淺析檢定液相色譜儀應(yīng)注意的問題

韓學(xué)東 田忠旺

【摘要】液相色譜儀是一種廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析領(lǐng)域的計(jì)量?jī)x器。通過對(duì)液相色譜儀的檢定，可以確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。但是計(jì)量檢定人員在檢定液相色譜儀時(shí)，經(jīng)常會(huì)遇到與儀器計(jì)量性能相關(guān)的很多問題，這會(huì)導(dǎo)致無法滿足檢定規(guī)程的要求。筆者依據(jù)JJG 705—2014《液相色譜儀》檢定規(guī)程，結(jié)合實(shí)際檢定工作，總結(jié)出了檢定液相色譜儀時(shí)應(yīng)注意的問題，幫助相關(guān)人員更好地操作和檢定該儀器，為化學(xué)研究和應(yīng)用提供有力支持。

【關(guān)鍵詞】液相色譜儀；檢定；注意事項(xiàng)；故障

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.03.051

The Problems Should be Paid Attention to in the Verification of Liquid Chromatographs

HAN Xuedong，TIAN Zhongwang

（Heze Institute of Product Inspection and Testing，Heze 274000，China）

Abstract：The liquid chromatograph is a widely used measuring instrument in the field of chemical analysis. Calibration of the liquid chromatograph ensures the accuracy and reliability of the analytical results. However，metrology personnel often encounter many problems related to the metrological performance of the instrument when calibrating the liquid chromatograph，which can lead to the inability to meet the requirements of the calibration procedures. Based on the calibration regulations of JJG 705—2014 Liquid Chromatographs and combined with actual calibration work，the author summarizes the issues that should be paid attention to when calibrating the liquid chromatograph，to help relevant personnel operate and calibrate the instrument better，and provide strong support for chemical research and application.

Key words：liquid chromatographs；verification；matters needing attention；fault

液相色譜儀是化學(xué)分析中常用的儀器之一。液相色譜儀的應(yīng)用范圍非常廣泛，可以用于生物樣品、環(huán)境樣品、食品樣品等多種樣品的分析。檢定是確保液相色譜儀測(cè)量準(zhǔn)確性的重要保障。在對(duì)液相色譜儀檢定過程中應(yīng)注意儀器的類型、使用環(huán)境、試劑選擇、維護(hù)等問題，此外，還應(yīng)注意試劑的穩(wěn)定性、濃度，以及儀器的溫度和壓力等因素的影響。為了確保測(cè)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，建議遵循相關(guān)操作規(guī)程定期檢定儀器?？偟膩碚f，通過正確地檢定液相色譜儀，可以保證儀器的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，為化學(xué)分析提供可靠的數(shù)據(jù)。

1液相色譜儀的工作原理

液相色譜儀是由儲(chǔ)液器、高壓泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等部分構(gòu)成。其運(yùn)作原理為：儲(chǔ)液器中裝有的流動(dòng)相通過高壓泵壓進(jìn)系統(tǒng)，形成樣品溶液，而后這些溶液再借助進(jìn)樣器的運(yùn)輸進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相運(yùn)往下一個(gè)結(jié)構(gòu)——色譜柱。這個(gè)過程中存在樣品溶液的各組分在兩相中分配系數(shù)并不一樣，所以樣品溶液在兩相中做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，還需要經(jīng)過不停地重復(fù)吸附和解吸，進(jìn)而導(dǎo)致這些組分因?yàn)橐苿?dòng)速度的差異，而可能產(chǎn)生較大的差別，這樣就可以順利地使其分離成單個(gè)組分，然后再分別從柱內(nèi)流出。而檢測(cè)器的作用是將樣品濃度轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，然后快速傳送到記錄儀，將這些數(shù)據(jù)以圖解或者表格的形式打印出來，便于更加直觀地分析。

2液相色譜儀檢定中的注意事項(xiàng)

2.1泵流量檢定中的注意事項(xiàng)

在對(duì)泵耐壓、流量穩(wěn)定性、泵流量設(shè)定值誤差這幾個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢定時(shí)，一般采用100%的甲醇作為流動(dòng)相。由于100%甲醇有一定的揮發(fā)性，所以必須對(duì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間和速度進(jìn)行良好把控。與設(shè)定值相比，若實(shí)際流速較低，則需要對(duì)過濾頭、單向閥進(jìn)行清洗或更換；一旦流速偏高，就要對(duì)壓縮補(bǔ)償調(diào)節(jié)和流速補(bǔ)償進(jìn)行檢查，看其是否有效。

2.2柱溫箱檢定中的注意事項(xiàng)

根據(jù)JJG 705—2014《液相色譜儀》檢定規(guī)程，在柱溫箱內(nèi)放置數(shù)字溫度計(jì)的探頭，確保探頭和色譜柱的位置相同，并選擇35℃和45℃分別進(jìn)行檢定（也可按照用戶使用的溫度設(shè)置），每隔10分鐘測(cè)量一次，一共測(cè)量7次。7次的平均值與設(shè)定值的差值即為柱溫箱設(shè)定值誤差。7次的最大值與最小值之差為穩(wěn)定性。

一般情況下，檢定員為了檢定方便，不是每隔10分鐘測(cè)量一次，很多時(shí)候在1～2分鐘就開始進(jìn)行測(cè)量。此時(shí)色譜柱內(nèi)的溫度波動(dòng)性很大，很容易出現(xiàn)柱溫箱溫度設(shè)定值誤差和柱溫箱溫度穩(wěn)定性超差。同時(shí)要注意的是數(shù)字溫度計(jì)的探頭與色譜柱的位置應(yīng)相同，若不在相同的位置，也會(huì)導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。

2.3基線噪聲和基線漂移檢定中的注意事項(xiàng)

在對(duì)漂移和噪聲進(jìn)行檢定時(shí)，避免檢測(cè)器中有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過，并保證流動(dòng)相只有100%的甲醇，必須保證儀器中除了甲醇不能有其他物質(zhì)流動(dòng)相。再有就是一定選用C18的柱子，設(shè)定紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)為254 nm，同時(shí)檢定員一定要對(duì)單位換算嚴(yán)格考慮，不要出現(xiàn)單位上的差錯(cuò)而影響檢定結(jié)果。

2.4最小檢測(cè)濃度檢定中的注意事項(xiàng)

最小檢測(cè)濃度的檢定采用和基線噪聲檢定相同的條件，在對(duì)最小檢測(cè)濃度進(jìn)行檢定時(shí)，可將10～20μL的質(zhì)量濃度為1.00×10-7g/mL的萘-甲醇溶液注入進(jìn)樣系統(tǒng)中，并遵循一定的操作步驟對(duì)色譜圖進(jìn)行嚴(yán)格記錄，并按照公式CL=2NdcV/ 20H計(jì)算出最小檢測(cè)濃度。

最小檢測(cè)濃度檢定結(jié)果會(huì)受到很多因素影響，如進(jìn)樣量、檢定人員對(duì)規(guī)程的理解程度、操作人員的熟練程度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇、不確定度等因素，這樣會(huì)在一定程度上增加檢定難度。所以檢定人員在對(duì)液相色譜儀進(jìn)行檢定和操作時(shí)，需要選擇合適的檢定方法，在發(fā)現(xiàn)問題時(shí)要及時(shí)解決，降低在檢定液相色譜儀中出現(xiàn)的不確定因素，從而使檢定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

3系統(tǒng)故障的處理方法

3.1基線漂移的問題

在機(jī)器初始啟動(dòng)的時(shí)候，基線會(huì)存在漂移的問題，如果需要加快機(jī)器恢復(fù)的速度，可以加入一些緩沖溶液或者緩沖鹽，使機(jī)器恢復(fù)平穩(wěn)狀態(tài)的時(shí)間更快。一般我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中，如果發(fā)現(xiàn)基線漂移，不能滿足檢定規(guī)程的要求，會(huì)考慮以下幾類問題及處理方法：

首先，柱溫存在波動(dòng)的問題。解決柱溫波動(dòng)問題很簡(jiǎn)單，只要恰到好處地掌控柱子和流動(dòng)相的溫度即可，并且及時(shí)留意是否為外界溫度對(duì)其產(chǎn)生了不良影響。其次，如果流通池出現(xiàn)污染或者摻雜了氣體，就需要使用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑仔細(xì)沖洗流通池，甚至可以用0.1 mol/L的硝酸進(jìn)行處理。

比較常見的原因還有紫外燈的影響，或者流動(dòng)相的不良變化、變質(zhì)，也有可能存在一些質(zhì)量不好的溶液配制而導(dǎo)致問題。如果是這種情況，建議排查流動(dòng)相的結(jié)構(gòu)，或者使用一些質(zhì)量較高的溶液，進(jìn)而使樣品中殘留的頑固物質(zhì)溶解成饅頭峰樣，從而更容易被洗脫出來。必要的時(shí)候還可以引入保護(hù)柱，并且要注意在分析過程中，定期沖洗柱子。還有一種可能就是檢測(cè)器沒有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處。

3.2柱壓的問題

柱壓的問題涉及很多方面，它和色譜圖峰形的優(yōu)劣、分離效果的好壞，甚至是保留時(shí)間的長(zhǎng)短都有一定的聯(lián)系。很多人對(duì)柱壓穩(wěn)定的認(rèn)識(shí)存在一定偏差。其實(shí)柱壓穩(wěn)定并不代表壓力一直處于一個(gè)恒定值不變，而是指壓力可以存在一個(gè)波動(dòng)范圍，但是這個(gè)范圍是固定的。一般把壓力過高或者過低都?xì)w為柱壓?jiǎn)栴}，這是液相色譜儀最為常見的一種問題。

柱壓?jiǎn)栴}一般體現(xiàn)為壓力突然間升高。具體的產(chǎn)生原因是流路中出現(xiàn)了堵塞。此時(shí)，最普遍且有效的辦法應(yīng)該是進(jìn)行分段檢查。把真空泵的入口斷開，如果里面的液體不滴或者非常緩慢地滴下，那么基本就可以判斷是因?yàn)槿軇┻^濾頭堵塞造成的。還可以把濾頭放在硝酸里浸泡，隨后再反復(fù)沖洗。這時(shí)如果能看到有自由滴下的液滴，就可以證明溶劑過濾頭沒有問題。

3.3峰形異常的問題

峰型異常的問題是在液相學(xué)檢查中常常會(huì)出現(xiàn)的現(xiàn)象。在做液相的過程中，我們總是需要改變不同的因素，從而來改變不好的峰型。對(duì)于各種各樣的異常峰，檢定人員要區(qū)別對(duì)待，并從根本原因入手，一個(gè)一個(gè)分析處理。下面歸納出幾個(gè)峰形變化的成因。

1）色譜圖中未出峰的原因：裝置不進(jìn)樣或樣品未分析；泵不送液或流動(dòng)相的運(yùn)行方法出現(xiàn)一定問題；檢測(cè)器設(shè)置出現(xiàn)問題。檢定人員可根據(jù)上述原因，結(jié)合專業(yè)知識(shí)進(jìn)行改進(jìn)。

2）所有峰值都是負(fù)峰的原因：信號(hào)與電纜接頭弄反或檢測(cè)器電壓的極性設(shè)置被顛倒；光學(xué)系統(tǒng)沒有實(shí)現(xiàn)平衡。

3）所有峰值都是較寬峰的原因：系統(tǒng)中未能達(dá)到平衡；對(duì)色譜柱規(guī)格和型號(hào)的選取并不適當(dāng)；色譜柱、保護(hù)柱被污染或柱效較低；環(huán)境溫度變動(dòng)大。

4）所呈現(xiàn)的峰比預(yù)想中小的原因：樣品的黏度過大；進(jìn)樣品出現(xiàn)一些故障；進(jìn)樣體積計(jì)算錯(cuò)誤；檢測(cè)器設(shè)置有問題；定量環(huán)體積不準(zhǔn)確等。

5）出現(xiàn)雙峰或肩峰的原因：進(jìn)樣量太大；樣品濃度太高；保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞；保護(hù)拄和色譜柱被污染，甚至是失效。

6）拖尾峰的原因：柱嚴(yán)重超載，減少試劑原濃度，增大柱的體積或使用更大容量的固定相；峰干擾，對(duì)試樣進(jìn)行清潔過濾，并且改變流動(dòng)相；硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的含量，從而降低流動(dòng)相pH值；柱內(nèi)燒結(jié)不銹耐酸鋼后失效，替換外燒結(jié)不銹耐酸鋼；加在線過濾器，對(duì)樣品進(jìn)行有效過濾；使體積及柱外容積若過大，將聯(lián)系點(diǎn)減至最低，并且盡量采用內(nèi)徑較細(xì)的連接管；若柱效降低時(shí)，替換柱子；采用保護(hù)柱，對(duì)柱子進(jìn)行再生。

7）平頭峰的原因：檢測(cè)器位置不準(zhǔn)確、進(jìn)樣數(shù)量太大或者樣品含量過多。

4液相色譜儀的應(yīng)用與進(jìn)展分析

一般來說，液相色譜法可以選擇較為廣泛的流動(dòng)相，功能不同的各種流動(dòng)相可以分離不同范圍的物質(zhì)，也可以分離遇熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性、離解的和非離解的物質(zhì)。液相色譜法還可以實(shí)現(xiàn)試樣預(yù)處理技術(shù)的互相配合。最常見就是HPLC提供的高分辨率和高靈敏度，其可以分離和測(cè)定一些十分相近的物質(zhì)，也可以分離一些復(fù)雜相體中的少量成分。

而隨著固定相的發(fā)展，我們?cè)诮鉀Q生化分析難題上有了新的突破，主要是體現(xiàn)在分離HPLC技術(shù)上。HPLC技術(shù)有許多明顯的優(yōu)點(diǎn)，如較高的分辨率、敏捷的靈敏度、反應(yīng)迅速、可循環(huán)利用點(diǎn)色譜柱等。該技術(shù)可以較為廣泛地應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域，不論是生物化學(xué)還是食品分析，甚至是醫(yī)藥研究。另外，液相色譜儀和結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用也是目前科學(xué)研究的一個(gè)重要的發(fā)展方向。當(dāng)然，液相色譜法也可以結(jié)合到其他儀器，如在環(huán)境污染分析中使用的液相色譜-紅外光譜，可以起到巨大的作用，提高人們對(duì)環(huán)境污染的分析和即時(shí)制定解決措施的能力。

5結(jié)論

綜上所述，液相色譜儀是一種重要的化學(xué)分析儀器，在化學(xué)研究和應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用前景。將檢定液相色譜儀時(shí)應(yīng)注意的問題進(jìn)行分析總結(jié)，可以保證液相色譜儀的分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為液相色譜儀的技術(shù)進(jìn)步和應(yīng)用提供有力支持。

【參考文獻(xiàn)】

[1]羅雄峰.液相色譜儀紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)限的測(cè)量不確定度評(píng)定[J].中國(guó)計(jì)量，2014（1）：97-98.

[2]王靈燕，蔡玉劍.液相色譜儀紫外檢測(cè)器首次檢定的探討[J].中國(guó)計(jì)量，2017（8）：109-111.

[3]李宏偉.液相色譜儀檢定程序簡(jiǎn)要實(shí)例分析[J].廣東化工，2018，45（16）：176-177.

[4]陳芬，李敏，張淑麗.高效液相色譜儀故障處理分析[J].山東工業(yè)技術(shù)，2017（1）：212.

[5]王國(guó)娟，王珊珊，管寧.實(shí)驗(yàn)室高效液相色譜儀維護(hù)保養(yǎng)及故障原因解析[J].化纖與紡織技術(shù)，2022，51（2）：112-114.

【作者簡(jiǎn)介】

韓學(xué)東，男，1969年出生，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槔砘愑?jì)量器具的檢定、校準(zhǔn)與研究。

田忠旺，男，1983年出生，一級(jí)注冊(cè)計(jì)量師，研究方向?yàn)槔砘愑?jì)量器具的檢定、校準(zhǔn)與研究。

（編輯：謝飛燕）