠子宮出血凝血功能的影響

王薔薇,張鳳蓮,李 輝

1.河南黃河科技學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,鄭州 450000;2.南陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,南陽 473000

米非司酮配伍米索前列醇是藥物流產(chǎn)的常用藥物,其效果顯著,妊娠7周內(nèi)完全流產(chǎn)率超過90%[1]。但部分患者存在流產(chǎn)后子宮異常出血問題,易誘發(fā)月經(jīng)紊亂、貧血等并發(fā)癥,甚至造成突發(fā)性大出血[2]?？s宮素是孕婦分娩過程中常用的催產(chǎn)藥物,可刺激子宮平滑肌收縮、促進(jìn)子宮頸擴(kuò)張,且具有催乳及降低血壓的作用,近年來研究發(fā)現(xiàn),其可用于治療藥物流產(chǎn)后的子宮出血,可增強(qiáng)子宮收縮、促進(jìn)月經(jīng)復(fù)潮,但其作用機(jī)制尚不明確[3]。本研究通過建立流產(chǎn)大鼠子宮出血模型,探討縮宮素對其凝血功能的影響及其可能的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

C2000血凝分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司);Gemini XPS酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司);BX43顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 試藥

縮宮素(規(guī)格為10 U·mL-1,南京新百藥業(yè)有限公司);米非司酮片(規(guī)格為25 mg、0.2 mg,上海新華聯(lián)制藥有限公司);孕酮酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assy,ELISA)試劑盒、雌二醇ELISA試劑盒及免疫組織化學(xué)染色試劑盒,均購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司;兔抗大鼠CD31、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo-proteinase-9,MMP-9)一抗均購自美國R&D公司。

1.3 動(dòng)物

75只SPF級SD大鼠[雄性:25只,8周齡,體質(zhì)量為(300±15) g;未孕雌性:50只,8周齡,體質(zhì)量為(240±10) g],均購自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營部,生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2018-0006。

2 方法

2.1 模型建立

建立流產(chǎn)大鼠子宮出血模型[4],將處于發(fā)情期的大鼠按雌雄比例2∶1合籠,次日早晨進(jìn)行陰道液涂片檢查,觀察到有陰栓或精子即為受孕成功,記為受孕第1日,第7日9:00,灌胃米非司酮(11.4 mg·kg-1),10 h后灌胃米索前列醇(125 μg·kg-1),陰道內(nèi)塞入大小合適的消毒棉球,次日8:00取出,觀察棉球有血跡即為建模成功,將棉球置于離心管冷藏保存并更換新棉球,每日8:00、18:00取出保存,持續(xù)7 d。

2.2 分組及干預(yù)

75只大鼠合籠交配,共得孕鼠45只,36只孕鼠全部成功建立流產(chǎn)子宮出血模型,隨機(jī)分為流產(chǎn)組及縮宮素低劑量、中劑量和高劑量組,各9只,剩余9只孕鼠造模同時(shí)灌胃等量生理鹽水,設(shè)為正常組。造模后次日,根據(jù)《藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算》進(jìn)行換算,縮宮素低劑量、中劑量、高劑量組皮下注射縮宮素(劑量分別為1、2、4 u·kg-1);正常組、流產(chǎn)組皮下注射等量生理鹽水。每日1次,干預(yù)7 d[5-6]。

2.3 組織取材

末次干預(yù)次日,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采集腹主動(dòng)脈血,取微量冷藏,用于測定出血量,部分加入抗凝劑冷藏,用于檢測凝血指標(biāo),剩余血液以3 000 r·min-1離心5 min(離心半徑為8 cm)獲取血清,冷藏,用于檢測性激素;采血后脊椎脫臼處死大鼠,冰上開腹取得完整子宮,切取部分子宮及子宮內(nèi)膜組織,經(jīng)40 g·L-1多聚甲醛固定,脫水、透明、浸蠟及包埋,切成4 μm厚度,分別用于HE染色及免疫組織化學(xué)染色;另取部分子宮內(nèi)膜組織投入液氮中保存,用于相關(guān)蛋白的檢測。

2.4 子宮出血量檢測

取冷藏腹主動(dòng)脈血0.02 mL,滴入50 g·L-1氫氧化鈉溶液4 mL中溶解;將收集7 d出血棉球投入50 g·L-1氫氧化鈉溶液,浸泡、搓洗出全部血液,用分光光度計(jì)檢測動(dòng)脈血溶解液與血棉球浸出液在546 nm波長處的吸光度值,計(jì)算子宮出血量。子宮出血量(mL)=(腹主動(dòng)脈血體積×血棉球溶解50 g·L-1氫氧化鈉溶液體積×血棉球浸出液吸光度值)/(腹主動(dòng)脈血溶解50 g·L-1氫氧化鈉溶液體積×腹主動(dòng)脈血溶解液吸光度值)。

2.5 凝血功能指標(biāo)檢測

取通過抗凝劑冷藏保存的腹主動(dòng)脈血,用血凝分析儀檢測各組血液凝血功能指標(biāo):凝血酶時(shí)間(thrombin time, TT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)。

2.6 血清孕酮、雌二醇水平檢測

取冷藏的腹主動(dòng)脈血清,用ELISA法測定血清孕酮、雌二醇的質(zhì)量濃度,按照試劑盒說明書操作,用酶標(biāo)儀測定546 nm波長處的吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算血清孕酮、雌二醇的質(zhì)量濃度。

2.7 子宮內(nèi)膜微血管密度檢測

取子宮內(nèi)膜組織切片,二甲苯脫蠟,用免疫組織化學(xué)法觀察子宮內(nèi)膜微血管新生情況,浸入30 g·L-1過氧化氫溶液靜置10 min,取出,滴入抗原修復(fù)液,微波高溫修復(fù)抗原,自然冷卻至40 ℃,蒸餾水沖洗,加入胎牛血清封閉30 min,棄血清,加入兔抗大鼠CD31一抗(1∶500),4 ℃冷藏過夜,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,PBS清洗,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水后滴加中性樹脂封片,隨機(jī)選取5個(gè)不相鄰血管密集區(qū)視野,將棕褐色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞群記錄為1個(gè)血管,記錄視野內(nèi)血管總數(shù),計(jì)算微血管密度(microvessel density,MVD)。

2.8 HE染色觀察子宮組織病理變化

取子宮組織切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,經(jīng)常規(guī)蘇木素-伊紅染色,脫水、透明,中性樹脂封片,置于光學(xué)顯微鏡下觀察子宮組織的病理改變。

2.9 免疫印跡法檢測子宮內(nèi)膜組織VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)

取用液氮保存的子宮內(nèi)膜組織,用眼科剪剪碎,充分研磨并勻漿,用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,注入離心管內(nèi),冰上以10 000 r·min-1離心10 min(離心半徑為12 cm),取上清經(jīng)BCA試劑盒定量蛋白。取微量蛋白樣本,加入上樣緩沖液混勻,水浴加熱變性蛋白,電壓80 V行凝膠電泳分離,濕法轉(zhuǎn)膜,加入50 g·L-1脫脂牛奶封閉2 h,TBST清洗,混合兔抗大鼠VEGF、MMP-9一抗(1∶500),4 ℃冷藏過夜,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,ECL發(fā)光,暗盒顯影,用成像分析儀掃描并分析蛋白條帶的灰度值,VEGF或MMP-9蛋白相對表達(dá)量=VEGF或MMP-9蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 子宮出血量比較

與流產(chǎn)組比較,縮宮素低劑量組子宮出血量減少(P<0.05);與縮宮素低劑量組比較,縮宮素中劑量組子宮出血量減少(P<0.05);與縮宮素中劑量組比較,縮宮素高劑量組子宮出血量減少(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠子宮出血量的比較

3.2 凝血功能指標(biāo)比較

與正常組比較,流產(chǎn)組TT、PT及APTT延長(P<0.05);與流產(chǎn)組比較,縮宮素低劑量組TT、PT及APTT縮短(P<0.05);與縮宮素低劑量組比較,縮宮素中劑量組TT、PT及APTT縮短(P<0.05);與縮宮素中劑量組比較,縮宮素高劑量組TT、PT及APTT縮短(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠凝血功能指標(biāo)的比較

3.3 性激素指標(biāo)比較

與正常組比較,流產(chǎn)組血清孕酮、雌二醇水平降低(P<0.05);與流產(chǎn)組比較,縮宮素低劑量組血清孕酮、雌二醇水平升高(P<0.05);與縮宮素低劑量組比較,縮宮素中劑量組血清孕酮、雌二醇水平升高(P<0.05);與縮宮素中劑量組比較,縮宮素高劑量組血清孕酮、雌二醇水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清性激素指標(biāo)的比較

3.4 子宮內(nèi)膜MVD比較

與正常組比較,流產(chǎn)組子宮內(nèi)膜MVD降低(P<0.05);與流產(chǎn)組比較,縮宮素低劑量組子宮內(nèi)膜MVD升高(P<0.05);與縮宮素低劑量組比較,縮宮素中劑量組子宮內(nèi)膜MVD升高(P<0.05);與縮宮素中劑量組比較,縮宮素高劑量組子宮內(nèi)膜MVD升高(P<0.05)。見表4、圖1。

注:A.正常組;B.流產(chǎn)組;C.縮宮素低劑量組;D.縮宮素中劑量組;E.縮宮素高劑量組。

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜MVD的比較

3.5 子宮組織病理變化

HE染色結(jié)果顯示,正常組子宮內(nèi)膜厚度、形態(tài)正常;流產(chǎn)組子宮內(nèi)膜、平滑肌厚度減小,結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,子宮內(nèi)膜大面積脫落,宮腔擴(kuò)張;縮宮素低劑量、中劑量、高劑量組內(nèi)膜結(jié)構(gòu)基本完整,內(nèi)膜修復(fù)情況良好,宮腔擴(kuò)張基本恢復(fù),平滑肌增厚,隨縮宮素劑量的增加病理改善愈加顯著。見圖2。

注:A.正常組;B.流產(chǎn)組;C.縮宮素低劑量組;D.縮宮素中劑量組;E.縮宮素高劑量組。

3.6 子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)量比較

與正常組比較,流產(chǎn)組子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)量升高(P<0.05);與流產(chǎn)組比較,縮宮素低劑量組子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05);與縮宮素低劑量組比較,縮宮素中劑量組子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05);與縮宮素中劑量組比較,縮宮素高劑量組子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)量的比較

4 討論

藥物流產(chǎn)是依靠米非司酮孕激素受體拮抗劑的特性,競爭性結(jié)合位于子宮內(nèi)膜及宮頸體的孕激素受體結(jié)合位點(diǎn),致使滋養(yǎng)細(xì)胞死亡、胚胎發(fā)育停滯,再通過米索前列醇的促宮頸膠原降解作用,使宮頸軟化、子宮收縮,刺激妊娠物排出[7]。藥物流產(chǎn)后,由于子宮收縮不良,淤血及妊娠殘留物未完全排出,大量病菌繁殖導(dǎo)致宮腔感染,促進(jìn)血栓脫落,誘發(fā)出血,同時(shí)米非司酮具有抗凝血特性,將進(jìn)一步延長出血時(shí)間,阻礙子宮內(nèi)膜血管新生[8-9]。因此,恢復(fù)正常凝血功能、促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)是治療藥物流產(chǎn)后子宮出血的關(guān)鍵。

雌二醇是機(jī)體分泌的天然性激素,可刺激子宮內(nèi)膜生長,修復(fù)破損內(nèi)膜,抑制宮頸黏液分泌,提升子宮對縮宮素的敏感性,促進(jìn)淤血及殘留物排出[10-11]。孕酮可抑制促性腺激素分泌,降低雌激素水平,促進(jìn)內(nèi)膜組織蛻膜萎縮并促進(jìn)其排出[12]。CD31是血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物之一,可準(zhǔn)確反映組織器官M(fèi)VD,而子宮內(nèi)膜MVD是評價(jià)子宮內(nèi)膜修復(fù)情況的重要指標(biāo)之一[13]?？s宮素是由垂體后葉分泌的一種環(huán)狀多肽類激素,經(jīng)神經(jīng)垂體緩慢釋放,可舒緩壓力、增加組織供氧,可與子宮平滑肌內(nèi)的受體結(jié)合,激活鈣離子泵,促使肌漿網(wǎng)釋放鈣,從而促進(jìn)子宮節(jié)律性收縮,封閉子宮肌層血管,抑制子宮出血[14]。WHITEHOUSE K等[15]研究發(fā)現(xiàn),預(yù)防性注射縮宮素可降低在擴(kuò)張和排空期間子宮的失血量及失血頻率,提示其可作為抑制子宮出血的備選藥物。本研究結(jié)果顯示,與流產(chǎn)組比較,縮宮素低劑量、中劑量和高劑量組子宮出血量減少,TT、PT、APTT縮短,血清孕酮、雌二醇水平、子宮內(nèi)膜MVD升高,表明縮宮素可抑制子宮出血、增強(qiáng)凝血功能、改善性激素水平和促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長。

VEGF是機(jī)體調(diào)控血管生成的重要調(diào)控分子之一,可與血管內(nèi)皮細(xì)胞促有絲分裂受體結(jié)合,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,當(dāng)子宮受損后,VEGF參與子宮內(nèi)膜血管修復(fù)而表達(dá)增加,但過度表達(dá)將導(dǎo)致血管過度擴(kuò)張、血管通透性提升,加重子宮出血,對子宮內(nèi)膜恢復(fù)造成不利影響[16]。MMP-9是細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜降解蛋白酶,參與多種出血類疾病的發(fā)生和發(fā)展,正常狀態(tài)下受孕酮限制其處于低表達(dá)狀態(tài)[17]。流產(chǎn)后機(jī)體孕酮水平降低,MMP-9在VEGF的刺激下大量合成、分泌,血管基底膜被大量降解,血管基本結(jié)構(gòu)受創(chuàng)且脆性增加,炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重,子宮內(nèi)膜修復(fù)困難,子宮出血量增加[18-19]。趙永新等[20]研究發(fā)現(xiàn),抑制VEGF、MMP-9表達(dá)可治療圍絕經(jīng)期子宮肌瘤并發(fā)的異常子宮出血,提示二者可能作為治療子宮出血的有效靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,與正常組比較,流產(chǎn)組子宮組織VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)量升高,經(jīng)縮宮素干預(yù)后二者表達(dá)量降低,且表現(xiàn)為劑量依賴,表明VEGF、MMP-9在流產(chǎn)子宮出血中異常高表達(dá),縮宮素可能通過降低二者表達(dá)治療藥物流產(chǎn)后子宮出血。

綜上所述,縮宮素可抑制子宮出血、提升凝血功能、改善性激素水平、促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長,推測其作用機(jī)制可能與抑制VEGF、MMP-9的表達(dá)有關(guān)。