維生素D 干預(yù)對(duì)支氣管哮喘幼鼠外周血T 淋巴細(xì)胞平衡調(diào)節(jié)及腸道菌群的影響

蔡姿秀 周?chē)?guó)華 田 軍

1.杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院兒科，浙江杭州 311200；2.杭州市蕭山區(qū)第三人民醫(yī)院兒科，浙江杭州 311256

支氣管哮喘（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“哮喘”）是兒童常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病。有研究顯示，我國(guó)每十年哮喘患兒發(fā)病率上升20%～50%，嚴(yán)重影響患兒身心健康[1]。目前，哮喘發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，有研究認(rèn)為維生素D（vitamin D，VitD）和體內(nèi)微生物變化也是發(fā)病的重要因素[2]。VitD 能調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡，在免疫細(xì)胞分化和發(fā)育中起重要作用[3-7]。VitD 及其信號(hào)通路可通過(guò)影響腸道屏障完整性及微生物組成，進(jìn)而影響腸道免疫反應(yīng)[8-9]。本研究通過(guò)體外補(bǔ)充VitD 方式，觀察哮喘幼鼠外周血T 淋巴細(xì)胞及腸道菌群改變，從而闡述哮喘患兒VitD、腸道菌群、免疫平衡三者的相互作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7 d 齡體重4.09～6.13 g 的SPF 級(jí)野生型BALB/c雌性幼鼠，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006，合格證號(hào)：20180006035029。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IACUC-20211025-07）。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21～25℃，濕度為50%～60%。

1.2 主要試劑及儀器

幼鼠Th1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatoryTcell，Treg）流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，70-KTH201-25、70-KTH217-25、70-KTH219-25）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏液（Sigma，A5503-1G）；氫氧化鋁（Thermo，77161）；磷酸鹽緩沖液（Biosharp，BL302A）；霧化器[百瑞醫(yī)療科技（常州）有限公司，BRM-077Ⅲ]；顯微鏡（Leica，DM2000）。

1.3 動(dòng)物分組和模型制備

動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)2 d 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，選取30 只幼鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為哮喘模型組15 只，VitD 干預(yù)組15 只，另選10 只作為健康對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)第1、7 天，哮喘模型組和VitD 干預(yù)組予10%OVA 致敏液200 μl腹腔注射；健康對(duì)照組注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第19天，將哮喘模型組和VitD 干預(yù)組置于20 cm×20 cm×30 cm的密閉容器內(nèi)，給予3%OVA 溶液10 ml 霧化吸入20 min，健康對(duì)照組在相同條件下霧化吸入等量生理鹽水。1 次/d，連續(xù)霧化6 d。幼鼠在霧化過(guò)程中有明顯活動(dòng)過(guò)多、搔耳橈鼻，證明造模成功[10]。

1.4 干預(yù)給藥

實(shí)驗(yàn)第18 天，VitD 干預(yù)組給予VitD 滴劑[國(guó)藥控股星鯊制藥（廈門(mén)）有限公司]灌胃，給藥劑量為35 μg/（kg·周），1 次/2 d，共2 周，其余兩組均給予等體積磷酸鹽緩沖液灌胃[11]。

1.5 標(biāo)本采集

三組給藥結(jié)束24 h 后摘除眼球取血至抗凝試管，4℃保存送檢。取血后處死動(dòng)物，打開(kāi)胸腔暴露肺組織，取出右肺放入10%甲醛溶液中，常溫固定72 h；剪開(kāi)腹腔分離結(jié)腸，取出糞便放置于凍存管，加入液氮置于-80℃冰箱保存送檢。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1 肺組織切片染色 肺組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片并行蘇木精-伊紅染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.6.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取抗凝血裂解紅細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)算三組外周血Th1/Th2 比值、Th17/Treg 比值，按照儀器及試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6.3 16S rDNA 測(cè)序 將三組糞便送至杭州聯(lián)川生物科技股份有限公司行16S rDNA 測(cè)序。通過(guò)對(duì)基因序列剪切過(guò)濾，測(cè)得每份樣品中基因序列條數(shù)，在門(mén)和屬水平上分析物種豐富度，計(jì)算Alpha、Beta 多樣性，并進(jìn)行比較。Alpha 多樣性可反映特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性，Beta 多樣性可用于分析物種間差異性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組肺組織病理學(xué)結(jié)果

健康對(duì)照組肺組織支氣管壁及肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出，肺泡上皮排列有序，肺泡壁厚度正常；哮喘模型組肺泡壁結(jié)構(gòu)受損，肺泡上皮細(xì)胞破壞，氣管平滑肌增厚，管腔狹窄，黏膜充血水腫，血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)。VitD 干預(yù)組與哮喘模型組比較，肺組織炎癥反應(yīng)明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 三組肺組織蘇木精-伊紅染色（200×）

2.2 三組Th1/Th2 比值、Th17/Treg 比值比較

哮喘模型組外周血Th1/Th2 比值低于健康對(duì)照組，Th17/Treg 比值高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VitD 干預(yù)組Th1/Th2 比值高于健康對(duì)照組，Th17/Treg 比值低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組Th1/Th2 比值、Th17/Treg 比值比較（）

表1 三組Th1/Th2 比值、Th17/Treg 比值比較（）

注 與健康對(duì)照組比較，aP＜0.05；與哮喘模型組比較，bP＜0.05。Treg：調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞；VitD：維生素D

2.3 三組腸道菌群測(cè)序比較

2.3.1 三組腸道菌群Shannon 指數(shù)曲線分析 三組測(cè)序樣本微生物物種Shannon 指數(shù)曲線趨平緩，提示數(shù)據(jù)量足夠大，物種豐度高且分布均勻。見(jiàn)圖2。

圖2 三組腸道菌群Shannon 指數(shù)曲線

2.3.2 三組腸道菌群Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性分析顯示，三組Simpson 指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 三組腸道菌群Simpson 指數(shù)比較

2.3.3 三組腸道菌群Beta 多樣性分析PCoA 圖分析顯示，各組組內(nèi)樣本呈現(xiàn)聚集傾向，而組間樣本之間距離接近，組內(nèi)樣本均在95%置信區(qū)間內(nèi)，其中哮喘模型組和健康對(duì)照組組間距離大，VitD 干預(yù)組與哮喘模型組組間距離近，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。見(jiàn)圖4。

2.3.4 三組腸道菌群物種組成分析 門(mén)水平上包括15個(gè)門(mén)，F(xiàn)irmicutes 和Bacteroidota 是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。哮喘組Actinobacteriota 豐度低于健康對(duì)照組，Proteobacteria 豐度高于健康對(duì)照組，VitD 干預(yù)組Actinobacteriota、Proteobacteria 豐度均高于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。屬水平上包括23 個(gè)屬，哮喘模型組Helicobacter、Colidextribacter 豐度低于健康對(duì)照組，Ligilactobacillus、Bacteroides 豐度高于健康對(duì)照組，VitD 干預(yù)組Helicobacter、Colidextribacter 豐度高于哮喘模型組，Ligilactobacillus、Bacteroides 豐度低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與基于屬水平的heatmap 分析結(jié)果一致。見(jiàn)圖6～7。

圖5 三組腸道菌群門(mén)水平下物種組成分析

圖6 三組腸道菌群屬水平下物種組成分析

圖7 三組腸道菌群屬水平的heatmap 分析

3 討論

經(jīng)典Th1/Th2 細(xì)胞失衡被認(rèn)為是哮喘主要發(fā)病機(jī)制，在炎癥發(fā)展過(guò)程中起促進(jìn)作用[12-13]。VitD 在體外抑制T 細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-17 和γ 干擾素，可誘導(dǎo)腸道發(fā)揮免疫效應(yīng)[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒中VitD水平普遍偏低，與哮喘嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[15-16]。但Luo等[17]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充VitD 后患兒哮喘發(fā)作率并沒(méi)有改善。本研究給予VitD 干預(yù)的幼鼠血清Th1/Th2 水平較哮喘幼鼠上升，而Th17/Treg 水平下降，提示VitD 參與哮喘幼鼠免疫穩(wěn)態(tài)。人類(lèi)和嚙齒動(dòng)物的主要微生物群是Firmicutes 和Bacteroides[18]，其為宿主提供營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)血管再生，增加IgA 表達(dá)，在能量代謝和免疫保護(hù)中發(fā)揮作用[19-22]，同時(shí)腸道微生物可通過(guò)VitD 狀態(tài)和/或暴露來(lái)改變[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充VitD 會(huì)引起物種變化，使Bacteroides和Proteobacteria 增加[24-25]。本研究給予VitD 干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，在VitD 干預(yù)組中Actinobacteriota、Proteobacteria 豐度較哮喘模型組增加，Helicobacter、Colidextribacter 豐度較哮喘模型組增加，而Ligilactobacillus、Bacteroides 較哮喘模型組豐度減少，上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。

綜上所述，本研究提示VitD 可調(diào)節(jié)哮喘失衡及改善腸道穩(wěn)態(tài)，從一個(gè)新視角闡述“肺-腸軸”定義[26-28]，但由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床存在差距，VitD 是否為腸道微生物群落影響肺免疫反應(yīng)的推動(dòng)因子這一推斷及其可能的潛在機(jī)制仍需要更多研究來(lái)確認(rèn)。