玉竹多糖的體內(nèi)外抗氧化活性分析

王修強　何麗麗　金晨鐘　胡一鴻　王艷

自由基是人體環(huán)境中一種基本的新陳代謝產(chǎn)物，并保持在某一個生理動態(tài)的自然平衡體系中，當人體這個正常平衡系統(tǒng)被完全打破時，就可能引發(fā)很多潛在的健康疾病，比如炎癥、衰老性疾病和急性胃腸道炎癥等。天然植物多糖具有很好的抗氧化活性，一方面能夠直接清除大量自由基，有助于控制機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。另一方面能夠通過直接或者間接調(diào)節(jié)一系列人體細胞自身的生理機制與其他生化或代謝生物學(xué)機制，間接調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶（SOD）的生物活性量、過氧化氫酶（CAT）的生理活性量和超氧化物谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的生物活性量或者是其它抗氧化的活性類物質(zhì)酶的活性量，從而有效清除人體組織內(nèi)長期積累沉淀下來的過量的生物活性氧（ROS）等，提高人體面臨嚴酷的自然逆境變化時的生理適應(yīng)和應(yīng)答能力等。

玉竹（Polygonatum odoratum（Mill.）Druce）是一種具有豐富藥用價值的藥食同源性植物，而玉竹多糖是玉竹中最主要的藥效成分，具有顯著的抗癌、降糖、抗氧化等功效。本研究以團隊前期提取得到的玉竹多糖為研究對象，從體內(nèi)外研究其抗氧化性能，為玉竹多糖的進一步開發(fā)利用提供了參考。

一、材料與方法

1.主要材料與試劑。在此之前，我們團隊對玉竹進行了多糖的分離提純，最終得到純化的玉竹多糖，用苯酚硫酸法測定得到的樣品中的可溶性總脂糖含量大約為61%。DPPH，美國Sigma公司；過氧化氫酶（CAT）、超氧化物谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒，南京建成公司。

2.動物。雄性SD大鼠30只，4周齡，采購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

3.方法。（1）玉竹多糖的體外抗氧化活性分析。①玉竹多糖對DPPH自由基的清除作用。DPPH自由基清除能力的測定參照課題組前期王艷等的方法。用50%的乙醇配制0.1mmol/L的DPPH溶液和0mg/mL-1mg/mL的維生素C（VC），在1.8mL的DPPH溶液中分別加入0.2mL的VC和不同濃度的玉竹多糖（1mg/mL-10mg/mL），混勻后反應(yīng)30min，測量其在517nm處的吸光度Ai；將樣品替換為4.0mL純水后，獲得吸光度Ac，用50%乙醇代替DPPH，獲得吸光度Aj；以VC為陽性對照，各個樣品進行3次平行檢測，玉竹多糖對DPPH自由基的清除率按下方公式進行計算。

②玉竹多糖對羥自由基的清除作用。羥自由基清除能力的測定參照Chen等的方法，步驟如下：將5mL不同濃度的VC和不同濃度的玉竹多糖（1mg/mL-10mg/mL）放入試管中，再將0.6mL的5mM鄰二氮菲、5mL的200mM磷酸緩沖液（pH=7.4）和0.4mL的7.5mm FeSO4溶液加入試管中混合均勻，然后加入0.2mL濃度為30%的H₂O₂，補純水至總體積為10.0mL后，37℃水浴40min，最終測定其在波長510nm處的吸光度，并按下方公式計算玉竹多糖對羥自由基的清除率。

在上述公式中，A樣品為含玉竹多糖和H₂O₂混合物的吸光度，A損傷為含H₂O₂混合物的吸光度，A未損傷為含玉竹多糖混合物的吸光度。

③玉竹多糖還原能力的測定。采用鄰苯三酚自氧化法，測定超氧陰離子自由基的清除率。將0.5mL的0.2M磷酸鹽緩沖劑（pH6.6）及1.5mL濃度為0.3%的K3Fe（CN）6依次加入試管中，與不同濃度的玉竹多糖（1mg/mL-10mg/mL）混合后，于50℃條件下反應(yīng)20min，再加入1mL濃度為10%的TCA，然后開始離心。將2mL上清液與0.5mL濃度為0.3%的FeCl₃溶液混合，10min后測定波長700nm處的吸光度，即為玉竹多糖的還原能力。

（2）玉竹多糖的體內(nèi)抗氧化活性分析。①實驗動物的飼養(yǎng)和喂養(yǎng)。30只雄性SD大鼠被隨機分成3組，即營養(yǎng)正常膳食組（NC，n=10）、高脂膳食組（HF，n=10）和玉竹多糖膳食組（PSP，n=10）。營養(yǎng)正常膳食組給予正常的飲食及處理，高脂膳食組喂食高脂飲食，玉竹多糖組按劑量400mg/kg給藥。NC和HF灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水，造模8周后，給藥6周，最后空腹過夜，采用戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，取大鼠腹主動脈血中的大鼠血清，于-80℃冷藏，以備之后再用。②玉竹多糖對高脂膳食大鼠血液抗氧化酶系統(tǒng)的影響。SOD、CAT和GSH-Px酶活及MDA的含量均按相應(yīng)的試劑盒說明書進行測定。

二、結(jié)果與分析

1.玉竹多糖對DPPH自由基的清除作用。由圖1可知，當玉竹多糖的濃度為1mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率為14.06%，相當于同濃度下VC清除率的20%，且其作用呈劑量依賴性，當玉竹多糖的濃度為10mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率高達42%。該結(jié)果表明，玉竹多糖是一種很好的DPPH清除劑。

2.玉竹多糖對羥自由基的清除作用。從圖2分析可知，玉竹多糖對羥自由基的直接清除氧化能力也呈劑量依賴性，隨著玉竹多糖濃度的增加，清除率相應(yīng)上升，具有相對較強的選擇性抗氧化反應(yīng)活性。當玉竹多糖的濃度為1mg/mL時，其對羥自由基的清除率為11.87%。以VC作為陽性對照，其對羥自由基的清除能力達到74.14%，明顯好于玉竹多糖。當玉竹多糖的濃度達到10mg/mL時，其對羥自由基的清除率達到33.48%，這說明玉竹多糖的確是另外一種功能相對弱一些的羥自由基清除劑。

3.玉竹多糖的還原能力測定。多糖的抗氧化活性與還原性密切相關(guān)，從圖3可以看出，玉竹多糖和VC都具有清除超氧陰離子自由基的功能，并且呈現(xiàn)出了劑量依賴性，即濃度劑量越大，清除功能越強。但是在同樣的濃度條件下，VC的還原能力明顯高于玉竹多糖。當VC濃度為1mg/mL時，其還原能力達到2.42±0.084。此時，玉竹多糖的還原能力為0.45±0.032，僅占VC的18.59%，這表明玉竹多糖具有較弱的還原能力。

4.在長期高脂膳食條件的誘導(dǎo)下，玉竹多糖對大鼠血液蛋白中的CAT、SOD、GSH-Px活性及血清MDA含量水平的影響。由表1可知，高脂膳食HF組的CAT、SOD和GSH-Px均明顯低于NC對照組（P＜0.05），MDA含量則明顯高于NC對照組（P＜0.01）。但經(jīng)玉竹多糖灌胃4周后，可以顯著提高HF組的抗氧化酶活性（CAT、SOD和GSH-Px，P＜0.01），并且顯著降低MDA含量（P＜0.05），表明玉竹多糖能夠提高肝臟修復(fù)高脂膳食引發(fā)的氧化損傷的能力。

三、結(jié)論與討論

玉竹多糖是藥食同源性植物玉竹的主要活性物質(zhì)，在本研究的體外抗氧化活性實驗中，我們進一步證實了玉竹多糖對DPPH自由基和羥自由基具有較強的清除作用和一定的還原作用。

抗氧化酶系統(tǒng)SOD、CAT和GSH-Px在逆境脅迫響應(yīng)中起到了重要作用。當機體遭受逆境脅迫時，其能夠利用一系列生理生化機制，對這些酶類的活性進行調(diào)控，或者是對抗氧化類物質(zhì)的量進行調(diào)控，從而將體內(nèi)過量積累的ROS清除掉，以此來提升機體的逆境適應(yīng)能力。相反，如果其抗氧化酶活性下降，就會導(dǎo)致自由基損害人體。我們在體外實驗的基礎(chǔ)上，以高脂膳食肥胖大鼠為研究對象，觀察了玉竹多糖的體內(nèi)抗氧化活性，研究結(jié)果表明，高脂膳食大鼠被玉竹多糖灌胃6周后，血清中SOD、GSH-Px和CAT水平明顯上升，說明玉竹多糖可以通過上調(diào)主要的抗氧化酶的活性來增強抗氧化防御系統(tǒng)，以應(yīng)對高脂膳食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

高脂膳食后ROS過度積累可導(dǎo)致生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而脂質(zhì)過氧化會導(dǎo)致細胞膜的流動性下降、通透性增加，導(dǎo)致胞質(zhì)蛋白丟失。因此，抑制脂質(zhì)過氧化對維持正常的細胞功能至關(guān)重要。MDA是用來衡量膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度大小的又一項重要指標，也可以反應(yīng)生物體膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的難易程度。在本研究中，玉竹多糖顯著降低了高脂膳食大鼠的MDA水平，說明玉竹多糖可以有效減弱脂質(zhì)過氧化。

基金項目：湖南省自然科學(xué)基金項目“亮白曲谷氛酸脫氣酶（ACGDH）提高水稻耐旱性的作用機理研究”（2021JJ40057）；2019年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目“玉竹多糖對高脂膳食大鼠生殖功能的影響”（201910553013）。

作者簡介：王修強（2003-），男，漢族，湖南婁底人，大學(xué)本科在讀，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)與利用。

何麗麗（2004-），女，漢族，湖南衡陽人，大學(xué)本科在讀，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)與利用。

金晨鐘（1964-），男，漢族，湖南婁底人，教授，大學(xué)本科，研究方向為植物保護。

胡一鴻（1965-），男，漢族，湖南婁底人，教授，博士，研究方向為植物生理。

通信作者：王艷（1985-），女，漢族，湖南婁底人，講師，博士，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)與利用。