PCR-RFLP檢測(cè)安慶六白豬BPI基因第10外顯子的多態(tài)性

陳博赫 郭江 朱杰 文利新 譚國(guó)華 劉楊 馬海明

摘 ?要：為探討安慶六白豬殺菌性/通透性增加蛋白（bactericidal/permeability increasing protein）即BPI基因的遺傳多態(tài)性，本研究通過(guò)PCR-RFLP方法，檢測(cè)了BPI基因第10外顯子在安慶六白豬上的多態(tài)性。結(jié)果表明，在安慶六白豬中，GT基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，T等位基因是優(yōu)勢(shì)等位基因；推測(cè)安慶六白豬BPI基因的GT基因型可能具有較高的免疫力，為安慶六白豬的保種和選育提供了有益的資料。

關(guān)鍵詞：豬；BPI基因；PCR-RFLP

中圖分類(lèi)號(hào)：S813.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? 文章編號(hào)：1001-0769（2023）03-0048-02

殺菌性/通透性增加蛋白（bactericidal/permeability increasing protein，BPI）是最早在人多形核中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中被發(fā)現(xiàn)的一種脂多糖結(jié)合蛋白，是中性粒細(xì)胞中的一種蛋白分子，具有抗微生物活性[1]。在動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)和抵抗病毒感染方面，BPI基因不可或缺；BPI基因的多態(tài)性與動(dòng)物機(jī)體免疫力之間存在顯著相關(guān)性。BPI蛋白是一種儲(chǔ)存于中性粒細(xì)胞起抗感染作用的蛋白質(zhì)，也被冠以“超級(jí)抗生素”的稱(chēng)號(hào)[2]。安慶六白豬俗名“六花豬”，屬肉脂兼用性地方品種，全身被毛黑色，額部﹑尾端和四肢呈白色，故得“六白”之稱(chēng)。安慶六白豬具有抗病性強(qiáng)、耐粗飼的特性。

本試驗(yàn)采用PCR-RFLP法，先提取安慶六白豬基因組DNA，用特異性引物擴(kuò)增BPI基因第10外顯子，再選用HpaⅡ限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切位點(diǎn)的多態(tài)性，為篩選有效分子標(biāo)記提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

試驗(yàn)動(dòng)物：214頭安慶六白豬的耳或尾組織。

主要試劑：瓊脂糖凝膠電泳loading Buffer﹑分子量標(biāo)記、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）、四溴乙烷（tetrabromoethane，TBE）、HpaⅡ限制性?xún)?nèi)切酶、PCR mix、溴化乙錠等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取

氯化鈉沖洗組織，組織剪碎后加蛋白酶K，經(jīng)1％十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）裂解液裂解細(xì)胞和消化蛋白質(zhì)，用苯酚-氯仿萃取，高速離心后棄上清液，保存DNA。

1.2.2 PCR-RFLP

設(shè)計(jì)擴(kuò)增BPI基因第10外顯子的引物序列，上游引物：5'-CCAAACATGGAGATGCAGTTC-3'，下游引物：5'-CAATGAATC AATGAGCACACC-3'。以豬的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：PCR Mix 25μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 22.0 μL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min， ?4 ℃保存。用限制性核酸內(nèi)切酶HpaⅡ處理PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切體系（16μL）為：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4.0 μL，10×buffer 2.0 μL，HpaⅡ酶 ? 0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。產(chǎn)物條帶與預(yù)期大小一致，大小為445 bp。

2.2 PCR-RFLP分析結(jié)果

將PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶HpaⅡ進(jìn)行酶切后，產(chǎn)生3種條帶，分別為445 bp、304 bp、142 bp（圖1）。根據(jù)條帶組成確定基因型，分別為GG型（445 bp）、GT型（445 bp、304 bp、142 bp）和TT型（304 bp、142 bp）。

2.3 安慶六白豬BPI基因的基因型及等位基因頻率

安慶六白豬BPI基因的基因型及等位基因頻率見(jiàn)表1。結(jié)果表明，安慶六白豬的優(yōu)勢(shì)基因型為GT基因型，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門(mén)等位基因。

3 ?結(jié)果與討論

本研究以214頭安慶六白豬為研究對(duì)象，通過(guò)PCR-RFLP方法，對(duì)BPI基因第10外顯子進(jìn)行了多態(tài)性分析。結(jié)果表明，Ｔ是安慶六白豬的優(yōu)勢(shì)等位基因，共存在GG、TT和GT三種基因型，其中GT基因型頻率更高，推測(cè)該基因型的安慶六白豬可能具有較高的免疫應(yīng)答能力。

參考文獻(xiàn)

[1] WEISS J，ELSBACH P，OLSSON I，et al．Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes[J]．Journal of Biological Chemistry，1978，253（8）：2664-2672.

[2] WIESNER J，VILCINSKAS A．Antimicrobial peptides： the ancient arm of the human immune system[J]．Virulence，2010，1（5）：440-464.