EMS誘變對(duì)不同萌發(fā)狀態(tài)草莓種子發(fā)芽率的影響

宋蘭芳, 華明艷, 崔少杰, 金鳳媚, 孔維東, 孫海波

(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 現(xiàn)代都市農(nóng)業(yè)研究所, 天津 301700)

0 引言

【研究意義】育種中常用的化學(xué)誘變劑主要有烷化劑(如甲基磺酸乙酯、甲基硫酸甲酯)堿基類(lèi)似物、疊氮化鈉及抗生素[1]。甲基磺酸乙酯(EMS)誘變譜非常廣,能產(chǎn)生斷裂突變、錯(cuò)義突變等[2],而且EMS在多倍體植物中產(chǎn)生的點(diǎn)突變頻率很高[3],是一個(gè)高效的誘變劑,對(duì)植株損傷較小,產(chǎn)生的突變性狀豐富,而且多為顯性突變體,便于突變體的篩選,可以針對(duì)植物某一性狀進(jìn)行有效改良。草莓的高雜合性和多倍性等特點(diǎn),導(dǎo)致其新品種培育存在培育周期長(zhǎng)、效率低、工作量大等問(wèn)題[4],因而需要研究效率更高的育種手段,為草莓新品種的選育提供豐富的種質(zhì)資源和遺傳背景?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】EMS已在水稻[5]、小麥[6]、玉米[7]等多種作物中用于新種質(zhì)的創(chuàng)造及突變體庫(kù)的構(gòu)建[8-9],目前我國(guó)關(guān)于EMS在草莓上的誘變研究相對(duì)較少。草莓誘變育種是獲得新種質(zhì)資源和選育新品種的有效途徑之一,其與雜交育種和生物技術(shù)結(jié)合,更能提高育種效率和水平[10]。劉艷萌等[11]以草莓繼代苗為材料,經(jīng)過(guò)EMS處理后培養(yǎng)誘導(dǎo)出再生植株,然后以0.8% NaCl為選擇壓力進(jìn)行初步篩選后,發(fā)現(xiàn)再生植株對(duì)鹽漬環(huán)境表現(xiàn)出一定的抗性。羅靜等[12]使用EMS對(duì)草莓品種“幸香”葉片誘導(dǎo)出愈傷組織進(jìn)行處理后,將愈傷組織接種在含有不同濃度灰霉病毒粗提液的培養(yǎng)基上,發(fā)現(xiàn)其對(duì)灰霉病抗性突變發(fā)生不表現(xiàn)規(guī)律性。張經(jīng)緯[13]采用濃度為0.8%EMS處理草莓品種“豐香”種子48 h,篩選得到一批表型發(fā)生顯著變化的單株,變異率約為1%,變異大多發(fā)生于葉片和果實(shí)?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】EMS誘變?cè)诓葺械难芯坎牧现饕遣煌课坏碾x體材料或愈傷組織,以草莓種子為試材的EMS誘變報(bào)道較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)研究EMS誘變對(duì)草莓不同種子萌發(fā)率的影響,旨在觀察EMS對(duì)草莓種子的誘變反應(yīng),確定EMS對(duì)草莓種子誘變的最佳條件,為后期八倍體草莓突變體庫(kù)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ),為進(jìn)一步發(fā)展草莓的EMS誘變育種提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的八倍體草莓品種“津韻1號(hào)”自然授粉種子。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新基地進(jìn)行。以4種不同萌發(fā)狀態(tài)的草莓種子即風(fēng)干種子(自然晾干種子)、吸脹種子(種子浸泡36 h)、萌動(dòng)種子(種皮吸脹微開(kāi)裂未露芽種子)和萌發(fā)種子(冒白尖的種子)為試驗(yàn)材料,設(shè)置5個(gè)EMS濃度處理梯度(0%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%),每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)處理時(shí)間(8 h、12 h、16 h),共60個(gè)處理,其中以0% EMS為對(duì)照(CK),每處理100粒種子,3次重復(fù)。

挑選不同萌發(fā)狀態(tài)的種子,用紗布包好,放入裝有不同濃度EMS的藍(lán)蓋試劑瓶中進(jìn)行誘變處理,期間置于溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速80 r/min的搖床上,分別處理8 h、12 h、16 h后,將種子取出,用流水沖洗12 h,以去除種子表面殘留試劑。將誘變處理后的種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽,隨后置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng),培養(yǎng)1周后進(jìn)行指標(biāo)調(diào)查。

1.3 調(diào)查指標(biāo)與方法

以CK為參照,在培養(yǎng)過(guò)程中,每天進(jìn)行補(bǔ)水,同時(shí)觀察種子發(fā)芽情況,準(zhǔn)確記錄種子的起始發(fā)芽時(shí)間和每日種子發(fā)芽數(shù),在培養(yǎng)20 d后,統(tǒng)計(jì)種子最終發(fā)芽數(shù),并計(jì)算草莓種子的發(fā)芽率,確定半致死劑量。

發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2000對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),用SPSS19.0以Ducan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS處理草莓風(fēng)干種子的發(fā)芽率

由表1可知,在相同時(shí)間下,CK草莓風(fēng)干種子的發(fā)芽率均最高,除處理8 h的CK與EMS濃度為0.4%處理間差異不顯著外,均顯著高于其他處理。風(fēng)干種子的發(fā)芽率隨EMS處理濃度升高而下降,說(shuō)明EMS對(duì)風(fēng)干草莓種子的萌發(fā)有抑制作用。在相同濃度下,EMS濃度為0%～0.4%時(shí),風(fēng)干種子的發(fā)芽率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而升高;EMS濃度為0.6%～1.0%時(shí),風(fēng)干種子的發(fā)芽率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低。說(shuō)明,在低濃度時(shí)EMS誘變時(shí)間抑制效應(yīng)在一定程度上大于誘變濃度,可能因?yàn)轱L(fēng)干種子種皮吸水性較差,對(duì)水分和藥劑吸收較少,因此進(jìn)行誘變?cè)囼?yàn)不建議選用風(fēng)干種子進(jìn)行處理。

表1 EMS不同濃度和處理時(shí)間草莓風(fēng)干種子的發(fā)芽率

2.2 EMS處理草莓吸脹種子的發(fā)芽率

由表2可知,草莓吸脹種子的發(fā)芽率均高于風(fēng)干種子,說(shuō)明草莓種子吸足水分有助于萌發(fā)。在相同時(shí)間下,吸脹種子的發(fā)芽率隨EMS處理濃度升高而降低,這與風(fēng)干種子一致。在相同濃度下,EMS濃度為0～0.4%時(shí),吸脹種子發(fā)芽率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低;EMS濃度為0.6%～1.0%時(shí),吸脹種子的發(fā)芽率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而下降。CK吸脹種子在12 h發(fā)芽率最高,16 h次之,8 h最低,說(shuō)明草莓種子萌發(fā)吸足水分所需時(shí)間在44～52 h;吸脹種子處理之前種子內(nèi)部代謝已經(jīng)活化,誘變劑吸收相對(duì)更容易,所以EMS相同濃度下,16 h的發(fā)芽率低于12 h。

2.3 EMS處理草莓萌動(dòng)種子的發(fā)芽率

由表3可知,在相同時(shí)間下,隨著EMS處理濃度增加,草莓萌動(dòng)種子的發(fā)芽率總體呈顯著下降趨勢(shì),以處理16 h的發(fā)芽率下降幅度最大。在相同濃度下,草莓萌動(dòng)種子的發(fā)芽率均隨處理時(shí)間增加而下降;EMS濃度在0～0.6%時(shí),處理8 h與處理12 h間的萌動(dòng)種子發(fā)芽率差異不大,但均明顯高于處理16 h,說(shuō)明草莓種子在吸足水分后,不能長(zhǎng)時(shí)間浸泡;EMS濃度在0.8%～1.0%時(shí),草莓萌動(dòng)種子的發(fā)芽率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降,其中,EMS濃度為0.8%處理12 h時(shí),草莓種子的發(fā)芽率為52.00%。EMS濃度為0.8%處理12 h時(shí)和EMS濃度為0.6%處理16 h時(shí)的致死率均接近半致死劑量,可作為EMS誘變條件之一,因?yàn)槊葎?dòng)種子長(zhǎng)時(shí)間浸泡會(huì)抑制發(fā)芽,所以推薦EMS濃度為0.8%,處理12 h作為萌動(dòng)種子的最佳誘變條件。綜上表明,低濃度EMS處理對(duì)草莓種子的發(fā)芽率毒害作用較小,隨作用時(shí)間延長(zhǎng)毒害作用顯著;高濃度EMS處理對(duì)草莓萌動(dòng)種子的發(fā)芽率毒害作用較大,即使時(shí)間較短,發(fā)芽率也顯著降低。

2.4 EMS處理草莓萌發(fā)種子的發(fā)芽率

由表4可知,在相同時(shí)間下,隨著EMS處理濃度升高,草莓萌發(fā)種子的發(fā)芽率急劇下降,高濃度EMS處理的發(fā)芽率顯著低于低濃度和CK,說(shuō)明EMS對(duì)草莓萌發(fā)種子的毒害作用顯著,可能是因?yàn)槊劝l(fā)種子的幼芽更容易吸收藥劑,受到的毒害作用更強(qiáng)。在相同濃度下,隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),草莓萌發(fā)種子的發(fā)芽率下降,在EMS濃度為1.0%、處理時(shí)間為16 h時(shí),草莓萌發(fā)種子全部致死;在EMS濃度為0.4%和0.6%、處理時(shí)間為16 h時(shí),種子的發(fā)芽率分別為56.33%和45.33%,接近半致死劑量,可用作EMS誘變條件之一,但鑒于萌發(fā)狀態(tài)的種子嫩芽移栽時(shí)容易人為損傷,不推薦大批量應(yīng)用。

表4 EMS不同濃度和處理時(shí)間草莓萌發(fā)種子的發(fā)芽率

3 討論

種子作為植物最基本的生殖器官,可以在誘變前后較長(zhǎng)時(shí)間保存自身活性以及誘變所致的變異基因,而且試驗(yàn)在常規(guī)環(huán)境下即可進(jìn)行操作,誘變程序簡(jiǎn)單易行,雖然存在滯后性,誘變的性狀差異需要在M2、M3代得以表達(dá),但是所能表現(xiàn)出來(lái)的差異性狀往往可以遺傳,從而可以免去后期相關(guān)鑒定程序[14]。研究表明,不同狀態(tài)的草莓種子對(duì)EMS的敏感度不同,分析可能原因:一是EMS與水溶液混合后會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)。EMS的生產(chǎn)方法一般是通過(guò)甲磺酸和乙醇反應(yīng),甲磺酸能引起植物明顯損傷和不育,有毒物質(zhì)對(duì)不同萌發(fā)狀態(tài)種子種皮的滲透能力不同,因而導(dǎo)致不同狀態(tài)種子的發(fā)芽率不同。二是成熟種子的胚細(xì)胞被許多有活力的細(xì)胞包圍,再加上細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性會(huì)阻礙EMS進(jìn)入胚細(xì)胞[15-16]。因此,EMS相同濃度處理時(shí)間不同,發(fā)芽率不同,尤其是高濃度處理中,隨時(shí)間延長(zhǎng),有毒物質(zhì)對(duì)膜的損傷加劇,導(dǎo)致發(fā)芽率下降。

在化學(xué)誘變育種中想要獲得有效的誘變效果,需要確定適宜的誘變劑量,既能達(dá)到最高的變異率和較寬的變異譜,又不能過(guò)分地?fù)p傷植株,是確定植物適宜誘變劑劑量的重要指標(biāo);過(guò)高的化學(xué)誘變濃度會(huì)提高突變率,但容易導(dǎo)致植物死亡率升高,并會(huì)因細(xì)胞嚴(yán)重受損而造成不良突變的增加,從而掩蓋其他的突變,不利于有利突變性狀的產(chǎn)生,影響化學(xué)誘變效果[17]。本研究中,EMS誘變對(duì)草莓種子的發(fā)芽率在不同處理時(shí)間和濃度以及不同種子萌發(fā)狀態(tài)上均存在差異,表明草莓種子對(duì)EMS處理存在敏感性,各處理組合不是單因素簡(jiǎn)單相加,只有在合適的濃度和時(shí)間組合下才能得到適宜的處理?xiàng)l件[18]。研究表明,草莓萌動(dòng)種子在EMS濃度0.8%、處理時(shí)間12 h時(shí)萌發(fā)率下降至50%左右,達(dá)到半致死劑量,可作為試驗(yàn)篩選的誘變條件。與胡志峰等[19]對(duì)金花菜種子上的研究,即EMS誘變濃度抑制效應(yīng)在一定程度上大于誘變時(shí)間的結(jié)論一致。本試驗(yàn)僅研究了EMS對(duì)八倍體“津韻1號(hào)”草莓種子萌發(fā)率的影響,以半致死劑量為參考,確定EMS誘變草莓種子的最佳條件,試驗(yàn)中所獲得的植株是否在分子層面發(fā)生了變異還有待考證。

4 結(jié)論

不同吸水程度和萌發(fā)狀態(tài)的草莓種子對(duì)EMS的敏感度不同,在處理中應(yīng)根據(jù)種子大小、種皮厚度、種子發(fā)芽勢(shì)等指標(biāo)確定最適合種子誘變的萌動(dòng)狀態(tài)。EMS誘變對(duì)草莓種子的發(fā)芽率在不同處理時(shí)間和濃度以及不同種子萌發(fā)狀態(tài)上均存在差異,各處理組合不是單因素簡(jiǎn)單相加,只有在合適的濃度和時(shí)間組合下才能得到適宜的處理?xiàng)l件,在處理中應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要的誘變效果選擇誘變條件。本試驗(yàn)條件下,萌動(dòng)種子在EMS濃度為0.8%,處理時(shí)間為12 h,草莓種子的發(fā)芽率接近半致死劑量,確定為EMS誘變草莓種子的最佳條件。