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    一種可以應(yīng)用于脂滴成像的希夫堿類衍生物

    2023-07-27 23:51:10程文靜
    關(guān)鍵詞:希夫脂滴探針

    程文靜,張 瑜,王 林,甄 帥,呼 蕾

    脂滴是真菌、植物和動物體內(nèi)普遍存在的富含脂質(zhì)的細(xì)胞器, 在多種生物過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)小滴(lipid droplets,LD)是富含脂質(zhì)的球形細(xì)胞器, 它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER) 衍生的細(xì)胞器, 主要由甘油三酯和膽固醇酯組成,并被磷脂單分子膜和相關(guān)蛋白包圍,使它們與所有其他細(xì)胞器區(qū)分開,被認(rèn)為是用于能量存儲的惰性儲存庫[2]。 LD 是具有生命力的動態(tài)物體,其具有必要的細(xì)胞分配功能,包括膜運(yùn)輸、融合和參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。最近的證據(jù)表明,LD 和許多生理過程都與脂質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。 近年來人們對LD產(chǎn)生了極大的興趣。 LD 的異常蓄積與肥胖、 高脂血癥、肝囊腫、動脈粥樣硬化和腎癌等癌癥有關(guān)[4]。此外,LD 還與炎癥和傳染病有關(guān)[5]。據(jù)報(bào)道,LD 參與了各類病原體的傳染病發(fā)病機(jī)制,如病毒[6]、細(xì)菌[7]、真菌[8]、原生生物[9],這表明LD 參與宿主對感染的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。 宿主LD 也可能被利用作為病原體逃避免疫系統(tǒng)適應(yīng)的一部分,并作為細(xì)胞內(nèi)病原體的能量來源[10,11]。 因此,準(zhǔn)確監(jiān)測LD 對分析其生物代謝至關(guān)重要,有助于診斷相關(guān)早期疾病。

    脂滴的固有環(huán)境是親脂性的。 據(jù)此判斷具有高疏水性的親脂性有機(jī)染料可能具有潛在的脂滴染色能力。 帶受體-供體的有機(jī)染料通過引入大雜環(huán)來增加受體的吸電子能力, 得到的有機(jī)染料通常表現(xiàn)出更紅的熒光、 更高的疏水性和更大的雙光子吸收截面,但細(xì)胞穿透性較低。 因此應(yīng)調(diào)整疏水性和細(xì)胞滲透性之間的平衡。然而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的空間非常有限。另一方面,基于二萘酰亞胺的供體-受體分子已被證明是活體細(xì)胞熒光檢測和生物成像的優(yōu)異探針[12]。通過引入二萘酰亞胺的受體單元, 筆者合成了一個(gè)新的基于芘的希夫堿類脂滴熒光探針——1 氫-苯并異喹啉衍生物[1-pyrenecarboxaldehyde,2-(2,3-dihydro-1,3-dioxo-2-propyl-6-yl)hydrazone,BPD],用于活細(xì)胞中的脂滴可視化并實(shí)現(xiàn)了對脂滴的可視化成像, 為實(shí)時(shí)檢測脂滴動態(tài)水平提供了一種可行的方案。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    4-溴-1,8-萘二甲酸酐、正丙胺、80%水合肼、1-芘甲醛、冰醋酸、無水乙醇、甲醇、二氯甲烷(分析純。富宇化工,中國)、普朗克127(中國阿拉丁試劑公司)。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

    V-550 紫外可見分光光度計(jì) (SHIMADZU 島津公司,日本);F-4700 熒光光譜儀(日立公司,中國);FM4 積分球;MercuryPlus-400 核磁共振光譜儀(Bruker 布魯克公司, 瑞士);WATERS I-Class VION IMS QTof 質(zhì)譜儀 (沃特世科技公司, 美國);Nikon A1MP(尼康公司,日本);120 kV 投射電子顯微鏡(賽默飛科技公司,美國)。

    1.2 方法

    1.2.1 探針分子的合成方法

    探針分子的合成分為三步。首先以4-溴-1,8-二萘酸酐和丙胺為原料在無水乙醇溶劑中合成S1,然后將S1 與過量的80%水合肼反應(yīng)得S2, 之后進(jìn)一步與1-比甲醛反應(yīng)得到脂滴探針分子芘希夫堿類的衍生物BPD。 合成路線如圖1。

    圖1 探針BPD 的合成路線Fig.1 Diagram of synthetic route of probe BPD

    1.2.1.1 4-溴-N-丙基-1,8-萘二甲酰亞胺(S1)的合成 分別稱取1 108 mg 的4-溴-1,8-萘二甲酸酐(4 mmol)和236 mg 正丙胺(4 mmol),置于20 mL 甲醇溶液中,于氮?dú)夥諊聞×覕嚢枭郎赜?5 ℃,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,體系顏色由淺黃色變?yōu)闇\棕色。 持續(xù)反應(yīng)8 h 后,將整個(gè)體系冷卻至室溫,有淺棕色固體析出、過濾,用冰甲醇溶液反復(fù)洗滌3 次,然后放入溫度設(shè)置為40 ℃的真空干燥箱中干燥, 得到粗產(chǎn)物4-溴-N-丙基-1,8-萘二甲酰亞胺,即S1。

    1.2.1.2 6-肼基-2-丙基-1H-苯并異喹啉-1,3-(2H)-二酮(S2)的合成 將312 mg 4-溴-N-丙基-1,8-萘二甲酰亞胺溶液(0.8 mmol)置于圓底燒瓶中,加入15 mL 甲醇溶液,之后滴加1.5 ~2.0 mL 80%水合肼溶液(大大過量)于圓底燒瓶中,于下劇烈攪拌下回流過夜;隨著反應(yīng)的進(jìn)行,體系顏色由淺棕色逐漸變?yōu)槌壬?,反?yīng)完成后,倒入100 mL 冰水中,有大量沉淀析出,過濾,用冰水反復(fù)洗滌3 ~5 次,于真空干燥箱干燥后得粗產(chǎn)物, 經(jīng)真空干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物6-肼基-2-丙基-1H-苯并異喹啉-1,3-(2H)-二酮,即S2。

    1.2.1.3 芘希夫堿類的衍生物BPD 的合成 將240 mg 6-肼基-2-丙基-1H-苯并異喹啉-1,3-(2H)-二酮(0.5 mmol)和115 mg 1-芘甲醛(0.5 mmol)置于盛有10 mL 的圓底燒瓶中,加入1 滴冰醋酸溶液,回流反應(yīng)5 h;冷卻至室溫后析出大量紅橙色沉淀,過濾,于真空干燥箱中干燥后得到紅橙色固體,用甲醇溶液進(jìn)行重結(jié)晶最終得到目標(biāo)產(chǎn)物,即芘希夫堿類的衍生物BPD。

    1.2.2 結(jié)構(gòu)表征方法

    用MercuryPlus-400 核磁共振光譜儀測量化合物的核磁共振氫譜(nuclear magnetic resonance1H spectrum,1H-NMR);F-4700 熒光光譜儀用于測試熒光光譜;FM4 積分球用于測試熒光量子產(chǎn)率;WATERS IClass VION IMS QTof 質(zhì)譜儀用于測試高分辨質(zhì)譜。

    1.2.2.1 熒光光譜測試 稱取目標(biāo)分子2.4 mg,轉(zhuǎn)移至干燥的容量瓶中。 用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)定容至5 mL,得到濃度為10–3mol/L 的探針分子母液。 熒光光譜測量時(shí)激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2.5 nm,激發(fā)波長380 nm,在不同溶劑的發(fā)射波長為510 ~600 nm。

    1.2.2.2 光物理特性和pH 依賴性測試 研究BPD在DMSO、乙腈、丙酮四氫呋喃甲苯正己烷常用溶劑中的光物理特征(V-550 紫外可見分光光度計(jì))。為了在生理環(huán)境中監(jiān)視細(xì)胞中的脂滴, 探針應(yīng)在較寬的pH 范圍內(nèi)保持穩(wěn)定性。 因此,分別測量了在各種pH環(huán)境下的BPD 的熒光光譜。 通過熒光強(qiáng)度變化來表征探針的穩(wěn)定性。

    1.2.3 探針BPD-納米顆粒的制備和測量

    為了使其具有水溶性, 將10 mg 探針BPD 溶于10 mL 四氫呋喃中,加入80 mg 普朗克F127(一種兩親性聚合物),超聲溶解后,迅速倒入100 mL 去離子水中,攪拌12 h,待有機(jī)溶劑揮發(fā)后,得到水溶性的BPD 納米顆粒(nano-particles,NP),使用超濾離心管濃縮至10 μmol/L。 對其進(jìn)行動態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS) 測試, 使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)進(jìn)行測試。

    1.2.4 選擇性測試和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

    V-550 紫外可見分光光度計(jì)用于測試吸收光譜;徠卡共聚焦顯微鏡(德國,SP8 DIVE)用來進(jìn)行共聚焦成像實(shí)驗(yàn)。

    通過測試光密度, 研究底物F-、Cl-、Br-、I-、CN-、CO32-、NO2-、PO32-、SCN-、SO32-、ClO-、H2O2、SO42-、Al3+、Ca2+、Co2+、Cr2+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Ni+、Zn2+、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、半胱氨酸(Cysteine,Cys)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、同型半胱氨酸(hyperhomocysteinemia,Hcy)、牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、葡萄糖(glucose)對BPD 熒光特性的研究。 熒光強(qiáng)度與對照組無太大變化,則說明研究底物對探針無識別干擾。 使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行了生物成像,BPD 探針孵育Hela 細(xì)胞30 min,反復(fù)洗滌3 次后,放置于共聚焦顯微鏡下成像,采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT) 進(jìn)行探針BPD 的細(xì)胞毒性測試。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組比較行t 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)表征

    BPD 分子的核磁共振峰提示結(jié)構(gòu)為1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:0.90 (t,J = 8.2,3H),1.95(m,2H),3.89(t,J=8.4,2H),7.88(m,2H),8.22(t,J =8.2,1H),8.33(t,J = 12.0,2H),8.39(m,5H),8.42(d,J=12.0,1H),8.49(d,J=8.0,1H),8.73(t,J=8.4,2H),8.85(d,J = 8.4,1H),11.69(s,1H)。 MS(mass m/z):482.1794[M+H]+。 見圖2。

    圖2 BPD 探針的氫譜Fig.2 Diagram of hydrogen spectrum of probe

    2.2 探針BPD 的理論計(jì)算

    通過Gaussian 09 研究了BPD 在水中的理論計(jì)算[基組為B3LYP/6-31G(d,p)]。 如圖3 所示,最高占據(jù)分子軌道 (highest occupied molecular orbital,HOMO)和最低占據(jù)分子軌道(lowest unoccupied molecular orbital,LOMO)狀態(tài)下的能量為負(fù)值(分別為- 2.34 eV、-5.46 eV),表明探針是穩(wěn)定的。 計(jì)算得到的理論偶極矩為10.49 D。 此外,能隙為3.12 eV,這意味著探針具有高的穩(wěn)定性和高的化學(xué)硬度。探針在水中的熒光很弱,可能歸因于水分子進(jìn)攻分子的受體部分;此外,芘基團(tuán)與1,8-二萘酸酐基團(tuán)之間存在較大的二面角,這二者導(dǎo)致了分子在水中的熒光很弱。

    圖3 BPD 的理論計(jì)算Fig.3 Diagrams of theoretical calculation of BPD

    2.3 探針BPD 的光物理性質(zhì)

    探針在不同有機(jī)溶劑中的紫外吸收光譜和熒光光譜表明,隨著溶劑極性的增加,探針BPD 顯示出明顯的熒光峰紅移(表1)。探針BPD 在從520 nm(非極性溶劑正己烷)到590 nm(極性溶劑水)上表現(xiàn)出較大的熒光發(fā)射紅移(約70 nm)(圖4a)并且伴隨著明顯的顏色變化(綠色到橙色)。此外,探針BPD 在純水中熒光發(fā)射微弱, 而熒光強(qiáng)度隨著1,4-二氧六環(huán)比例的增加而逐漸增高,并伴隨著明顯的藍(lán)移最大發(fā)射從590 nm(水)到530 nm(1,4-二氧六環(huán)),這是由于分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移作用(圖4b)。 探針在1,4-二氧六環(huán)中表現(xiàn)出強(qiáng)熒光,并且熒光強(qiáng)度與在水中相比提高了約418 倍,測試得到的熒光量子產(chǎn)率為0.34。 探針的這種在低極性溶劑中的高親脂性性質(zhì)和高熒光發(fā)射性質(zhì)為其在LD 成像中的應(yīng)用提供了可能性。

    表1 探針在不同溶劑中的光物理性質(zhì)Tab.1 Photophysical properties of probes in different solvents

    圖4 在不同極性的有機(jī)溶劑中探針(10 μmol/L)的歸一化后的熒光光譜(a)和不同比例的1,4-二氧六環(huán)(λex=380 nm)與水的混合物中探針的熒光光譜(b)Fig.4 Normalized fluorescence spectra of probes(10 μmol/L) in organic solvents with different polarity(a) and 1, 4-dioxane in different proportions(λex=380 nm)and fluorescence spectrum of probe in mixture with water(b)

    2.4 探針BPD-納米顆粒大小

    水溶性的BPD-NP DLS 測試, 其粒徑大致為80.28 nm。 TEM 觀察,其形貌為圓型顆粒。 見圖5。

    圖5 探針BPD-NP 的DLS 測試圖(A)和TEM 觀察結(jié)果(B)Fig.5 Images of DLS test of probe BPD-NP(A)and TEM observation result(B)

    2.5 探針BPD 的pH 依賴性測試

    探針于1,4-二氧六環(huán)中在寬的pH 5.0 ~9.0 內(nèi)都是穩(wěn)定的。這表明BPD 在檢測LD 于細(xì)胞中的生物學(xué)應(yīng)用方面具有很大的潛力。 見圖6。

    圖6 探針的酸堿度(pH)穩(wěn)定性Fig.6 Diagram of pH stability of probe

    2.6 探針BPD 的選擇性測試

    熒光探針在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中應(yīng)具有良好的選擇性,因此檢測了各種分析物對BPD 熒光特性的影響。 在380 nm 激發(fā)后,其他物質(zhì)對BPD 在530 nm處的熒光幾乎沒有干擾(圖7)。 表明該探針對這些分析物呈惰性 (分析底物分別為F-、Cl-、Br-、I-、CN-、CO32-、NO2-、PO32-、SCN-、SO32-、ClO-、H2O2、SO42-、Al3+、Ca2+、Co2+、Cr2+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Ni+、Zn2+、ctDNA、Cys、GSH、Hcy、BSA、TC、glucose)。這種結(jié)構(gòu)的探針通常會對F-有特異性的識別,即使在熒光下,BPD 對F-也有任何熒光信號的變化,表現(xiàn)為惰性。

    圖7 探針分子對底物的選擇性柱狀圖Fig.7 Histogram of substrate selectivity of probe molecules

    2.7 探針BPD 的細(xì)胞毒性結(jié)果及在Hela 細(xì)胞中的成像

    探針BPD 對細(xì)胞的毒性測試十分重要, 是判斷探針能否正常發(fā)揮功能的標(biāo)準(zhǔn)之一, 通過MTT 分析探針BPD 在HeLa 細(xì)胞中對細(xì)胞的毒性。與探針(0~30 μmol/L)孵育24 h 后,細(xì)胞的存活率高于90%。 證明探針具有良好的膜滲透性及良好的生物相容性。見圖8。

    圖8 用不同濃度的探針處理Hela 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞的存活率柱狀圖Fig. 8 Survival rate histogram of Hela cells treated with different concentrations of probes for 24-hour

    由圖9 可以看出, 探針對細(xì)胞進(jìn)行了良好的染色。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,脂滴是于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生的,之后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行生理活動。由圖可知,部分細(xì)胞中LD聚集在了一起上并成功可視化(放大圖),推斷LD 可能正處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。此外,值得注意的是,探針分子在細(xì)胞中呈點(diǎn)狀分布, 并且主要積累在LD 上 (放大圖)。 這表明BPD 有能力追蹤LD 的細(xì)胞內(nèi)積累及可視化活細(xì)胞中的LD 的動態(tài)運(yùn)動。

    圖9 在Hela 細(xì)胞中孵育30 min 探針(10 μmol/L)后的圖像(λex =488 nm)Fig.9 Images(λex=488 nm)of probe(10 μmol/L)after incubation in Hela cells for 30-minute

    3 討論

    熒光探針由于易于制備,高選擇性和靈敏度及實(shí)時(shí)成像的潛力而被認(rèn)為是一種出色的檢測技術(shù)[13~15]。因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)通常會存在較大的二面角,使其不利于電荷轉(zhuǎn)移,因此大多數(shù)的希夫堿類熒光探針發(fā)光很差甚至沒有熒光發(fā)射,因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)通常會存在較大的二面角,使其不利于電荷轉(zhuǎn)移[16]。由于這個(gè)特點(diǎn),目前存在的大多數(shù)希夫堿類熒光探針的識別機(jī)制是基于與分析物反應(yīng)后發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變,導(dǎo)致整體結(jié)構(gòu)更加剛性從而有利于電荷轉(zhuǎn)移,因而其熒光團(tuán)部分發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號,到目前為止,很少存在可視化脂滴的希夫堿類熒光探針。

    筆者合成的一種基于芘的希夫堿類熒光探針BPD, 該探針在1,4-二氧六環(huán)中存在強(qiáng)烈的熒光發(fā)射,而在水中熒光很弱,可能是歸因于水分子的進(jìn)攻而淬滅熒光, 這個(gè)特點(diǎn)使其更加適合用于脂滴成像,因?yàn)橹蔚慕Y(jié)構(gòu)導(dǎo)致其有十分疏水的特性。希夫堿類熒光探針通常是作為反應(yīng)型探針的,其本身發(fā)光性質(zhì)并不好,因此在希夫堿類熒光探針的設(shè)計(jì)中通常加入可以淬滅熒光的識別基團(tuán)或?qū)е缕渚哂写蠖娼堑拇罂臻g位阻基團(tuán)[17,18]。 而筆者合成的基于芘的希夫堿類熒光探針BPD 與大多數(shù)染料的熒光性質(zhì)恰恰相反,探針具有極強(qiáng)的親脂性,可以靶向到LD 中,且具有很高的熒光強(qiáng)度。 通過理論計(jì)算,發(fā)現(xiàn)與其他脂滴成像探針不同, 希夫堿類熒光探針BPD 在疏水的環(huán)境中,結(jié)構(gòu)并不會變得太扭曲,而是保持幾乎在一個(gè)平面上,這也說明了分子內(nèi)仍舊存在電荷轉(zhuǎn)移,且ΔE=3.12 eV。 此外,探針具有十分良好的選擇性、抗干擾能力、良好的膜滲透性及生物相容性,并在寬泛的pH值中依舊存在強(qiáng)熒光信號。此外,探針可以在Hela 細(xì)胞中形成可視化細(xì)胞內(nèi)脂滴。

    (利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突)

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