一測(cè)多評(píng)法在大柴胡顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

陳 輝,周婷婷,柏 倩

海安市中醫(yī)院藥劑科,海安 226600

大柴胡顆粒源于漢代張仲景《傷寒論》中記載的大柴胡湯,主要由柴胡、黃芩、大黃、枳實(shí)、芍藥、半夏、大棗、生姜8味藥組成,其中柴胡和黃芩為君藥,大黃和枳實(shí)為臣藥,芍藥和半夏為佐藥,大棗和生姜為使藥。大柴胡顆粒是將大柴胡湯用現(xiàn)代制藥工藝提取后經(jīng)噴霧干燥制成的顆粒制劑,功效與大柴胡湯相同,具有和解少陽(yáng)、內(nèi)瀉熱結(jié)的功效[1]。臨床常用大柴胡顆粒治療因少陽(yáng)不和和肝膽濕熱所致的口苦、舌紅苔黃膩、大便秘結(jié)、膽囊炎等[2-3]。此外,大柴胡顆粒對(duì)血糖、血脂和血壓具有較好的調(diào)節(jié)作用,可有效緩解腦出血癥狀,減輕或消除肺部感染[4]。目前關(guān)于大柴胡顆粒有效成分含量測(cè)定的報(bào)道有限,并且《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)中尚無(wú)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的記載,因此繼續(xù)完善大柴胡顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)有重要意義。中藥成分復(fù)雜多樣,單一成分定量很難全面地進(jìn)行質(zhì)量控制,多組分定量則更為科學(xué)、可靠。一測(cè)多評(píng)法(quantitative analysis of multi-components by single-marker method, QAMS)基于中藥成分內(nèi)在函數(shù)及比例關(guān)系,用廉價(jià)、易得的對(duì)照品同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種成分的定量控制,已逐漸被業(yè)內(nèi)學(xué)者和制藥工業(yè)認(rèn)可,近年來(lái)已被用于多種中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià),而且被2020年版《中國(guó)藥典》收載。QAMS不但適用于同類化合物(如黃酮類、皂苷類等)的質(zhì)量控制[5],而且適用于不同種類化合物的質(zhì)量控制[6-7]。本研究以黃芩苷為對(duì)照,用QAMS同時(shí)測(cè)定大柴胡顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的含量,為提高大柴胡顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Alliance e2695型液相色譜儀、Waters XBridge C18(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)色譜柱(美國(guó)Waters公司);Agilent-1260型液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);Thermo Ultimate 3000型標(biāo)準(zhǔn)雙系統(tǒng)液相色譜儀、Thermo Hypersil GOLD(150 mm×4.6 mm,3 μm)色譜柱(美國(guó)Thermo Fisher公司);MS204TS/02型和XSE105DU型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);TGL 16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥

對(duì)照品:柴胡皂苷B1(批號(hào)190621-009,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.34%)、柴胡皂苷B2(批號(hào)58316-41-9,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%),均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司;漢黃芩素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.0%)、漢黃芩苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%)、黃芩苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>94.0%)、黃芩素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>97.0%),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇為色譜純;水為超純水;磷酸等試劑均為分析純。

大柴胡顆粒(批號(hào):100103、110801、110802,精華制藥集團(tuán)股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2對(duì)照品適量,加甲醇配制成各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(質(zhì)量濃度均為1 mg·mL-1)。分別精密量取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,置于同一量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,配制成黃芩苷100 μg·mL-1、漢黃芩苷20 μg·mL-1、黃芩素5 μg·mL-1、漢黃芩素2 μg·mL-1、柴胡皂苷B12 μg·mL-1和柴胡皂苷B24 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取大柴胡顆粒細(xì)粉約1.0 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇,密塞,稱定質(zhì)量,超聲,用體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò)。吸取5 mL濾液,置于25 mL量瓶中,加體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇至刻度,密塞,搖勻,濾過(guò),將濾液離心,取上清液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),即得供試品溶液。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

除柴胡和黃芩外,其他藥材按大柴胡顆粒原配方比例稱取,按其生產(chǎn)工藝分別制成柴胡陰性樣品顆粒(不含柴胡)、黃芩陰性樣品顆粒(不含黃芩)以及黃芩和柴胡陰性樣品顆粒(不含柴胡和黃芩),按照2.2項(xiàng)下的方法制備各陰性對(duì)照品溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18柱。流動(dòng)相為甲醇(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B),梯度洗脫(0～5 min,10% A;5～20 min,10%～45% A;20～45 min,45%～80% A;45～50 min,80%～90% A;50～52 min,90% A;52～55 min,90%～10% A;55～60 min,10% A)。流速為0.4 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,柱溫為35 ℃,進(jìn)樣體積為10 μL,分析時(shí)間為60 min。

2.5 專屬性考察

取供試品溶液、對(duì)照品溶液和各陰性對(duì)照品溶液,按照2.4項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。6個(gè)成分色譜峰均可達(dá)到基線分離,與相鄰色譜峰分離度均>1.5,表明分離度良好,并且陰性對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

注:1.黃芩苷;2.漢黃芩苷;3.黃芩素;4.漢黃芩素;5.柴胡皂苷B2;6.柴胡皂苷B1;A.供試品溶液;B.混合對(duì)照品溶液;C.黃芩陰性對(duì)照品溶液;D.柴胡陰性對(duì)照品溶液;E.黃芩和柴胡陰性對(duì)照品溶液;F.空白輔料對(duì)照品溶液。

2.6 精密度

精密吸取混合對(duì)照品溶液,按照2.4項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定并計(jì)算6種成分的保留時(shí)間、相對(duì)峰面積及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2峰面積的RSD值分別為2.13%、1.23%、1.55%、1.68%、1.84%、1.95%,保留時(shí)間的RSD值分別為1.82%、1.25%、2.34%、1.46%、1.75%、2.21%,表明儀器的精密度良好。

2.7 線性范圍考察

精密吸取2.1項(xiàng)下制備的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量,梯度稀釋為6個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液,按照2.4項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各化合物的峰面積。分別以各化合物的質(zhì)量濃度和峰面積進(jìn)行線性回歸,得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù),見(jiàn)表1。

表1 各成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.8 重復(fù)性

取同一批大柴胡顆粒供試品6份,按照2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按照2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,每份樣品各進(jìn)樣1次,考察6種化合物的特征峰保留時(shí)間和峰面積,計(jì)算RSD值。計(jì)算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2含量的RSD值分別為2.12%、1.84%、1.56%、2.13%、2.25%、1.84%,保留時(shí)間的RSD分別為1.88%、1.64%、2.15%、1.84%、1.87%、2.29%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性

取大柴胡顆粒供試品1份,按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于0、4、8、12、24、36、48 h按照2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,考察6種化合物特征峰的保留時(shí)間和峰面積,計(jì)算RSD值。計(jì)算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2含量的RSD值分別為1.86%、1.59%、1.86%、1.88%、1.73%、2.07%,保留時(shí)間的RSD值分別為2.04%、1.75%、1.49%、1.93%、1.54%、1.79%,表明6種成分的溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率

取已知黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2含量的大柴胡顆粒粉末約0.5 g,精密稱定,共6份,分別精密加入黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2對(duì)照品,使所加入的對(duì)照品的質(zhì)量和供試品中各成分的含量基本一致,按照2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按照2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定和計(jì)算6種化合物峰面積的RSD值。結(jié)果顯示,6種化合物的加樣回收率在100.38%～102.00%范圍內(nèi),6種成分的RSD值在1.29%～1.82%范圍內(nèi),表明該方法的準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大柴胡顆粒中6種化合物的加樣回收率結(jié)果 (n=6)

2.11 色譜峰定位的確定

2.11.1色譜峰定位 取2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液,分別精密吸取不同體積(5、10、15 μL)分別進(jìn)樣3次,按照2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,以黃芩苷為內(nèi)標(biāo),測(cè)定漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的相對(duì)保留時(shí)間(Rt),取其平均值作為最終的結(jié)果。結(jié)果表明,漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相對(duì)于黃芩苷的相對(duì)保留時(shí)間分別為1.443、2.066、2.684、4.577、4.322,RSD值均≤2.33%,表明各化合物的相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)較小。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大柴胡顆粒中漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的相對(duì)保留時(shí)間 (n=9)

2.11.2色譜峰定位的重復(fù)性考察 取2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液,按照2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,分別考察Waters Alliance e2695型高效液相色譜儀、Agilent-1260型高效液相色譜儀和Thermo Ultimate 3000 型高效液相色譜儀3種高效液相色譜系統(tǒng)以及Waters XBridge C18和Thermo Hypersil GOLD對(duì)5種化合物色譜峰定位的影響。結(jié)果表明,漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相對(duì)于黃芩苷的相對(duì)保留時(shí)間分別為1.451、2.070、2.688、4.586、4.321,RSD≤2.38%,表明各化合物的色譜峰定位在不同的超高效液相色譜儀和不同色譜柱間具有良好的重復(fù)性。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同高效液相儀器和色譜柱下漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的相對(duì)保留時(shí)間 (n=6)

2.12 相對(duì)校正因子(RCF)的確定

2.12.1RCF的計(jì)算方法 取2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液,分別精密吸取不同體積(5、10、15 μL)分別進(jìn)樣3次,按照2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,以黃芩苷為內(nèi)標(biāo),測(cè)定漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2峰面積的RCF,取其平均值作為最終的結(jié)果。RCF=(Cs×Ak)/(Ck×As),Cs為參照物黃芩苷的質(zhì)量濃度,As為參照物色譜峰的峰面積,Ck和Ak分別為漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的質(zhì)量濃度和峰面積。結(jié)果表明,漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相對(duì)于黃芩苷的相對(duì)校正因子平均值分別為0.773、0.519、0.579、1.081、0.834,RSD值均≤1.33%,表明相對(duì)校正因子波動(dòng)較小。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 大柴胡顆粒中漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相對(duì)于黃芩苷的RCF (n=9)

2.12.2RCF的重復(fù)性考察 取混合對(duì)照品溶液,按照2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,分別考察Waters Acquity 超高效液相色譜儀、Eksigent Ekspert Ultra LC 100型超高效液相色譜儀和Thermo Scientific Vanquish超高效液相色譜儀3種高效液相色譜系統(tǒng)以及Waters XBridge C18和Thermo Hypersil GOLD對(duì)5種化合物RCF的影響。結(jié)果表明,在各種條件下漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的RCF分別為0.771、0.519、0.577、1.080、0.837,RSD值均≤1.54%,表明各化合物的RCF在不同高效液相色譜儀與不同色譜柱間重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同高效液相儀器和不同色譜柱下各成分相對(duì)于黃芩苷的RCF (n=6)

2.13 樣品的測(cè)定及驗(yàn)證

取6批大柴胡顆粒,按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,用外標(biāo)法(ESM)和QAMS法測(cè)定6種化合物的含量,結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果顯示,2種測(cè)量方法所得結(jié)果的RSD值均≤1.48%,表明QAMS 法可作為大柴胡顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的質(zhì)量控制方法。該方法準(zhǔn)確、可靠。

表7 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定大柴胡顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的含量結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇

大柴胡顆粒中柴胡和黃芩為君藥,為了整體、全面地評(píng)價(jià)和控制其質(zhì)量,以君藥(柴胡和黃芩)的有效成分作為指標(biāo)成分對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制。2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)柴胡中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量進(jìn)行控制[8]。但大柴胡顆粒制備過(guò)程中柴胡為水煎提取,柴胡皂苷的原型成分易轉(zhuǎn)化為次生皂苷,且在酸性洗脫系統(tǒng)下易發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化,因此選擇柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2作為柴胡質(zhì)量控制的指標(biāo)。黃芩味苦、性寒,有清熱燥濕、瀉火解毒的功效,藥效學(xué)研究表明主要是黃酮類化合物(包括黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素)發(fā)揮藥理作用,因此選擇以上4種黃酮類化合物對(duì)黃芩進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.2 內(nèi)參的選擇

QAMS僅需1個(gè)價(jià)廉、易得的有效成分, 即可實(shí)現(xiàn)多成分的同步測(cè)定[9]。藥效學(xué)研究表明,黃芩中的主要藥效成分為黃酮類化合物,黃芩苷的含量高、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉,同時(shí)黃芩苷已成為黃芩飲片、小柴胡顆粒和大柴胡顆粒等質(zhì)量控制的檢測(cè)指標(biāo),現(xiàn)代藥理研究表明,黃芩苷具有顯著的生物活性[10]。因此,本研究選擇黃芩苷作為QAMS的內(nèi)標(biāo)物。

3.3 流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本研究篩選了多種流動(dòng)相(包括甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1磷酸、乙腈-1 mL·L-1冰醋酸等),其中甲醇-1 mL·L-1磷酸基線比較平穩(wěn),黃芩苷在酸性條件下較純水的峰形更尖銳,靈敏度更高。另外,考慮到色譜柱對(duì)酸的耐受性,最終選擇甲醇-1 mL·L-1磷酸作為流動(dòng)相。在200～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)6種成分進(jìn)行掃描,黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的最大吸收波長(zhǎng)分別為278、274、276、276、254、252 nm。在252、254、276、276 nm處對(duì)大柴胡顆粒供試品溶液的紫外吸收情況進(jìn)行分析,最終選擇各化合物響應(yīng)最好的254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。