豆科3種植物的抗氧化活性比較

劉滿軍,魏 陽,王曉萍,石會麗,陳 昊,高 蓉,來元如,杜 君

陜西省中醫(yī)醫(yī)院,西安 710018

課題組在既往的研究中比較了苦刺花、山豆根、苦參中總黃酮成分的含量,建立了3味藥材總黃酮高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)特征指紋圖譜[1]。三者為同科屬藥用植物,均具有清熱燥濕、解毒涼血、利濕消腫等功效,均含有苦參堿、槐果堿、槐定堿等化合物,屬于雙稠哌啶類,具有喹喏里西啶的基本結(jié)構(gòu),有較強的生物活性[2-5]。此外,3味藥材中還含有黃酮類化合物。有報道苦參、山豆根提取的黃酮類化合物具有抗氧化活性及抑菌活性[6-7],關(guān)于二者所含生物堿及苦刺花抗氧化活性的研究目前鮮見報道。目前,普遍認(rèn)為,自由基及由其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)是衰老與各種疾病發(fā)生的主要原因之一[8-10]。所以天然抗氧化劑的開發(fā)和利用是研究的熱點。本文根據(jù)3種植物中所含化學(xué)成分的性質(zhì),用系統(tǒng)溶劑提取法提取主要化學(xué)成分,用現(xiàn)行的3種體外抗氧化實驗方法即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABST)法、3-氧代-2苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1氧(PTIO)法分別對三者不同提取部位進(jìn)行了抗氧化活性研究,為其開發(fā)應(yīng)用及其相互替代提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-250 DE型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);QUINTIX65-1 CN電子分析天平(d=0.01 mg;BSA224 S,d=0.1 mg,北京賽多利斯天平有限公司);移液槍(型號為2～20、10～100、20～200、100～1 000 μL,北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司);UV-1700PC型紫外可見分光光度計(上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司);LRH-70/MJ-80-1培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);RE-2000 B型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(批號A800764)、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(批號C129138)、3-氧代-2苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1氧(批號p838429),質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%,均購自上海麥克林生化科技有限公司;水為新鮮蒸餾水(自制);其余試劑均為分析純。

苦刺花(批號20210410)為豆科植物白刺花SophoraviciifoliaHance的根,自采于宜君縣;山豆根(批號20211001)為豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根和根莖,苦參(批號20210901)為豆科植物苦參SophoraflavescensAit.的干燥根,均購自陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司。由石會麗研究員鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

分別取苦刺花、苦參和山豆根粉末(過40目篩)約50 g,精密稱定,分別置于3個圓底燒瓶中,加入5 mL氨水、500 mL二氯甲烷回流1.5 h,同法處理2次,濾過,減壓濃縮、干燥,得二氯甲烷提取物,備用;藥渣揮干溶劑,加甲醇500 mL,同法回流處理2次,得甲醇提取物;提取物揮去溶劑,分別用無水乙醇溶解,超聲(功率為250 W,頻率為40 kHz)處理20 min,放冷,定容至所需質(zhì)量濃度。將各部位的提取物名稱簡稱為苦刺花(METH)、苦刺花(CH2Cl2)、苦參(METH)、苦參(CH2Cl2)、山豆根(METH)、山豆根(CH2Cl2)。

2.2 DPPH 法的建立

2.2.1制備DPPH乙醇溶液 精密稱取DPPH 4.46 mg,置于100 mL棕色量瓶中,加無水乙醇溶解并稀釋至刻度,超聲5 min,充分混勻,避光放置,即得0.113 mmoL·L-1的DPPH乙醇溶液。取上述溶液,加適量無水乙醇稀釋后,使其吸光度在0.6～1.0,即得DPPH工作液。

2.2.2預(yù)實驗確定供試品溶液最適質(zhì)量濃度 精密移取DPPH工作液2 mL,置于具塞試管中,加入少量的樣品液。加樣時,由少到多漸加,且邊加邊混勻,觀察溶液顏色的變化,當(dāng)溶液顏色基本褪去時,記錄樣品加樣量。如果反應(yīng)緩慢,可在37 ℃培養(yǎng)箱中放置0.5 h,等待完全反應(yīng)。此加樣量為樣品的最大用量,在此最大用量的基礎(chǔ)上,往前設(shè)置至少5個質(zhì)量濃度,使之盡可能呈等差數(shù)列。如預(yù)實驗中苦參(METH)的質(zhì)量濃度為25 mg·mL-1、用量為1 mL時,DPPH溶液的顏色基本褪去,則1 mL為該供試品溶液的最大用量。對該樣品而言,其質(zhì)量濃度梯度宜設(shè)為5、10、15、20、25 mg·mL-1。分別通過預(yù)實驗得出最大用量為1 mL時該供試品溶液的最大質(zhì)量濃度,結(jié)果顯示,苦參(CH2Cl2)為20 mg·mL-1,苦刺花(METH)為25 mg·mL-1,苦刺花(CH2Cl2)為80 mg·mL-1,山豆根(METH)為20 mg·mL-1,山豆根(CH2Cl2)為20 mg·mL-1。

2.2.3測定DPPH自由基清除率 按照2.1項下方法分別制備苦刺花、苦參和山豆根的供試品儲備液,稀釋成預(yù)實驗所需最大質(zhì)量濃度的供試品溶液,按照2.2.2項下梯度法,此法參考文獻(xiàn)[11-13]稍作修改。分別取此溶液不同體積置于試管中,用無水乙醇補充每管供試品溶液至1 mL,混合均勻,制得系列質(zhì)量濃度的溶液,再分別加入同一DPPH工作液2 mL,在適宜反應(yīng)時間內(nèi)使反應(yīng)達(dá)到動態(tài)平衡后,在517 nm處測定吸光度值,記為Ai,同時,以1 mL無水乙醇與2 mL DPPH工作液的混合溶液作為對照組,其吸光度值記為A0;以相對應(yīng)的供試品梯度溶液加2 mL無水乙醇作為空白組,其吸光度值記為Aj,按 DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj) /A0]×100%,計算清除率。以質(zhì)量濃度(mg·mL-1) 為橫坐標(biāo)、清除率(%)為縱坐標(biāo),繪制清除率曲線,計算半數(shù)清除率(IC50)。最終每測1個用量需要測定3個平行數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果見表1、圖1。

注:A.苦刺花(METH);B.苦刺花(CH2Cl2);C.苦參(METH);D.苦參(CH2CL2);E.山豆根(METH);F.山豆根(CH2Cl2)。

表1 3種不同植物不同提取部位對3種不同自由基清除率IC50值

2.2.4確定反應(yīng)完成時間 分別移取低、中、高3種質(zhì)量濃度的供試品溶液,按照2.2.3 項下方法,在反應(yīng)時間分別為8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 min時測定吸光度值(Ai),觀察各質(zhì)量濃度下Ai的變化情況。結(jié)果顯示,當(dāng)反應(yīng)時間為32 min時,其Ai與相鄰時間點(28、36 min)Ai的相對偏差(RSD)均小于5%,表明30 min能使反應(yīng)達(dá)到動態(tài)平衡,故確定反應(yīng)時間為30 min。

2.3 ABTS法的建立

2.3.1ABTS自由基工作溶液的配制 ABST二銨鹽7.4 mmoL·L-1儲備液:取ABST二銨鹽6 mg,加蒸餾水1.47 mL,即得。

過二硫酸鉀(K2S2O8)2.6 mmoL·L-1儲備液:取K2S2O81 mg,加蒸餾水1.43 mL,即得。

ABTS自由基儲備液:分別移取7.4 mmoL·L-1的ABTS溶液1 mL和2.6 mmoL·L-1的過二硫酸鉀溶液1 mL,混合均勻,于黑暗環(huán)境下放置12～16 h,即得。

ABTS自由基工作液:實驗前,移取ABTS自由基儲備液2.0 mL,用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液將混合液稀釋10～20倍至吸光度值為0.70～0.90左右,即得。

2.3.2預(yù)實驗確定供試品溶液最適質(zhì)量濃度 精密移取ABST溶液2 mL,置于具塞試管中,加入供試品溶液。加樣時,由少到多漸加,且邊加邊搖,混合均勻,并觀察溶液顏色的變化,當(dāng)溶液顏色基本褪去時,記錄樣品質(zhì)量濃度及加樣量。如果反應(yīng)緩慢,可在37 ℃培養(yǎng)箱中放置0.5 h,等待完全反應(yīng)。此加樣量即為樣品的的最大用量,在此最大用量的基礎(chǔ)上,往前設(shè)置至少5個質(zhì)量濃度,使之呈等差數(shù)列。如預(yù)測苦刺花(CH2Cl2)質(zhì)量濃度最大為1.0 mg·mL-1,則將其質(zhì)量濃度設(shè)置為0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0 mg·mL-1;苦刺花(METH)最大質(zhì)量濃度為0.20 mg·mL-1、苦參(METH)最大質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1、苦參(CH2Cl2)最大質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1、山豆根(METH)最大質(zhì)量濃度為0.60 mg·mL-1、山豆根(CH2Cl2)最大質(zhì)量濃度為0.20 mg·mL-1。

2.3.3ABTS自由基清除率測定 按照2.1項下方法分別制備苦刺花、苦參和山豆根的供試品儲備液,依據(jù)2.3.2項下預(yù)實驗結(jié)果,配制成最大質(zhì)量濃度供試品溶液,將設(shè)置的等差系列質(zhì)量濃度稀釋成預(yù)實驗所需質(zhì)量濃度的供試品溶液。此法依據(jù)文獻(xiàn)[14-16]稍作修改。分別取此溶液不同體積置于試管中,用無水乙醇補充每管供試品溶液體積至1 mL,混合均勻,再分別加入同一ABTS工作溶液,在適宜反應(yīng)時間內(nèi)使反應(yīng)達(dá)到動態(tài)平衡后,在734 nm處測定吸光度值(Ai)。同時,以1 mL的無水乙醇與2 mL ABTS自由基工作液作為對照組,測定吸光度值(A0);將相應(yīng)質(zhì)量濃度的供試品溶液用無水乙醇稀釋至1 mL,與2 mL pH7.4的磷酸鹽緩沖液混合,作為空白組,吸光度值記為Aj,按 ABTS自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%計算清除率,以質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、清除率(%) 為縱坐標(biāo),繪制清除率曲線,進(jìn)而獲得半數(shù)清除率(IC50)。按照2.2.3項下方法測量。實驗結(jié)果分別見圖2、表1。

注:A.苦刺花(METH);B.苦刺花(CH2Cl2);C.苦參(METH);D.苦參(CH2Cl2);E.山豆根(METH);F.山豆根(CH2Cl2)。

2.3.4反應(yīng)時間的確定 分別移取低、中、高3種質(zhì)量濃度的供試品溶液,按照2.3.2項下方法,在反應(yīng)時間分別為 5、10、15、20、25、30、35、40 min 時測定吸光度值(Ai),觀察各質(zhì)量濃度溶液Ai的變化情況。結(jié)果顯示,當(dāng)反應(yīng)時間為25 min 時,其Ai與相鄰時間點(20、30 min)Ai的RSD值均小于5%,表明25 min能使反應(yīng)達(dá)到動態(tài)平衡,故確定反應(yīng)時間為25 min。

2.4 PTIO法的建立

2.4.1PTIO工作液的制備 取15 mg PTIO,精密稱定,置于100 mL棕色量瓶中,用乙醇溶解并稀釋至刻度,超聲5 min,充分混勻,避光放置,即得0.64 mmol·L-1的PTIO乙醇溶液。取上述溶液,加適量乙醇稀釋后,在587 nm處測定,使其吸光度值為0.6左右。即得PTIO工作液,臨用前現(xiàn)配。

2.4.2預(yù)實驗確定供試品溶液最適質(zhì)量濃度 精密移取PTIO工作液2 mL,置于具塞試管中,向其中加入少量的樣品液。加樣時,由少到多漸加,且邊加邊混勻,并觀察溶液顏色的變化,當(dāng)溶液顏色基本褪去時,記錄樣品質(zhì)量濃度及加樣量。如果反應(yīng)緩慢,可在37 ℃培養(yǎng)箱中放置0.5～2 h,等待完全反應(yīng)。此加樣量即為樣品的的最大用量,在此最大用量的基礎(chǔ)上,往前設(shè)置至少5個質(zhì)量濃度,使之呈等差數(shù)列。如預(yù)測苦參(METH)質(zhì)量濃度為200 mg·mL-1時,用量為1 mL,PTIO溶液的顏色基本褪去,則1 mL為該樣品液的最大用量。對該樣品而言,其梯度質(zhì)量濃度宜設(shè)為40、80、120、160、200 mg·mL-1?？鄥?CH2Cl2)質(zhì)量濃度為200 mg·mL-1、苦刺花(METH)質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1、苦刺花(CH2Cl2)質(zhì)量濃度為360 mg·mL-1,山豆根(METH)質(zhì)量濃度為200 mg·mL-1、山豆根(CH2Cl2)質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1。

2.4.3測定PTIO自由基清除率 按照2.1項下方法分別制備苦刺花、苦參和山豆根的供試品儲備液,稀釋成預(yù)實驗所需質(zhì)量濃度的供試品溶液。此法依據(jù)文獻(xiàn)[17-18]稍作修改。分別取此溶液不同體積置于試管中,用無水乙醇補充至每管供試品溶液至1 mL,混合均勻,再分別加入同一 PTIO工作液,此反應(yīng)較為緩慢,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置1 h,等待完全反應(yīng)。在適宜反應(yīng)時間內(nèi)使反應(yīng)達(dá)到動態(tài)平衡后,在587 nm處測定吸光度值,記為Ai。同時,以1 mL無水乙醇與2 mL PTIO工作液的混合溶液作為對照組,其吸光度值記為A0;以相應(yīng)的供試品溶液加無水乙醇至1 mL與2 mL無水乙醇作為空白組,其吸光度值記為Aj,按DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%計算清除率,以質(zhì)量濃度(mg·mL-1) 為橫坐標(biāo)、清除率(%)為縱坐標(biāo),繪制清除率曲線,計算IC50。最終測定同2.2.3項下方法。實驗結(jié)果分別見表1、圖3。

注:A.苦刺花(METH);B.苦刺花(CH2Cl2);C.苦參(METH ;D.苦參(CH2Cl2);E.山豆根(METH);F.山豆根(CH2Cl2)。

2.4.4確定最佳反應(yīng)時間 分別移取低、中、高3種質(zhì)量濃度的供試品溶液,按照2.4.2項下方法,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,于反應(yīng)時間分別為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 min時測定吸光度值(Ai),觀察各質(zhì)量濃度溶液Ai的變化情況。結(jié)果顯示,當(dāng)反應(yīng)時間為60 min時,其Ai與相鄰時間點(65、55 min )Ai的RSD值均小于5.0%,表明60 min能使反應(yīng)達(dá)到動態(tài)平衡,故確定反應(yīng)時間為60 min。

2.5 抗氧化活性比較

本研究用3種不同的體外抗氧化活性評價方法考察3種同科屬植物的不同溶劑提取部位的抗氧化活性變化情況。由圖1至圖3知,樣品的抗氧化活性呈不同程度的量效相關(guān)性,三者具有相似的特點,對DPPH、ABTS、PTIO自由基的清除率隨樣品溶液質(zhì)量濃度的增大而增大,計算三者對DPPH、ABTS、PTIO自由基的清除率IC50值,見表1。

由表1可知,自由基清除率IC50值由小到大排列順序依次為:DPPH法為山豆根(CH2Cl2)<山豆根(METH)<苦刺花(METH)<苦參(CH2Cl2)<苦參(METH)<苦刺花(CH2Cl2);ABST法為苦刺花(METH)<山豆根(CH2Cl2)<山豆根(METH)<苦參(METH)<苦參(CH2Cl2)<苦刺花(CH2Cl2);PTIO法為苦刺花(METH)<山豆根(CH2Cl2)<山豆根(METH)<苦參(CH2Cl2)<苦參(METH)<苦刺花(CH2Cl2);其抗氧化活性由大到小排列順序同上。自由基清除率IC50值越小,其抗氧化性越強。3種方法的測定結(jié)果基本相似,表明測定結(jié)果具有較高的可信度。

3 討論

3.1 量效、構(gòu)效關(guān)系

本研究分別以DPPH、ABST、PTIO自由基清除率為指標(biāo),測定了山豆根、苦刺花、苦參不同提取物的抗氧化活性,結(jié)果顯示,3種植物藥材均具有抗氧化性,且具有量效正相關(guān)性。苦刺花3法皆是甲醇部位大于二氯甲烷部位,表明其中的黃酮類成分抗氧化作用大于生物堿部位;或者是黃酮類成分的含量較高,酚羥基數(shù)量多,產(chǎn)生的抗氧化效果較強?？鄥⑴c山豆根則相反,二氯甲烷部位的抗氧化性強于甲醇部位,二者生物堿的含量相對較高,其抗氧化性較強。

3.2 實驗特色及注意事項

PTIO作為一種常用的一氧化氮清除劑,區(qū)別于其他自由基,其帶電基團(tuán)為氧原子,DPPH為氮原子。PTIO易被還原,溶液由紫色褪為無色,反應(yīng)程度與所接受的電子數(shù)為定量關(guān)系,因此可通過測量吸光度值進(jìn)行定量分析。因3種植物藥材均為提取部位,成分復(fù)雜,為使抗氧化實驗結(jié)果精確,應(yīng)選擇在最為合適的條件下進(jìn)行實驗。故依據(jù)參考文獻(xiàn)[19]選取芥子堿、原花青素、鄰苯二酚3類不同結(jié)構(gòu)類型的中藥小分子,用PTIO消除自由基檢測方法分別探討依據(jù)中藥小分子清除PTIO自由基的方法,得出結(jié)論為其清除PTIO自由基的能力以pH=7.0時為最強。由此可知,當(dāng)反應(yīng)液呈中性時,對PTIO的清除效果均較佳。借此條件,用 PTIO消除自由基的方法分析、比較3種同科植物的抗氧化活性及其構(gòu)效關(guān)系,同時對抗氧化劑的研究也具有一定的指導(dǎo)意義,使其抗氧化性實驗的結(jié)果更加準(zhǔn)確。

3.3 共性結(jié)果及建議

本次實驗所用的供試品為3種植物的不同溶劑提取部位,只能說明其含有總生物堿、總黃酮類成分,且皆具有抗氧化活性,其具體化學(xué)成分有待進(jìn)一步深入研究,以進(jìn)一步說明其作用機制。

4 結(jié)論

在最佳反應(yīng)條件下,用DPPH法、ABTS法和PTIO法比較了山豆根、苦刺花、苦參不同提取物抗氧化能力的差異,結(jié)果表明,三者皆具有較強的體外清除自由基的能力,且具有量效正相關(guān)性。抗氧化作用與黃酮類、生物堿類成分的含量呈正相關(guān)性,奠定了三者相互替代的開發(fā)潛能;可為苦刺花資源的科學(xué)開發(fā)和綜合利用提供參考;為擴(kuò)展3種藥材的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。