鈍綴錦蛤胚胎、幼蟲及稚貝發(fā)育觀察

張柯馨,楊尚松,羅澤鑫,張 元,展建強,陳麟廣,盧怡凝,劉志剛,2

( 1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,廣東 湛江 524088; 2.廣東省海產(chǎn)無脊椎動物科技創(chuàng)新中心,廣東 湛江 524088 )

鈍綴錦蛤(Tapesdorsatus)俗稱沙包螺,屬簾蛤科綴錦蛤?qū)?是一種熱帶、亞熱帶海洋經(jīng)濟貝類,多棲息于潮間帶下區(qū)和潮下帶淺水區(qū)的泥沙底中,廣泛分布于西太平洋和印度洋水域[1]。鈍綴錦蛤具有個體大、生長速度快、肉質(zhì)鮮美、對污染抵抗能力強等優(yōu)點,是一種經(jīng)濟價值高的貝類,目前以天然捕撈為主,由于自然資源破壞嚴重,其人工養(yǎng)殖已提上日程。目前,國內(nèi)對鈍綴錦蛤的研究多集中在生態(tài)習(xí)性[2]、繁殖生物學(xué)及稚貝生長[3]、形態(tài)性狀對活體質(zhì)量的影響[4]、攝食率和同化率[5]、遺傳力分析[6]、分子分類[7-8]等方面;國外鈍綴錦蛤的相關(guān)研究集中在孵化生產(chǎn)[9]、鹽度試驗[10]、生長和存活[11]等方面。在貝類的遺傳育種中,掌握其胚胎發(fā)育、幼蟲生長過程至關(guān)重要[12]。而有關(guān)鈍綴錦蛤的胚胎、幼蟲及稚貝發(fā)育的形態(tài)觀察報道較少,僅見巫旗生等[13]關(guān)于鈍綴錦蛤繁殖周期和胚胎發(fā)育的報道,其主要研究了鈍綴錦蛤的性腺發(fā)育和周年不同階段肥滿度變化,對其胚胎、幼蟲發(fā)育描述較少。為此,筆者研究了鈍綴錦蛤胚胎、幼蟲、稚貝連續(xù)發(fā)育過程的形態(tài)特征及發(fā)育規(guī)律,旨在為鈍綴錦蛤的形態(tài)發(fā)育生物學(xué)和人工育苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2020年12月—2021年2月在廣東湛江雷州市覃斗鎮(zhèn)英嶺村貝苗培育基地進行。鈍綴錦蛤2齡親貝,為采集自越南自然海區(qū)的野生個體,平均殼長(64.94±3.22) mm、平均殼高(43.65±2.65) mm、平均殼寬(26.32±1.24) mm。

1.2 方法

1.2.1 人工育苗

親本生殖腺飽滿,包圍整個內(nèi)臟團,雌性呈乳白色,雄性呈橙黃色。將成熟親貝平鋪于塑料筐底,置于育苗車間陰干6～8 h,再放置于水溫25 ℃的產(chǎn)卵池中,流水刺激催產(chǎn),密度2～3個/mL,產(chǎn)卵過程保持充氣,受精卵發(fā)育成D型幼蟲后按常規(guī)育苗方法培養(yǎng);當50%的幼體長至殼頂后期,投放30 cm×30 cm黑色塑料板附著基采苗;稚貝殼長達0.8～1.0 mm時,即可作為商品貝苗出池,結(jié)束試驗觀察。培育全程保持微充氣,溫度25～26 ℃,鹽度29～31,pH 7.6～8.0,溶解氧質(zhì)量濃度>6.5 mg/L。浮游期幼蟲采用封閉式培育,不換水,投喂小球藻(Chlorellavulgaris)。附著后1周采用流水式培育,餌料為蝦塘復(fù)合藻,主要有波吉卵囊藻(Oocystisborgei)、小球藻、扁多甲藻(Peridiniomdepressum)等,經(jīng)抽水泵自蝦塘抽出后過300目篩網(wǎng)后投喂。每日14:00測量幼蟲的殼長、殼高與密度。

1.2.2 胚胎、幼蟲和稚貝的形態(tài)觀測

于光學(xué)顯微鏡10×10倍帶目微尺刻度鏡頭下觀察胚胎、幼蟲、稚貝各時期形態(tài)特征,并用游標卡尺(精確度0.02 mm)對隨機選取的30個樣本進行殼長、殼高的測量。各時期測量的時間點取在50%個體進入該時期為標準。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示,用Origin軟件作圖。

生長率計算公式如下:

RL=(Lt-L0)/t

Rh=(ht-h0)/t

式中,RL為殼長生長率(μm/d),Rh為殼高生長率(μm/d),L0和Lt分別為各個發(fā)育階段初始殼長(μm)和此發(fā)育階段結(jié)束時殼長(μm),h0和ht分別為各個發(fā)育階段初始殼高(μm)和此發(fā)育階段結(jié)束時殼高(μm),t為各個發(fā)育階段的發(fā)育時間(d)。

2 結(jié) 果

2.1 胚胎發(fā)育

在水溫 25～26 ℃、鹽度 29～31 條件下,鈍綴錦蛤胚胎發(fā)育速度見表1。鈍綴錦蛤卵子呈圓形,未見卵核,不見胚泡,規(guī)格為(59.0±2.2) μm。受精后卵子隆起受精膜(圖1a),約0.25 h釋放第1極體(圖1b),約隔10 min釋放第2極體。受精后約 0.75 h完成第1次卵裂,形成1大1小2分裂球的2細胞期(圖1c)。第2次卵裂在受精后約1.08 h完成,形成1大3小4個分裂球的4細胞期(圖1d)。受精后約1.75 h,完成第3次卵裂,形成1大7小8個分裂球的8細胞期(圖1e)。約2.38 h完成第4次卵裂,形成1大15小16個分裂球的16細胞期(圖1f)。鈍綴錦蛤受精卵第1次、第2次卵裂為不等全裂,自第3次卵裂開始為螺旋卵裂。受精后約3.5 h進入32細胞期及以上的桑葚期(圖1g),外表似桑葚果。桑葚期胚胎進一步發(fā)育,約在受精后4 h,進入橢圓形的囊胚期,囊胚的表面出現(xiàn)纖毛,受精膜破裂,胚胎開始轉(zhuǎn)動(圖1h)。受精后約4.5 h,發(fā)育形成原腸胚,出現(xiàn)原口(圖1i)。受精后6.5 h,胚體逐漸變成檸檬形,隨后頂部隆起一圈纖毛環(huán),其上密布纖毛,使胚體快速游動,纖毛環(huán)中央有一根纖毛,稱為頂纖毛,通過擺動控制胚體游動方向,胚體尾部半透明區(qū)為分泌貝殼的殼腺,此期為擔輪幼蟲期(圖1j)。受精后約16 h,擔輪幼蟲后背方左右各分泌1片半圓形貝殼,2片貝殼中央外凸,在幼蟲背部呈直線鉸合,在幼蟲腹部游離,將蟲體包含在其中,擔輪幼蟲纖毛環(huán)延伸和拓寬成為面盤,在殼內(nèi)外伸縮自如,形成D形幼蟲(圖1k),至此,胚胎孵化完畢。

圖1 鈍綴錦蛤胚胎幼蟲及稚貝發(fā)育結(jié)構(gòu)Fig.1 Development structure diagram of embryos, larvae and juvenile T. dorsatusa.卵子; b.受精卵(出現(xiàn)第1極體); c.2細胞期; d.4細胞期; e.8細胞期; f.16細胞期; g.桑葚期; h.囊胚期; i.原腸期; j.擔輪幼蟲; k.D形幼蟲; l.殼頂初期幼蟲; m.殼頂中期幼蟲; n.殼頂后期幼蟲; o.剛完成附著長出次生殼的稚貝; p.附著后無管期稚貝; q.單管期稚貝; r.雙管期稚貝.a.egg; b.fertilized egg(release of the first polar body); c.2-cell stage; d.4-cell stage; e.8-cell stage; f.16-cell stage; g.morula; h.blastula;i.gastrula; j.trochophore; k.D-shaped larva; l.early umbo larva; m.medium term umbo larva; n.post umbo larva; o.juveniles with newly attached and grown into secondary shell; p.non siphon stage juvenile after attachment; q.single siphon stage juvenile; r.double siphon stage juvenile.

表1 鈍綴錦蛤胚胎發(fā)育時間Tab.1 Embryonic development schedule of T. dorsatus

2.2 幼蟲及稚貝發(fā)育

2.2.1 各時期劃分及對應(yīng)體尺和發(fā)育時間

根據(jù)幼蟲與稚貝的初始殼長、殼面觀、足部的形成與變化、平衡囊與鰓絲的形成、面盤退化時間、足絲的出現(xiàn)時間、水管形成等特征,將鈍綴錦蛤浮游幼蟲期分為D形幼蟲、殼頂初期幼蟲、殼頂中期幼蟲、殼頂后期幼蟲、變態(tài)期幼蟲等5個時期[14];將稚貝期分為無管期稚貝、單管期稚貝、雙管期稚貝3個時期[15]。幼蟲和稚貝各時期起始體尺和發(fā)育時間見表2。

表2 鈍綴錦蛤幼蟲和稚貝發(fā)育各期起始體尺和發(fā)育時間Tab.2 Initial body size and development time of larva and juvenile of T. dorsatus

2.2.2 幼蟲發(fā)育各期特征

(1)D形幼蟲:D形幼蟲初始殼長(101.8±3.7) μm,第1天消化系統(tǒng)尚未完善,尚不具備吞食消化的機能。第2天幼蟲消化道已打通,開始吞食和消化食物,幼蟲胃部開始出現(xiàn)單胞藻顆粒,肝臟顏色逐漸變深。D形幼蟲殼長(101.8±3.7)～(153.8±5.3) μm。

(2)殼頂初期幼蟲:幼蟲殼頂由直線狀態(tài)微微變成弧形,在內(nèi)臟團下方形成圓球形的足原基。消化盲囊和胃逐漸發(fā)達,對單胞藻消化與吸收能力增強,消化盲囊呈黃褐色或黃綠色(圖1l)。此期殼長(153.8±5.3)～(185.7±8.2) μm。

(3)殼頂中期幼蟲:背部殼頂繼續(xù)隆起,似圓滑低矮的小山丘,殼面觀殼頂接近左右對稱。足原基由圓球形發(fā)育為靴狀,足基部發(fā)育出1對空泡狀的細胞團,直徑約10 μm,里面含1粒圓形的灰褐色耳石,即平衡囊(圖1m)。此期殼長(185.7±8.2)～(213.1±6.9) μm。

(4)殼頂后期幼蟲:此時殼頂隆起更顯著,殼面觀殼頂仍然接近左右對稱,靴狀足延伸呈帶狀,有一定的伸縮能力,同時,兩對成管狀的鰓絲于足基部兩側(cè)形成。面盤仍很發(fā)達,足基部的平衡囊由于耳石顆粒增大而變得明顯,直徑約15 μm,幼蟲發(fā)育過程中未出現(xiàn)“眼點”。幼蟲成熟進入附著的特征為鰓絲形成、平衡囊增大,殼長(228.4±11.2) μm(圖1n)。此期殼長(213.1±6.9)～(228.4±11.2) μm。

(5)變態(tài)期幼蟲:D形幼蟲經(jīng)過17 d 發(fā)育至變態(tài)期幼蟲,約3 d后附著完畢。此期面盤萎縮,浮游能力變?nèi)?并逐漸下沉至附著板表面或水池底部,一邊依靠尚未脫落的面盤做間歇性浮游,一邊利用足部在底部做匍匐運動(此期幼蟲也可稱匍匐幼蟲),隨后,面盤上的纖毛細胞逐漸脫落,最終面盤解體消失,失去浮游能力,進入短暫的底棲匍匐生活直至分泌足絲營附著生活,并開始用鰓絲呼吸,靠鰓絲的擺動濾食水中食物顆粒,由浮游向附著生活方式的轉(zhuǎn)變由此完成(圖1o)。此期殼長(228.4±11.2)～(234.5±11.2) μm。

2.2.3 稚貝發(fā)育各期特征

(1)無管期稚貝:從附著后開始分泌次生殼,胚殼與次生殼銜接處形成邊界,即生長線,據(jù)此可以判斷胚殼的最終大小,兩種殼透明度相同。體內(nèi)鰓絲逐漸增多,呼吸和攝食功能逐步加強。貝殼殼頂在原有基礎(chǔ)上逐漸凸起并向前端傾斜,殼面觀殼頂開始左右不對稱。此期水管尚未形成,排泄和攝食依賴進出水孔完成(圖1p)。此期殼長(234.5±11.2)～(484.8±50.8) μm。

(2)單管期稚貝:殼頂繼續(xù)隆起,向前端傾斜明顯,殼面觀殼頂左右明顯不對稱。在殼背后方長出出水管,管口缺乏觸手(圖1q)。此期殼長(484.8±50.8)～(578.1±76.7) μm。

(3)雙管期稚貝:進水管在稚貝殼后腹方長出,其長度短于出水管,管口環(huán)繞著觸手(圖1r),用于阻攔大顆粒物質(zhì)進入體內(nèi)。稚貝各器官已發(fā)育完善,貝殼形態(tài)與成體基本相同。此期殼長大于(578.1±76.7) μm。

2.3 鈍綴錦蛤幼蟲和稚貝的生長

幼蟲期范圍是D形幼蟲到變態(tài)期幼蟲,此時期生長較為緩慢,D形幼蟲殼長為(101.8±3.7) μm,至變態(tài)期幼蟲殼長達到(228.4±11.2) μm(圖2)。此時期幼蟲形態(tài)變化明顯,直線鉸合隆起,體積增大。稚貝期包括附著后無管期稚貝、單管期稚貝和雙管期稚貝,稚貝期由于消化系統(tǒng)發(fā)育完善,攝食增加,體積迅速增大,附著后無管期稚貝初始殼長為(234.5±11.2) μm,到雙管期稚貝時初始殼長達(578.1±76.7) μm,稚貝各器官已發(fā)育完善,貝殼形狀與成體基本相同。

圖2 鈍綴錦蛤幼蟲、稚貝的生長Fig.2 Growth of larva and juvenile of T. dorsatus

幼蟲期的殼長生長率與殼高生長率分別為7.1 μm/d和7.5 μm/d(表3);變態(tài)期幼蟲至附著無管期稚貝殼長生長率與殼高生長率分別為2.0 μm/d和1.4 μm/d;附著無管期稚貝至單管期稚貝殼長生長率與殼高生長率分別為11.4 μm/d和10.0 μm/d;單管期稚貝至雙管期稚貝殼長與生長率殼高生長率分別為18.7 μm/d和18.1 μm/d;雙管期稚貝至試驗結(jié)束殼長生長率與殼高生長率分別為27.1 μm/d和24.6 μm/d;結(jié)果與生長曲線中的變化趨勢吻合,均呈現(xiàn)“快-慢-快”變化的規(guī)律。

表3 鈍綴錦蛤幼蟲期、稚貝期生長率Tab.3 Growth rate in larva and juvenile stages of T. dorsatus

3 討 論

3.1 鈍綴錦蛤的發(fā)育分期及殼長范圍界定

鈍綴錦蛤的胚胎與幼蟲發(fā)育分期與大部分雙殼貝類相同,如皺肋文蛤(Meretrixlyrata)[16]、厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)[17]等;稚貝發(fā)育分期則與大部分埋棲性雙殼貝類相同,如皺肋文蛤[16]、大獺蛤(Lutrariamaxima)[18]、施氏獺蛤(L.sieboldii)[19]、大竹蟶(Solengrandis)[20]、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)[21]、砂海螂(Myaarenaria)[22]等。筆者根據(jù)鈍綴錦蛤幼蟲與稚貝的初始殼長、殼面觀、足部的形成與變化、平衡囊與鰓絲的形成、面盤退化時間、足絲的出現(xiàn)時間、水管形成等特征,參照相關(guān)資料的劃分方法[14-15],更加詳細地描述了各期形態(tài)特征,并據(jù)此將鈍綴錦蛤浮游幼蟲期分為D形幼蟲、殼頂初期幼蟲、殼頂中期幼蟲、殼頂后期幼蟲、變態(tài)期幼蟲等5個時期,將稚貝期分為無管期稚貝、單管期稚貝、雙管期稚貝等3個時期,各期劃分的依據(jù)與巫旗生等[13]的研究基本一致,但巫旗生等[13]未對稚貝期進行詳細的劃分。此外,筆者依據(jù)幼蟲及稚貝各時期形態(tài)特征,對幼蟲及稚貝各期的殼長范圍做了明確的界定,方法是當該批幼蟲或稚貝有50%發(fā)育到該時期時,即將該批幼蟲或稚貝殼長的平均值作為本時期的初始殼長,此期的殼長范圍即為本階段的初始殼長至下階段的初始殼長。關(guān)于鈍綴錦蛤的各時期殼長范圍的界定未見報道,此研究結(jié)果可為鈍綴錦蛤形態(tài)發(fā)育生物學(xué)、人工育苗提供參考。

3.2 鈍綴錦蛤的受精及胚胎發(fā)育特點

鈍綴錦蛤雌雄異體,1齡即達性成熟,行體外受精。由性腺成熟的鈍綴錦蛤自然排放出卵子,排放過程中卵子進入第1次成熟分裂中期,未見卵核(胚泡),這一時相的卵子即具備受精能力。這與文宇[3]關(guān)于鈍綴錦蛤的研究結(jié)果一致;與張云飛[23]報道的雜色蛤(Ruditapesvariegata)的卵用解剖法取出的不易受精,采用0.01%～0.03%氨海水浸泡10 min可以受精發(fā)育的現(xiàn)象吻合,氨海水的作用在于促進卵子在體外發(fā)育進入第1次成熟分裂中期。鈍綴錦蛤未受精的卵子處于第1次成熟分裂中期,這與菲律賓蛤仔(R.philippinarum)[24]、泥蚶(Tegillarcagranosa)[25]相同。鈍綴錦蛤行體外受精,這與大部分雙殼貝類相同,如合浦珠母貝(Streptoderatrachelostropha)[26]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[27]等。鈍綴錦蛤卵子受精時會隆起一層受精膜,這與皺肋文蛤[16]、雜色蛤[23]、厚殼貽貝[17]等雙殼貝類相同。胚胎發(fā)育觀察發(fā)現(xiàn),鈍綴錦蛤受精卵在受精后15 min即釋放第1極體,這與巫旗生等[13]的研究結(jié)果相同,同時與相近物種菲律賓蛤仔[24]和波紋巴非蛤(Paphiaundulata)[28]研究結(jié)果相一致,比泥蚶[25]和大獺蛤[18]釋放慢,但比厚殼貽貝[17]、皺肋文蛤[16]釋放快,這種現(xiàn)象除了與品種遺傳特征有關(guān),也可能與受精溫度高低有關(guān),也不排除與受精時間的界定有關(guān)。另外本試驗中鈍綴錦蛤的卵徑及胚胎發(fā)育階段胚胎的大小與巫旗生等[13]報道的相比略小,推測造成差異的原因主要與親本的品種和規(guī)格有關(guān),本試驗親本為采集自越南自然海區(qū)的野生個體,而巫旗生等[13]的親本為采集自廣西北部灣自然海區(qū)的野生個體,本試驗親本的平均殼長、殼高、殼寬均較廣西北部灣野生個體[13]小。在發(fā)育速度方面,本試驗鈍綴錦蛤胚胎期的發(fā)育速度與已有報道大致相同,幼蟲期的發(fā)育速度比已有報道慢,這與其生活的自然生態(tài)環(huán)境密切相關(guān),也可能與本試驗采用的餌料種類及培育方式與已有報道不同有關(guān)。

3.3 鈍綴錦蛤浮游幼蟲發(fā)育成熟進入附著階段的特征

許多雙殼貝類浮游幼蟲發(fā)育成熟的顯著的特征是具有眼點或平衡囊,眼點是幼蟲鰓原基背部上1對由黑色素聚集起來的球形感覺器官,具有感光作用,具有引導(dǎo)幼蟲背光附著的作用;平衡囊是幼蟲足基部上的1對呈空泡狀的細胞團,中央包含1粒圓球形灰褐色耳石。據(jù)報道,許多附著型或固著型雙殼貝類幼蟲發(fā)育過程中都有眼點而沒有平衡囊,如櫛孔扇貝[27]、長牡蠣(Crassostreagigas)[29]、近江牡蠣(Ostrearivularis)[30]、墨西哥灣扇貝(Argopectenirradiansconcentricus)[31]、海灣扇貝(A.irradians)[32]、翡翠貽貝(Pernaviridis)[33]、馬氏珠母貝(Pinctadamartensi)[34]、蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)[35]、紫貽貝(M.galloprovincialis)[36]、大連灣牡蠣(C.talienwhanensis)[37]等;而埋棲型的雙殼貝類多出現(xiàn)平衡囊而沒有眼點,如皺肋文蛤[16]、施氏獺蛤[19]、文蛤(M.meretrix)[38]、青蛤(Cyclinasinensis)[39]、紫石房蛤(Saxidomuspurpuratus)[40]、中國蛤蜊(Mactrachinensis)[41]、大竹蟶[20]、縊蟶[21]、砂海螂[22];但據(jù)報道西施舌(Mactraantiquata)[42]既有眼點,也有平衡囊。本試驗結(jié)果顯示,鈍綴錦蛤幼蟲發(fā)育過程中沒有眼點出現(xiàn),只有平衡囊,與其他已報道的底棲貝類[16,38-40]相同,但巫旗生等[13]并未提及平衡囊。經(jīng)上述對多種雙殼貝類的對比可見,成熟期出現(xiàn)眼點的種類主要為固著、附著生活的雙殼貝類,而出現(xiàn)平衡囊的種類多為埋棲型的雙殼貝類。具有平衡囊的種類,可能與埋棲生活過程的爬行或遷移而需要控制身體平衡有關(guān)。眼點的作用在于引導(dǎo)幼蟲尋找避光的環(huán)境進行固著或附著。但也有報道提出了埋棲型的泥蚶[25]為有眼點種類,而埋棲型的西施舌[42]則兩者都有,其機理有待進一步研究。

3.4 鈍綴錦蛤發(fā)育階段的生長規(guī)律

鈍綴錦蛤胚胎發(fā)育階段體積變化不明顯。自D形幼蟲開始,發(fā)育至變態(tài)附著期幼蟲生長較快;變態(tài)附著期幼蟲發(fā)育較慢,與此期幼蟲在重構(gòu)一些器官,消耗能量較多有關(guān);變態(tài)附著后由于幼蟲器官發(fā)育完善,無管期稚貝發(fā)育較快;到單管期稚貝發(fā)育較慢,與此時期發(fā)育出水管,消耗能量較大有關(guān);到雙管期稚貝又有一個緩慢的生長期,也與進水管發(fā)育消耗能量有關(guān);進水管發(fā)育完成后生長變快。由此可見,鈍綴錦蛤發(fā)育期呈現(xiàn)“快-慢-快”的生長規(guī)律,此規(guī)律目前尚未見報道。由幼蟲期和稚貝期的生長曲線及殼長生長率和殼高生長率可知,鈍綴錦蛤幼蟲期生長率低,稚貝期生長率高的規(guī)律,這與皺肋文蛤[16]、大獺蛤[18]的生長規(guī)律相同。

4 結(jié) 論

通過對鈍綴錦蛤胚胎、幼蟲及稚貝發(fā)育階段進行連續(xù)觀察,記錄了從胚胎到稚貝各個發(fā)育階段的形態(tài)特征;通過對幼蟲、稚貝各時期的殼長測定,劃分了鈍綴錦蛤的各時期殼長范圍;根據(jù)從D形幼蟲至雙管期稚貝殼長、殼高的變化,繪制出鈍綴錦蛤幼蟲及稚貝發(fā)育期的生長曲線,并得出其發(fā)育期呈現(xiàn)“快-慢-快”的生長規(guī)律。