基于二代和三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示甘蔗重要親本對(duì)黑穗病菌侵染的響應(yīng)機(jī)制

胡 鑫 羅正英 李純佳 吳轉(zhuǎn)娣 李旭娟 劉新龍

基于二代和三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示甘蔗重要親本對(duì)黑穗病菌侵染的響應(yīng)機(jī)制

胡 鑫 羅正英 李純佳 吳轉(zhuǎn)娣 李旭娟 劉新龍*

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/ 云南甘蔗遺傳改良重點(diǎn)試驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(云南), 云南開(kāi)遠(yuǎn) 661699

黑穗病是甘蔗生產(chǎn)中的主要病害, 嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量。解析甘蔗重要親本與黑穗病菌相互作用的分子機(jī)制及篩選抗病基因?qū)购谒氩?yōu)良品種的培育具有重要意義。本研究選用我國(guó)甘蔗育種中的重要親本新臺(tái)糖ROC25 (抗黑穗病)及其姊妹系ROC22 (感黑穗病)為研究對(duì)象, 采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)(三代測(cè)序)和二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析和鑒定2個(gè)親本感染黑穗病菌后的轉(zhuǎn)錄組譜及差異轉(zhuǎn)錄本。三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析共獲得79,885條轉(zhuǎn)錄本序列, 其中含60,115條完整開(kāi)放閱讀框、3692個(gè)可變剪接事件、1799個(gè)LncRNA、29,139個(gè)SSR和7794個(gè)轉(zhuǎn)錄因子, 共有74,066個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到注釋, 占總數(shù)的92.72%。通過(guò)對(duì)二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析, 在抗病親本中篩選出9716個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本, 在感病親本中篩選出2033個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本。差異轉(zhuǎn)錄本的GO和KEGG富集分析結(jié)果表明抗病親本中共富集到的GO條目和KEGG通路均要多于感病親本, 且植物MAPK信號(hào)通路、苯丙素生物合成、植物-病原互作、亞油酸代謝和蔗糖和淀粉代謝等代謝通路在抗感親本中均被顯著富集, 為抗感親本對(duì)黑穗病的共同抗病途徑。進(jìn)一步, 對(duì)植物MAPK信號(hào)通路的分析表明, MAPK超家族基因成員在抗感親本中呈現(xiàn)不同的表達(dá)方式, 在抗病親本中具有更多差異表達(dá)的和的轉(zhuǎn)錄本, 且、和基因僅在抗病品種中發(fā)生顯著表達(dá)變化, 推測(cè)其可能與親本的抗病表型關(guān)聯(lián)。此外, 抗感親本中眾多WRKY、MYB、NAC和AP2/ERF-ERF等抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)了黑穗病菌脅迫, 且主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。與感病親本相比, 抗病親本顯示出更多的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子, 推測(cè)這些抗病親本特有的轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)防御黑穗病菌具有積極作用。本研究完善了新臺(tái)糖親本基因組注釋信息, 為解析新臺(tái)糖優(yōu)異親本與黑穗病菌互作機(jī)制以及抗黑穗病基因資源的挖掘利用提供指導(dǎo)。

甘蔗; 黑穗病菌; 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組; RNA-seq; 新臺(tái)糖

甘蔗(spp. hybrids)是全球最重要的糖料作物, 也是重要的新型可再生能源作物。黑穗病是甘蔗生長(zhǎng)的主要病害, 在世界各大蔗糖生產(chǎn)國(guó)均有發(fā)生, 為害極為嚴(yán)重, 造成甘蔗產(chǎn)量的減少, 被稱(chēng)為甘蔗的“癌癥”[1]。甘蔗黑穗病的致病菌為黑穗病菌(), 其病原孢子(smut teliospore)可通過(guò)土壤、空氣、雨水和昆蟲(chóng)等傳播途徑侵染蔗芽或側(cè)枝, 刺激頂端分生組織快速生長(zhǎng), 至后期莖頂端組織四周被大量黑穗病孢子包裹并形成典型的黑色鞭狀物。新生成黑鞭中的病菌孢子會(huì)再次侵染快速生長(zhǎng)的頂芽和側(cè)芽, 從而加劇病情發(fā)生和傳播[2]。研究表明, 黑穗病的嚴(yán)重程度既取決于甘蔗品種抗性, 又與環(huán)境條件密切相關(guān), 易感品種在種植2～3年內(nèi)表現(xiàn)出非常高的發(fā)病率(>60%的發(fā)病率), 而高抗品種在試驗(yàn)期間表現(xiàn)出接近零的發(fā)病率[3-4]。提高甘蔗品種的抗性是預(yù)防和控制黑穗病最為經(jīng)濟(jì)有效的方式[5-6]。然而, 由于甘蔗雜交重組率極低、抗黑穗病遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜, 導(dǎo)致傳統(tǒng)雜交育種培育抗黑穗病甘蔗品種難度較大。如果利用優(yōu)異甘蔗種質(zhì), 深入研究甘蔗與黑穗病菌互作機(jī)制, 盡可能多地篩選和鑒定控制甘蔗抗黑穗病的關(guān)鍵基因, 有望將其應(yīng)用于甘蔗抗黑穗病的分子育種, 加快抗黑穗病品種的選育進(jìn)程。在甘蔗與黑穗病菌互作中, 致病孢子主要通過(guò)侵染蔗芽進(jìn)入芽頂端分生組織定植, 該過(guò)程6～36 h即可完成[7]。對(duì)感黑穗病甘蔗品種而言, 在病原侵染后3～4周后, 即可在莖頂端分生組織觀察到大量黑穗病菌絲, 而在抗病品種頂端分生組織中檢測(cè)不到或僅有極少量菌絲, 表明抗感品種中黑穗病發(fā)病進(jìn)程存在明顯差異[8]。感病品種約在感染120 d后開(kāi)始形成黑鞭, 黑鞭四周含有大量厚垣孢子, 而在莖頂端下部節(jié)間薄壁細(xì)胞中分布有黑穗病菌絲, 不形成孢子[9]。目前, 世界各甘蔗生產(chǎn)國(guó)大都采用甘蔗株發(fā)病率來(lái)評(píng)價(jià)甘蔗抗黑穗病的抗性等級(jí), 田間評(píng)價(jià)調(diào)查周期通常持續(xù)7～8個(gè)月[10]。早期, Dean等[11]首先把甘蔗抵御黑穗病機(jī)制劃分為侵染抗性(芽抗性)和定植抗性(內(nèi)部組織抗性)。后來(lái), 普遍將甘蔗抗黑穗病機(jī)制分為外部抗性和內(nèi)部抗性等兩類(lèi), 外部抗性包括甘蔗芽結(jié)構(gòu)特征、芽體鱗片的厚度或緊密性、芽體內(nèi)苯丙酸和糖基類(lèi)黃酮等化學(xué)物質(zhì)造成的物理化學(xué)屏障, 阻止黑穗病菌進(jìn)入芽?jī)?nèi)部建立感染; 而內(nèi)部抗性是甘蔗響應(yīng)黑穗病菌侵染后采取的主動(dòng)抵御致病菌生長(zhǎng)的一序列防御反應(yīng)[12-15]。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)等技術(shù)應(yīng)用于甘蔗與黑穗病菌互作研究, 甘蔗抗黑穗病機(jī)制逐漸被揭示。眾多研究表明甘蔗接種黑穗病菌后, 細(xì)胞壁強(qiáng)化途徑(如木質(zhì)素合成)、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成(如糖蛋白、植保素、多胺、類(lèi)黃酮等)、植物與病原菌的相互作用、活性氧、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase, MAPK)信號(hào)通路、植物激素信號(hào)通路以及與抗性相關(guān)的其他調(diào)控途徑的基因表達(dá)發(fā)生明顯變化, 且抗病品種和感病品種中基因表達(dá)模式也出現(xiàn)明顯的差異, 表明它們與甘蔗響應(yīng)黑穗病菌侵染密切相關(guān), 在調(diào)控甘蔗抵御黑穗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16-21]。甘蔗與黑穗病菌互作進(jìn)程伴隨著廣泛的生理和分子(基因、蛋白、小RNA和降解組、代謝組等)水平變化, 抗性水平受到多個(gè)主效基因、眾多微效基因的共同控制[10,22]。最新研究發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)錄因子[23]、Ras-類(lèi)似GTP結(jié)合蛋白基因[24]、茉莉酸生物合成的關(guān)鍵基因[25]和抗氧化酶系[26]對(duì)甘蔗抗黑穗病起正調(diào)控作用, 而轉(zhuǎn)錄因子對(duì)甘蔗響應(yīng)黑穗病菌脅迫具負(fù)調(diào)控作用[27]。這些關(guān)鍵抗黑穗病基因的鑒定增進(jìn)了人們對(duì)甘蔗抗病機(jī)制的理解, 有望推進(jìn)甘蔗抗黑穗病分子育種的進(jìn)程。但是, 迄今為止, 人們對(duì)甘蔗如何精準(zhǔn)防御黑穗病侵染的分子機(jī)制的了解還很有限, 有待進(jìn)一步深入。

新臺(tái)糖甘蔗系列品種是19世紀(jì)80年代從我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)引進(jìn)的優(yōu)良品種, 由于高產(chǎn)、高糖和適應(yīng)性好等特性, 它們迅速發(fā)展成為中國(guó)大陸地區(qū)的主栽品種, 高峰期種植面積超過(guò)90%, 成為我國(guó)最為重要的主栽品種, 強(qiáng)有力地支撐了中國(guó)大陸地區(qū)蔗糖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[28]。同時(shí), 由于其具有良好的育種特性, 新臺(tái)糖甘蔗系列品種也成為我國(guó)最為重要的甘蔗親本, 其后代如柳城05-136、柳城03-182、桂糖42、桂糖49、云蔗08-1609、云蔗05-51已成為我國(guó)主栽的當(dāng)家甘蔗品種。在我國(guó)甘蔗黑穗病愈發(fā)嚴(yán)重的背景下, 新臺(tái)糖親本與黑穗病菌互作機(jī)制具有重要的研究?jī)r(jià)值。鑒于此, 本研究選用新臺(tái)糖系列親本中最為知名的2個(gè)親本(ROC22和ROC25), 開(kāi)展其響應(yīng)黑穗病侵染的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。2個(gè)優(yōu)良親本屬于姊妹系, 都是臺(tái)糖69-463的子代[29-30], 遺傳背景較為相似[31], 但在抗黑穗病性上表現(xiàn)出明顯的差異, ROC22易感黑穗病[32], 而ROC25高抗黑穗病[33]。我們希望采用遺傳背景相似但抗性差異顯著的親本更有利于揭示新臺(tái)糖親本響應(yīng)黑穗病侵染的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ), 篩選可供開(kāi)發(fā)利用的抗病基因, 為后續(xù)更好地利用新臺(tái)糖親本培育高產(chǎn)高糖抗黑穗病品種提供重要的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用甘蔗親本材料ROC22和ROC25均由國(guó)家甘蔗種質(zhì)資源圃(云南開(kāi)遠(yuǎn))提供。人工接種鑒定試驗(yàn)所用黑穗病菌采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所科研第一基地、第二基地和第三基地種植的ROC22親本。采集的黑色鞭狀物于室溫自然風(fēng)干4～5 d后收集病鞭上冬孢子, 充分混勻后分裝于小濾紙袋中, 保存于4℃冰箱中備用。接種前先檢查取冬孢子活力,取微量混合冬孢子經(jīng)1%水瓊脂培養(yǎng)(含50μg mL–1氨芐青霉素) 12 h后鏡檢, 萌發(fā)率大于90%的冬孢子即為合格的接種菌。

1.2 黑穗病菌侵染

取ROC25和ROC22成熟期種莖, 切成單芽段后在室溫下流水沖洗24 h。單芽段在室溫下干燥后轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱(12 h光照-12 h黑暗循環(huán), 32℃, 80%濕度)中催芽。待萌動(dòng)芽長(zhǎng)度約2 cm時(shí)準(zhǔn)備接種黑穗病菌。選用合格的冬孢子配置成濃度為5×106孢子mL–1的黑穗病孢子懸浮液, 用無(wú)菌注射器吸取菌液注射入芽基部, 并以清水注射為對(duì)照組。處理后的種莖重新移到光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)蘇亞春[34]報(bào)道, 在人工針刺法接種黑穗病菌12 h、24 h、48 h和168 h的4個(gè)時(shí)間段, 在48 h以?xún)?nèi)的3個(gè)時(shí)段抗感材料蔗芽?jī)?nèi)部的黑穗病菌拷貝數(shù)量未有明顯差異, 但到168 h時(shí)達(dá)到十分顯著差異, 表明抗感材料響應(yīng)黑穗病菌侵染的最活躍時(shí)期應(yīng)在48 h以后。鑒于此, 本研究選擇黑穗病菌接種后5 d (120 h)、8 d (192 h)和11 d (264 h)作為取樣時(shí)間點(diǎn), 以芽頂端分生組織為取樣部位。每一個(gè)樣品由3個(gè)芽頂端分生組織混合組成, 并設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 加上清水處理共計(jì)36個(gè)樣品(表1)。樣品取完后立刻用液氮速凍后保存與–80℃冰箱。使用干冰運(yùn)輸至百邁克生物科技有限公司(中國(guó)青島)開(kāi)展三代和二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和質(zhì)量評(píng)估

由百邁克生物科技有限公司(中國(guó)青島)完成文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。二代轉(zhuǎn)錄組36個(gè)樣品, 使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行建庫(kù)和測(cè)序。三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組使用36個(gè)樣品的混樣來(lái)建庫(kù), 共使用1個(gè)cell, 使用PacBio儀器進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[35]。通過(guò)全長(zhǎng)序列識(shí)別、isoform水平聚類(lèi)得到一致序列和一致序列校正(polishing)最終得到非冗余轉(zhuǎn)錄本序列[36-37]?？紤]被侵染組織樣品中含有黑穗病菌, 將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)黑穗病菌基因組, 去除比對(duì)上的轉(zhuǎn)錄本[21], 利用BUSCO對(duì)最終獲得的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行完整性評(píng)估[38]。

1.4 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析

參考Liu等[39]采用BLAST version 2.2.26軟件對(duì)所有序列進(jìn)行兩兩比對(duì)來(lái)鑒定可變剪接事件。篩選500 bp以上的轉(zhuǎn)錄本, 利用MISA (MIcroSAtellite identification tool, http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)軟件做SSR分析。使用TransDecoder軟件(https:// github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases)從轉(zhuǎn)錄本序列中識(shí)別可靠的潛在編碼區(qū)序列(Coding Sequence, CDS)。應(yīng)用最廣泛的編碼潛能分析方法對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行l(wèi)ncRNA的預(yù)測(cè), 包括Coding Potential Calculator (CPC)分析[40]、Coding-Non-Coding Index (CNCI)分析、pfam蛋白結(jié)構(gòu)域分析和Coding Potential Assessment Tool (CPAT)分析[41]等。使用iTAK軟件對(duì)植物轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)、分類(lèi)并統(tǒng)計(jì)分析[42]。使用BLAST軟件將得到的非冗余轉(zhuǎn)錄本序列與NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG和eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 獲得轉(zhuǎn)錄本的注釋信息。

表1 黑穗病菌接種設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品采取

1.5 差異轉(zhuǎn)錄本篩選、GO富集分析和KEGG富集分析

使用三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本為參考, 利用STAR[43]將二代轉(zhuǎn)錄組獲得Clean Reads與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行序列比對(duì), 獲取轉(zhuǎn)錄本的位置信息。使用RSEM軟件[44]對(duì)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行定量。將黑穗病侵染樣品與同一時(shí)間點(diǎn)的清水處理樣品構(gòu)成一個(gè)差異基因分析組, 共形成6個(gè)對(duì)比組, 即感病親本ROC22獲得3個(gè)比較組(SS5d-vs-SW5d、SS8d-vs-SW8d、SS11d- vs-SW11d)和抗病親本ROC25獲得3個(gè)比較組(RS5d-vs-RW5d、RS8d-vs-RW8d、RS11d-vs-RW11d)。依據(jù)各對(duì)比組的FPKM值, 將Fold Change≥2且FDR < 0.05作為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn), 使用DEseq2[45]軟件進(jìn)行差異基因分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

取抗感親本黑穗病菌侵染和清水處理5 d、8 d和11 d的蔗芽生長(zhǎng)點(diǎn)部位組織, 通過(guò)液氮將樣品在研缽中充分研磨成粉后, 每份樣品取約100 mg粉末于1.5 mL離心管中進(jìn)行總RNA的提取。將提取的總RNA合成第1鏈cDNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng), 反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min; 95℃ 10 s, 57℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。從4個(gè)常用的內(nèi)參基因、、和[46]中篩選表達(dá)相對(duì)較為穩(wěn)定的基因作為最終內(nèi)參基因。隨機(jī)選擇15個(gè)轉(zhuǎn)錄本, 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)特異性引物, 所有基因引物序列信息表2。使用各時(shí)間點(diǎn)黑穗病侵染組與清水對(duì)照組轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量倍數(shù)FC (FPKM)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)量差異倍數(shù)FC (2–DDCt)開(kāi)展皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析, 檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)和熒光定量PCR數(shù)據(jù)的相關(guān)性。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列

(續(xù)表2)

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用PacBio平臺(tái)對(duì)抗黑穗病親本ROC25和感黑穗病親本ROC22在病菌侵染和清水的不同時(shí)段共計(jì)36個(gè)樣品的混樣進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 共獲得22.13 Gbp的clean data。使用Illumina seq對(duì)36個(gè)樣品開(kāi)展二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 共獲得211.53 Gbp的clean data, 各樣本的Q30均超過(guò)95%, 整體質(zhì)量較高。對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組獲得的clean data進(jìn)行環(huán)形一致性序列分析, 獲得288,335個(gè)CCS序列, 其中包含全長(zhǎng)非嵌合(FLNC, full length readsnon-chimeric)序列262,407條, 對(duì)FLNC序列一致性聚類(lèi)和Polish分析獲得高質(zhì)量一致性序列123,473條, 使用CD-HIT軟件去除冗余序列后得到82,801條轉(zhuǎn)錄本序列。除比對(duì)上黑穗病菌基因組的轉(zhuǎn)錄本, 最終獲得79,885條轉(zhuǎn)錄本, 轉(zhuǎn)錄本序列平均長(zhǎng)度為1990 bp (圖1-A)。利用BUSCO對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行完整性評(píng)估(圖1-B), 單拷貝、多拷貝及不完全覆蓋的基因占比達(dá)82.92%, 表明所獲得的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本具有較高的完整度。

圖1 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一致性序列度長(zhǎng)分布和完整度評(píng)估

A為全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的一致性序列的長(zhǎng)度分布, 左側(cè)Y坐標(biāo)軸對(duì)應(yīng)一致性序列長(zhǎng)度頻數(shù)分布直方圖, 右側(cè)Y坐標(biāo)軸對(duì)應(yīng)一致性序列長(zhǎng)度累積頻率曲線(xiàn)。B為全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的一致性序列的完整性評(píng)估結(jié)果。

A: the read length of consensus isoform, the left Y-axis corresponds to the frequency distribution histogram of consensus isoform read length, and the right Y-axis corresponds to the cumulative frequency curve of consensus isoform read length. B: the assessment of sequence annotation completeness.

2.2 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本可變剪接、編碼區(qū)、SSR位點(diǎn)、LncRNA和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

本研究共鑒定到3692個(gè)可變剪接事件, 分布在2871個(gè)基因中, 其中發(fā)生一次AS事件占總比78% (圖2-A); 鑒定到了1799個(gè)LncRNA (圖2-B), 其中529個(gè)LncRNA預(yù)測(cè)到靶基因; 共鑒定到29,139個(gè)SSR, SSR類(lèi)型大部分都是單核苷酸(P1)、2個(gè)核苷酸(P2)或3個(gè)核苷酸(P3)的重復(fù)(圖2-C)。編碼區(qū)預(yù)測(cè)共獲得80,363個(gè)ORF, 其中完整ORF (即同時(shí)預(yù)測(cè)到起始密碼子和終止密碼子)有60,115條, 完整ORF編碼蛋白序列長(zhǎng)度范圍為0～2500個(gè)氨基酸, 平均氨基酸長(zhǎng)度為341個(gè), 分布最多的范圍為100～200個(gè)(圖2- D)。在所有轉(zhuǎn)錄本中共預(yù)測(cè)到8002個(gè)轉(zhuǎn)錄因子, 分屬219個(gè)家族, 其中預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多的是RLK-Pelle_DLSV家族(406個(gè)), 其次為bHLH家族(269個(gè))、C2H2家族(193)、MYB-related家族(193)、C3H家族(180個(gè))、GRAS家族(175個(gè))和bZIP家族(174個(gè)) (圖2-E), 表明這些轉(zhuǎn)錄因子積極參與調(diào)節(jié)新臺(tái)糖親本生長(zhǎng)及抗病反應(yīng)過(guò)程。

2.3 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本功能注釋分析

對(duì)得到的非冗余轉(zhuǎn)錄本序列在NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG和eggNOG等八大主要基因或蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和注釋發(fā)現(xiàn), 共有74,066個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到注釋(表3), 占總數(shù)的92.72%, 其中在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)得到注釋的轉(zhuǎn)錄本最多, 達(dá)73,781個(gè), 占比達(dá)92.36%, 其次為eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)(70,639個(gè), 占比達(dá)88.43%)和GO數(shù)據(jù)庫(kù)(62,274個(gè), 占比達(dá)77.95%)。

從Nr注釋來(lái)看(圖3-A), 有55.51%的轉(zhuǎn)錄本注釋到甘蔗的近緣屬種高粱, 26.63%的轉(zhuǎn)錄本注釋到玉米, 僅有3.63%的轉(zhuǎn)錄本注釋到甘蔗雜交種, 源于甘蔗基因組數(shù)據(jù)極不豐富。從eggNOG注釋情況來(lái)看(表4), 50.81%的基因歸入功能未知基因, 其次為信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換, 分子伴侶相關(guān)基因, 占比分別為6.97%和6.87%。從GO注釋情況來(lái)看(圖3-C), 在細(xì)胞組分上注釋最多的GO條目是細(xì)胞和細(xì)胞器及其膜部分, 在生物過(guò)程注釋最多的GO條目是代謝過(guò)程、細(xì)胞進(jìn)程和單組織等過(guò)程, 在分子功能方面注釋最多的GO條目是催化活性和蛋白綁定, 表明這些GO功能在全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組占據(jù)主導(dǎo)。從KEGG注釋來(lái)看(圖3-B), 代謝途徑主要集中在全局和總覽圖、碳水化合物代謝、、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝通路, 遺傳信息過(guò)程主要集中在翻譯和折疊、分類(lèi)和降解通路, 環(huán)境信號(hào)過(guò)程主要集中在信號(hào)傳導(dǎo)途徑通路, 細(xì)胞過(guò)程主要集中在運(yùn)輸和分解代謝通路, 有機(jī)系統(tǒng)主要集中在環(huán)境適應(yīng)通路。

圖2 甘蔗全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本特征和結(jié)構(gòu)分析

A為基因的可變剪接事件發(fā)生次數(shù)分析; B為CPC、CNCI、pfam蛋白結(jié)構(gòu)域和CPAT等4種分析方法預(yù)測(cè)的LncRNA的韋恩分析; C為SSR類(lèi)型分布作圖, c為混合微衛(wèi)星(2個(gè)SSR距離小于100 bp), p1為單堿基, p2為雙堿基, p3為三堿基, p4為四堿基, p5為五堿基, p6為六堿基; D為預(yù)測(cè)的CDS編碼蛋白長(zhǎng)度分布圖; E為排名前20的轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)型。

A: the classification of AS cases; B: the overlap of long non-coding RNAs predicted by four different method; C: the classification of SSR types, c, p1, p2, p3, p4, p5, and p6 represent compound SSR, mono-nucleotide, di-nucleotide, tri-nucleotide, tetra-nucleotide, penta- nucleotide, and hexa-nucleotide, respectively. D: the length distribution of predicted protein; E: the top 20 types of predicted transcription factors.

表3 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本在不同數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋數(shù)量統(tǒng)計(jì)

圖3 甘蔗全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本注釋及分類(lèi)統(tǒng)計(jì)

A、B和C為Nr、KEGG和GO注釋分類(lèi)統(tǒng)計(jì)圖。

A, B, and C indicate Nr, KEGG, and GO characteristics of the obtained transcripts, respectively.

表4 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本eggNOG注釋分類(lèi)統(tǒng)計(jì)

A、B、C和D分別為ROC22清水處理生物學(xué)樣品、ROC22黑穗病侵染生物學(xué)樣品、ROC25清水處理生物學(xué)樣品和ROC25黑穗病侵染生物學(xué)樣品的相關(guān)性系數(shù); E和F分別為18個(gè)ROC22樣品和18個(gè)ROC25樣品的PCA分析圖。

A, B, C, and D indicate the correlation coefficient of test samples from ROC22 inoculated with water, ROC22 inoculated with, ROC25 inoculated with water, and ROC25 inoculated with, respectively. E and F indicate PCA diagram of ROC22 and ROC25 samples, respectively.

2.4 差異基因篩選

對(duì)所有36個(gè)二代轉(zhuǎn)錄組樣品開(kāi)展皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn), 各基因型在接種黑穗病菌或清水條件下的生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性系數(shù)都大于0.90 (圖4-A～D), 表明各條件組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)樣品之間相關(guān)程度很高, 重復(fù)結(jié)果可靠。對(duì)各基因型樣品的二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)發(fā)現(xiàn), 抗感親本同一時(shí)間點(diǎn)清水處理和黑穗病侵染樣品表達(dá)量在PCA圖上呈現(xiàn)不同的空間分布, 表明二者表達(dá)量存在差異, 適合開(kāi)展差異基因分析。

相比較清水處理, 感黑穗病親本ROC22接種黑穗病菌后5 d、8 d和11 d時(shí)分別篩選到1829、139和101時(shí)篩選到1829個(gè)差異表達(dá)基因, 數(shù)量上呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì); 抗黑穗病親本ROC25侵染5 d、8 d和11 d時(shí)分別篩選到927、4240和5824個(gè)差異表達(dá)基因, 數(shù)量上呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。整體來(lái)看, 侵染5 d時(shí), 感病親本相比較抗性親本獲得更多的差異表達(dá)基因, 對(duì)侵染的響應(yīng)表現(xiàn)的更為活躍, 但隨著侵染時(shí)間的延續(xù), 感病親本響應(yīng)活躍度出現(xiàn)大幅下降, 而抗病親本響應(yīng)活躍度呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)的趨勢(shì), 表現(xiàn)出有更多的基因參與響應(yīng); 從上下調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)來(lái)看, 無(wú)論是抗病還是感病親本, 都呈現(xiàn)出侵染后上調(diào)基因多于下調(diào)基因, 尤其侵染的第一第二階段, 表明上調(diào)表達(dá)基因在侵染的早中期扮演著十分重要的角色。抗感親本黑穗病侵染后獲得的總差異表達(dá)基因進(jìn)行維恩圖分析(圖5-B～D)發(fā)現(xiàn), 抗感親本共有1010個(gè)差異表達(dá)基因, 其中810個(gè)上調(diào)表達(dá), 30個(gè)下調(diào)表達(dá), 170個(gè)上/下調(diào)趨勢(shì)不同; 感病親本特有1023個(gè)差異表達(dá)基因, 包括994個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和199個(gè)下調(diào)表達(dá)基因; 抗病親本特有8706個(gè)差異表達(dá)基因, 其中5359個(gè)上調(diào)表達(dá), 3517個(gè)下調(diào)表達(dá)。

圖5 ROC22和ROC25不同侵染階段差異基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)和兩親本間差異基因韋恩分析

A為ROC22和ROC25感染黑穗病后5 d、8 d和11 d差異基因數(shù)量; B為不同侵染階段2個(gè)親本差異基因維恩圖。

A: the differentially expressed transcripts (DETs) in ROC22 and ROC25 at different days afterinfection; B: the overlap of DEGs between ROC22 and ROC25.

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

隨機(jī)選取15個(gè)轉(zhuǎn)錄本通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析, 并將各時(shí)間點(diǎn)每個(gè)接種黑穗病菌的甘蔗親本與同時(shí)間點(diǎn)清水對(duì)照組的表達(dá)量倍數(shù)(FC(2-DDCt)和FC(FPKM))進(jìn)行相關(guān)性分析。15個(gè)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR和轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量變化情況如圖6所示, 定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果大體趨勢(shì)相似, 但部分組間的基因表達(dá)趨勢(shì)存在一定差異, 可能原因是檢驗(yàn)的基因表達(dá)水平較低或者基因序列特征復(fù)雜。將RNA-seq和qPCR的表達(dá)水平差異倍數(shù)取對(duì)數(shù)后進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析(附圖1), 結(jié)果顯示兩者相關(guān)系數(shù)為0.6941 (<0.05), 表明測(cè)序結(jié)果與qPCR結(jié)果相關(guān)性較好, 測(cè)序結(jié)果較為可靠。

2.6 差異表達(dá)基因GO分類(lèi)和富集分析

感病親本中2033個(gè)差異表達(dá)基因被顯著富集到205個(gè)GO條目, 包括105個(gè)細(xì)胞過(guò)程條目、90個(gè)分子功能條目和10個(gè)細(xì)胞組分條目; 富集程度排名前20的條目中細(xì)胞過(guò)程富集因子最大的是防御反應(yīng)(GO:0006952)、蛋白磷酸化(GO:0006468)和羥脂蛋白代謝過(guò)程(GO:0031407), 分子功能富集因子最大的是蛋白激酶活性(GO:0004672)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(GO:0004674)和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0016773); 細(xì)胞組分富集因子最大的是膜(GO:0016020)、細(xì)胞外周(GO:0071944)和膜內(nèi)在成分(GO:0031224) (圖7-A)。

(圖6)

對(duì)15個(gè)轉(zhuǎn)錄本(表2)比較各個(gè)接種病菌組與清水對(duì)照組的的RNA-seq的FPKM值和實(shí)時(shí)熒光定量PCR中2–ΔΔCt值的差異倍數(shù)。

15 transcripts were used in this validation referring to Table 2. Fold changes of each RNA-seq expression data (FPKM value) and quantitative real-time PCR (2–ΔΔCt) betweeninoculation group and water inoculation group were compared.

抗病親本9716個(gè)差異表達(dá)基因共富集到1083個(gè)GO條目, 其中細(xì)胞過(guò)程878個(gè)條目, 細(xì)胞組分73個(gè)條目, 分子功能203個(gè)條目; 富集程度排名前20的條目中細(xì)胞過(guò)程富集因子最大的是核小體裝配(GO:0006334)、染色質(zhì)組裝(GO:0031497)和DNA包裝(GO:0006323); 分子功能富集因子最大的是蛋白質(zhì)異二聚活性(GO:0046982)、四吡咯結(jié)合(GO:0046906)和轉(zhuǎn)錄因子活性(GO:0003700)等; 細(xì)胞組分富集因子最大的是核小體(GO:0000788)、DNA包裝復(fù)合物(GO:0044815)和蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物(GO:0032993)等(圖7-B)。

對(duì)獲得的富集GO條目開(kāi)展維恩圖分析(圖7-C～ E), 在生物過(guò)程, 抗病親本有151個(gè)特有富集條目, 感病親本有38個(gè)特有富集條目, 抗感親本共有差異表達(dá)基因共有52個(gè)特有富集條目; 在細(xì)胞組分中, 抗病親本有63個(gè)特有富集條目, 感病親本無(wú)特有富集條目, 抗感親本共有差異表達(dá)基因共有10個(gè)特有富集條目; 在分子功能中, 抗病親本有534個(gè)特有富集條目, 感病親本有37個(gè)特有富集條目, 抗感親本共有差異表達(dá)基因共有68個(gè)特有富集條目。

A和B分別為 ROC22差異基因和ROC25差異基因富集程度排名前20的GO條目。C、D和E為抗感親本中差異基因富集的生物過(guò)程(MP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)條目比較分析。

A and B indicate TOP20 GO enrichment terms of differentially expressed transcripts in ROC22 and ROC25, respectively. C, D, and E indicate comparison of biological processes (MP), cellular components (CC), and molecular functions (MF) in different varieties, respectively.

2.7 差異表達(dá)基因KEGG分類(lèi)和富集分析

感病親本中2033個(gè)差異表達(dá)基因被顯著富集到17個(gè)KEGG通路, 其中次級(jí)代謝物生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)、亞油酸代謝(Linoleic acid metabolism)、苯丙素生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、植物-病原互作(Plant-pathogen interaction)和植物MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway-plant)的顯著性水平最高(圖8-A)?？共∮H本9716個(gè)特有差異表達(dá)基因經(jīng)被顯著富集到27個(gè)KEGG通路, 其中植物MAPK信號(hào)通路、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)、苯丙素生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、植物-病原互作和亞油酸代謝的顯著性水平最高(圖8-B)。

將抗感親本中差異基因富集的KEGG通路進(jìn)行維恩圖分析(圖8-C)發(fā)現(xiàn), 12個(gè)通路屬于兩者共有, 包括植物MAPK信號(hào)通路、苯丙素生物合成、植物-病原互作、亞油酸代謝、淀粉和蔗糖代謝等。感病親本特有5個(gè)KEGG通路, 分別為丙烷、哌啶和吡啶類(lèi)生物堿的生物合成(Tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis)、黃酮類(lèi)生物合成(Flavonoid biosynthesis)、玉米素生物合成(Zeatin biosynthesis)、葉酸生物合成(Folate biosynthesis)和囊泡運(yùn)輸中SNARE相互作用(SNARE interactions in vesicular transport)?？共∮H本特有15個(gè)KEGG通路, 它們主要是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用、DNA復(fù)制(DNA replication)、類(lèi)胡蘿卜素生物合成(Carotenoid biosynthesis)和光合作用生物碳固定(Carbon fixation in photosynthetic organisms)等。

圖8 ROC22和ROC25感染黑穗病菌后差異基因KEGG富集分析

A和B分別為ROC22和ROC25差異基因富集程度排名前20的KEGG通路。C為不同親本的差異基因富集的KEGG通路比較分析。

A and B indicate TOP20 KEGG enrichment terms of differentially expressed transcripts in ROC22 and ROC25, respectively. C indicates comparison of KEGG pathways in different varieties.

2.8 植物MAPK信號(hào)通路在抗病反應(yīng)中響應(yīng)

前人研究表明植物-病原互作、植物MAPK信號(hào)通路、亞油酸代謝、苯丙素生物合成、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和淀粉和蔗糖代謝等在甘蔗抵御黑穗病菌侵染過(guò)程中起重要作用[16,19-20], 這些抗病通路均在抗感親本中被顯著富集, 表明它們是新臺(tái)糖親本對(duì)黑穗病菌的基礎(chǔ)防御反應(yīng)。植物MAPK信號(hào)通路在植物抗病過(guò)程中起中心作用, 它不僅介導(dǎo)病原相關(guān)分子模式和病原菌的效應(yīng)因子而觸發(fā)植物免疫, 還參與了植物激素(如JA、乙烯和ABA)信號(hào)通路和活性氧調(diào)節(jié)的植物防御反應(yīng)[47-48]。在本研究中, 植物MAPK信號(hào)通路在抗感親本中都得到顯著富集, 尤其在ROC25中富集程度最高, 意味著植物MAPK信號(hào)通路在新臺(tái)糖親本與黑穗病的互作中扮演著重要的角色, 但目前植物MAPK信號(hào)通路在響應(yīng)黑穗病侵染中的作用機(jī)制尚不清楚, 為此, 本研究中對(duì)植物MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵MAPK超家族基因在抗感親本中的表達(dá)差異進(jìn)行了分析。結(jié)果表明, MAPK超家族基因中(8個(gè)轉(zhuǎn)錄本)、(2個(gè)轉(zhuǎn)錄本)、(5個(gè)轉(zhuǎn)錄本)、(6個(gè)轉(zhuǎn)錄本)、(1個(gè)轉(zhuǎn)錄本)和(7個(gè)轉(zhuǎn)錄本)共6個(gè)基因的29個(gè)轉(zhuǎn)錄本在抗感親本黑穗病菌侵染后表達(dá)發(fā)生變化。由表5可知, 其中僅3個(gè)基因(,和)的6個(gè)轉(zhuǎn)錄本在ROC22中有顯著差異表達(dá),而29個(gè)轉(zhuǎn)錄本均在ROC25中表達(dá)發(fā)生明顯變化。在感病親本ROC22中,、和在感染黑穗病后5 d時(shí)表達(dá)均發(fā)生上調(diào), 在8 d和11 d時(shí)則沒(méi)有顯著表達(dá)差異。在抗病親本ROC25中,、、、、和共6個(gè)基因在感染黑穗病菌后8 d時(shí)表達(dá)水平均顯著提高, 而在11 d時(shí)僅和兩個(gè)基因的6個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)發(fā)生下降?？偟膩?lái)說(shuō), MAPK超家族基因在甘蔗感染黑穗病后的主要表達(dá)方式為上調(diào), 但不同親本和不同侵染時(shí)段的表達(dá)特征不一致, 在抗病親本中響應(yīng)的MAPK超家族基因明顯多于感病親本, 參與響應(yīng)的的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目在抗感親本表達(dá)較接近, 而、和僅在ROC25中表達(dá)發(fā)生變化。

2.9 抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在抗病反應(yīng)中響應(yīng)

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)是控制基因表達(dá)的重要調(diào)控因子, 在植物發(fā)育、細(xì)胞周期、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫反應(yīng)等過(guò)程發(fā)揮重要作用。本研究分析了主要的抗病相關(guān)TF家族基因(如、、和等)在抗感親本感染黑穗病菌后的表達(dá)規(guī)律, 以了解甘蔗對(duì)黑穗病菌脅迫的調(diào)控機(jī)制。由表6可知, 接種黑穗病菌后, 感病親本ROC22有7個(gè)、4個(gè)、12個(gè)和15個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生變化, 其中差異表達(dá)基因比例(差異基因數(shù)目/總檢測(cè)基因數(shù)目)較高的是和家族; 而抗病親本ROC25則有23個(gè)、13個(gè)、16個(gè)和20個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生變化, 其中和家族的差異表達(dá)基因比例較高。抗感親本中共同差異基因較多的是和家族, 而不同差異基因較多的是和家族。從基因表達(dá)模式上看, 除抗病親本中家族的上/下調(diào)基因比例接近外, 大部分轉(zhuǎn)錄因子在兩親本中呈上調(diào)表達(dá)。從時(shí)間上看, 感病親本在接種黑穗病菌5 d時(shí)擁有最多的差異表達(dá)基因, 而抗病親本在8 d和11 d時(shí)擁有更多的差異表達(dá)基因。綜上, ROC22和ROC25親本中眾多WRKY、MYB、NAC和AP2/ERF-ERF等抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)了黑穗病菌脅迫, 但轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)型、數(shù)目以及時(shí)間表達(dá)特征在抗感親本間存在明顯差異, 這些分子表達(dá)差異可能影響親本的生理、生化變化, 最終形成不同的抗性表型。

表5 ROC22 and ROC25感染黑穗病菌后差異表達(dá)的MAPK超級(jí)家族基因

(續(xù)表5)

FC表示差異倍數(shù)。采用費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)判斷顯著性水平,*和**分別表示錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)的值小于0.05和0.01。

FC: fold changes. Significantly difference was determined by Fisher’s exact test.*and**represent that the false discovery rate (FDR)-value is less than 0.05 and 0.01, respectively.

表6 ROC22 and ROC25感染黑穗病菌后抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子分析

3 討論

新臺(tái)糖親本是目前甘蔗雜交育種重要的親本, 已培育出我國(guó)新一代當(dāng)家良種, 對(duì)其基因資源開(kāi)展深入挖掘?qū)τ诟咝Ю迷擃?lèi)親本具有重要意義。與二代測(cè)序相比, 三代測(cè)序的cDNA讀長(zhǎng)更長(zhǎng), 獲得的長(zhǎng)RNA序列更為準(zhǔn)確, 因而更利于分析基因結(jié)構(gòu)、可變剪切分析、LncRNA鑒定、融合基因分析等[29,49-50]。為了摸清該類(lèi)親本中的抗黑穗病基因資源, 本研究利用三代PacBio平臺(tái)的長(zhǎng)讀長(zhǎng)特點(diǎn), 構(gòu)建了我國(guó)重要甘蔗親本ROC22和ROC25響應(yīng)黑穗病侵染的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù), 獲得了79,885條轉(zhuǎn)錄本序列。在甘蔗與黑穗病菌互作后轉(zhuǎn)錄本分析中, 共鑒定到3692個(gè)可變剪接事件、1799個(gè)LncRNA和8002個(gè)轉(zhuǎn)錄因子, 這為后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析提供較好的遺傳信息。進(jìn)一步, 本研究結(jié)合二代Ilumina平臺(tái)產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)樣本的短片段轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 對(duì)三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組鑒定到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析, 使得定量更為準(zhǔn)確, 突破了以往以基因?yàn)檠芯繂卧霓D(zhuǎn)錄組分析模式, 以更為接近生物學(xué)過(guò)程的轉(zhuǎn)錄本為研究單元對(duì)甘蔗與黑穗病互作過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)研究。

近年來(lái), 利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了一系列響應(yīng)黑穗病菌侵染的差異基因和蛋白, 并揭示了甘蔗防御黑穗病菌侵染的重要代謝通路[16,20,51-52]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示發(fā)現(xiàn)不同侵染階段抗病親本ROC25和感病親本ROC22中篩選獲得的差異基因數(shù)量和時(shí)間變化趨勢(shì)明顯不同。在感病親本中, 侵染5 d時(shí)獲得差異表達(dá)基因較多, 而抗病親本在侵染8 d和11 d獲得的的差異基因數(shù)目較多, 表明2個(gè)親本對(duì)黑穗病菌脅迫積極響應(yīng)時(shí)間不一致, 抗病親本響應(yīng)最激烈時(shí)段出現(xiàn)較晚, 持續(xù)反應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)。2個(gè)不同抗病親本中基因響應(yīng)模式差異可能與黑穗病菌定植過(guò)程有關(guān), 這可能是由于抗病親本阻礙黑穗病菌定植過(guò)程, 黑穗病菌進(jìn)入抗病親本莖尖分生組織的時(shí)間通常要晚于感病親本[53-54]。另一方面, 在易感甘蔗中, 低效的防御過(guò)程和較弱的響應(yīng)信號(hào)使黑穗病菌傳播并損害植物[16,51], 在本研究中, 感病親本中總體差異基因數(shù)目要低于抗病親本, 這也反映抗病親本對(duì)黑穗病侵染具有更積極和更長(zhǎng)期的防御反應(yīng)。通過(guò)對(duì)差異基因的GO和KEGG富集, 抗病親本中差異表達(dá)基因共富集到的GO條目和KEGG通路均要多于感病親本, 進(jìn)一步佐證了抗病親本中更多的生命過(guò)程和代謝途徑積極參與對(duì)黑穗病的響應(yīng)過(guò)程。以上結(jié)果與前人研究結(jié)果[16,20,51-52]基本一致, 表明苯丙素途徑、次生代謝物生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原體相互作用等與抗性相關(guān)的代謝途徑等重要代謝通路在新臺(tái)糖親本防御黑穗病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn), 抗病親本感染黑穗病菌后DNA復(fù)制、嘧啶代謝和卟啉代謝等DNA復(fù)制、修復(fù)相關(guān)的代謝途徑通路受到顯著影響, 表明這些生物學(xué)過(guò)程也參與調(diào)控甘蔗抗黑穗病反應(yīng)。此外, 類(lèi)胡蘿卜素生物合成在抗病親本中顯著富集, 由于類(lèi)胡蘿卜素具有顯著的抗氧化功能, 可減少細(xì)胞遺傳物質(zhì)和細(xì)胞膜的氧化損傷[55], 因而該通路激活可能有利于減少黑穗病菌引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng), 進(jìn)而提高甘蔗的免疫水平。

MAPK作為植物信號(hào)感受組分參與調(diào)控多種生命過(guò)程, MAPK信號(hào)途徑通常依次激活3個(gè)相互連接的蛋白激酶MAPKKK-MAPKK-MAPK, 將信號(hào)依次級(jí)聯(lián)放大并傳遞至細(xì)胞及核內(nèi)[56]。它在植物中調(diào)控氣孔、側(cè)枝等的形成和生長(zhǎng)發(fā)育, 參與細(xì)胞分裂, 應(yīng)對(duì)各種生物和非生物脅迫及參與植物激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)等均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[48,57]。在擬南芥中, 至少有2個(gè)完整的MAPK級(jí)聯(lián), 即MEKK1- MKK1/MKK2-MPK4和MAPKKK3/MAPKKK5-MKK4/ MKK5-MPK3/MPK6級(jí)聯(lián), 并被報(bào)道參與了免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。在單子葉植物水稻中,、、、、、、、和均被稻瘟病菌侵染誘導(dǎo), 且其中有４個(gè)與寄主細(xì)胞死亡相關(guān), ８?jìng)€(gè)在防衛(wèi)信號(hào)分子(如jasmonic acid, salicylic acid和ethylene)應(yīng)答中出現(xiàn)差異性表達(dá)[58-64], 積極參與了水稻對(duì)病原菌的免疫反應(yīng)。目前MAPK信號(hào)通路在甘蔗抵御黑穗病中作用研究報(bào)道較少。Wu等[65]通過(guò)Solexa測(cè)序鑒定了MAPK信號(hào)通路的3個(gè)基因、和在甘蔗感染黑穗病后表達(dá)發(fā)生上調(diào), 其中在抗病品種Yacheng 05-179接種72 h后在表達(dá)顯著上調(diào), 而在易感的柳成03-182中的表達(dá)則不顯著上調(diào), 表明在甘蔗抵御黑穗病中起重要作用。本研究中, ROC22和ROC25在黑穗病菌侵染后中MAPK信號(hào)通路都被顯著富集, 但在抗病親本中具有更多差異表達(dá)的和的轉(zhuǎn)錄本, 且、和的表達(dá)水平僅在抗病親本中發(fā)生變化, 暗示MAPK信號(hào)通路中差異響應(yīng)基因與親本抗病表型關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步分析差異表達(dá)的家族基因在正常條件下的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)抗病品種(F01_tran- script_6996)在清水處理8 d時(shí)的表達(dá)水平是其在感病品種表達(dá)量的2.91倍(log2FC = 1.544,<0.01), 表明正常條件下抗病親本具有較高的F01_transcript_6996表達(dá)水平, 且接種病菌后抗感病品種間F01_tran-script_6996的表達(dá)差異進(jìn)一步增大, 我們推測(cè)高水平的(F01_transcript_6996)可能有利于甘蔗抵御黑穗病。最新研究發(fā)現(xiàn), 水稻可通過(guò)增強(qiáng)EREBP1轉(zhuǎn)錄因子活性, 調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平, 從而提高植物的抗病水平[66-67];還可以通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子來(lái)介導(dǎo)SA和JA誘導(dǎo)的防御反應(yīng)[68-69]。本研究也發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子(F01_ transcript_24011, F01_transcript_40700, F01_transcript_ 94848, F01_transcript_119859)的表達(dá)也發(fā)生上調(diào), 此外SA信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子(F01_transcript_ 35008, F01_transcript_37230, F01_transcript_43260, F01_transcript_47871, F01_transcript_94228, F01_ transcript_124105)和JA信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子(F01_transcript_3739, F01_transcript_4150, F01_ transcript_70898, F01_transcript_92492和F01_ transcript_98235)的表達(dá)也發(fā)生了變化, 因而也可能介導(dǎo)了植物激素SA和JA誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。我們可以合理推測(cè),家族基因在抗病親本感染黑穗病菌后的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用, 進(jìn)一步的研究可以聚焦家族基因在甘蔗與黑穗病菌互作過(guò)程中的作用機(jī)制, 這將有助于解析甘蔗抗黑穗病的分子機(jī)制, 并為有效防治甘蔗黑穗病以及培育優(yōu)良抗黑穗病品種提供理論依據(jù)。

WRKY、MYB、NAC和AP2/ERF-ERF是植物中主要的、功能多樣化的轉(zhuǎn)錄因子家族, 在植物響應(yīng)生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用[70]。在植物對(duì)病原體的免疫反應(yīng)中, WRKY參與了病原相關(guān)分子模式觸發(fā)免疫(pattern-triggered immunity, PTI)、效應(yīng)子觸發(fā)免疫(effector-triggered immunity, ETI)和系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)等過(guò)程[71], NAC轉(zhuǎn)錄因子則影響了植物的ETI和超敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR)[72]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)JA、SA或ET介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)積極調(diào)控植物的抗病性[73], 過(guò)表達(dá)[74]、[75]、[76]和[77]等均明顯增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性水平。MYB轉(zhuǎn)錄因子也參與植物與病原菌互作過(guò)程, 它可以通過(guò)調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御基因表達(dá)等途徑提高或降低植物對(duì)病原菌的抗性水平[78-81]。據(jù)Plant Transcription Factor Database統(tǒng)計(jì), 甘蔗中共有73個(gè)、36個(gè)、44個(gè)和39個(gè)家族基因[82]。Que等[16]研究發(fā)現(xiàn)25個(gè)、18個(gè)和18個(gè)基因在甘蔗感染黑穗病菌后發(fā)生表達(dá)變化, 可能對(duì)甘蔗防御黑穗病菌起積極作用。最近, Agisha等[83]研究也揭示、、和等轉(zhuǎn)錄因子也參與了甘蔗與黑穗病菌互作過(guò)程。本研究通過(guò)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得7794個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(占全部轉(zhuǎn)錄子的9.76%), 其中檢測(cè)出、、和的基因數(shù)目分別占數(shù)據(jù)庫(kù)各基因家族的94.9%、66.7%、56.8%和46.6% (表6)?？垢杏H本中,和家族基因均積極響應(yīng)了黑穗病菌脅迫, 暗示PTI、ETI、SAR和HR等免疫途徑在抗感親本均被激活, 以便于增強(qiáng)甘蔗對(duì)黑穗病菌的抗性。雖然響應(yīng)的和基因種類(lèi)在抗感品種間相似, 但基因表達(dá)水平差異也可能對(duì)親本的抗性產(chǎn)生不同影響。例如,被認(rèn)為與甘蔗抗黑穗病有關(guān), 該基因在抗黑穗病品種中表達(dá)穩(wěn)定, 而在感黑穗病品種中則表達(dá)下調(diào)[84]。在本研究中, 感染黑穗病菌5～8 d時(shí),(F01_transcript_118129, 與的蛋白一致性達(dá)到99.5%)的表達(dá)水平在抗感親本中均發(fā)生下降, 但相同條件下抗病親本中的表達(dá)水平要高于感病品種, 因而推測(cè)高表達(dá)水平的有利于增加甘蔗對(duì)黑穗病菌的抗性。另一個(gè)可能調(diào)控甘蔗抗黑穗病的基因[23]在本研究中未被檢測(cè), 這可能由于樣品類(lèi)型及侵染時(shí)間不同。值得注意的是, 接種黑穗病菌后, 抗病親本中激活或抑制的和的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量明顯多于感病親本, 暗示和家族基因在抗病親本中發(fā)揮了更積極的調(diào)控作用。研究表明, ERF轉(zhuǎn)錄因子是ET和JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)因子, 抗病品種中甘蔗ERF1 (gi35045219)的表達(dá)受黑穗病菌誘導(dǎo), 而在感病品種中其表達(dá)無(wú)差異[21]。本研究也發(fā)現(xiàn)(F01_transcript_116729) 在抗病親本接種黑穗病菌5 d和8 d時(shí), 表達(dá)水平分別上升了2.31倍和1.80倍, 而在感病親本中表達(dá)水平無(wú)顯著差異, 這與前人研究相近。除外,、、、、、、、、、、、和等多個(gè)家族基因僅在抗病親本中發(fā)生變化, 也可能對(duì)親本的抗黑穗病能力起積極作用。此外,、、、、、、、和等家族基因僅在抗病親本中顯示表達(dá)變化, 而轉(zhuǎn)錄因子則在感病親本中出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄差異, 它們也可能參與到甘蔗防御黑穗病菌過(guò)程。總的來(lái)說(shuō), 與感病親本相比, 接種黑穗病菌后抗病品種顯示出更多的抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化, 暗示了抗病親本擁有更強(qiáng)的防御反應(yīng), 這些轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控了多種生物學(xué)過(guò)程, 最終提高了甘蔗抗黑穗病水平。

4 結(jié)論

本研究以黑穗病菌侵染后新臺(tái)糖親本ROC22和ROC25為材料, 構(gòu)建了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù), 獲得高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本79,885條, 并對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了可變剪切分析、LncRNA鑒定、轉(zhuǎn)錄因子分析等, 從而完善了新臺(tái)糖親本基因組的注釋信息。同時(shí), 本研究結(jié)合Ilumina平臺(tái)產(chǎn)生的二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 對(duì)三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組鑒定到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了定量分析, 獲得差異轉(zhuǎn)錄本并進(jìn)行GO和KEGG富集分析, 獲得了不同抗病親本響應(yīng)黑穗病菌的生物過(guò)程特征。進(jìn)一步, 研究還揭示了植物MAPK信號(hào)通路、、、和等抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在甘蔗抵御黑穗病菌過(guò)程中發(fā)揮重要作用, 這為深入解析甘蔗抗黑穗病的分子機(jī)制奠定了新基礎(chǔ)。

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附圖1 RNA-Seq和qRT-PCR相關(guān)性

Fig. S1 Correlations between RNA-Seq and qRT-PCR

Comparative transcriptome analysis of elite ‘ROC’ sugarcane parents for exploring genes involved ininfection by using Illumina- and SMRT-based RNA-seq

HU Xin, LUO Zheng-Ying, LI Chun-Jia, WU Zhuan-Di, LI Xu-Juan, and LIU Xin-Long*

Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement / Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs (Yunnan), Kaiyuan 661699, Yunnan, China

Sugarcane smut, caused by the fungus, is the most challenging disease of sugarcane, causing significant losses in cane yield. There is a dearth of information on smut resistance mechanism in elite parents for the development of smut-resistant varieties. In the present study, we adopted joint Illumina- and Single Molecule Real-Time (SMRT)-based RNA-seq analysis to identify transcript expression in an smut-resistant and -susceptible parents (ROC25 and ROC22) infected with. A total of 79,885 high-quality transcripts was obtained, including 60,115 open reading frames, 3692 alternate splicing isoforms, 1799 long non-coding RNAs, 29,139 simple sequence repeats, and 7794 transcription factors. About 92.72% of the total transcripts were annotated, which should have increased the available data amount for transcriptome profile analysis. There were 2033 and 9716 differentially expressed transcripts (DETs) in ROC22 and ROC25, respectively. The analyses of GO and KEGGenrichment showed that more GO terms and KEGG pathways were observedin ROC25 than ROC22. It was found that MAPK signalling pathway-plant,phenylpropanoid biosynthesis, plant-pathogen interaction,linoleic acid metabolism, and starch and sucrose metabolism were enriched both in resistant and susceptible parents. In addition, MAPK superfamily genes were differentially regulated in different parents, more DETs ofandwere detected in resistant parent, and the relative expression levels of,,andgenes were specifically altered in resistant parent. It suggested that MAPK superfamily genes might play the important roles in the regulation of sugarcane response toinfection. Moreover, lots of transcription factors (TFs) associated with plant disease resistance were found to respond toinfection in both ROC22 and ROC25 parents, including WRKY, MYB, NAC, and AP2/ERF-ERF. Majority of the TFs were up-regulated. Compared to the susceptible ROC22 parent, the numberof activated transcription factors in the resistant ROC25 parent was higher, indicating that these extra TFs might have positive effects in the defense against. This study provides a comprehensive set of reference transcripts for sugarcane and thus increases our understanding on the interactions between sugarcane and,which should be helpful inguiding on exploitation and utilization of smut-resistance gene resources.

sugarcane;; full-length transcriptomes; RNA-seq; ROC

2022-10-12;

2023-02-21;

2023-03-10.

10.3724/SP.J.1006.2023.24228

通信作者(Corresponding author):劉新龍, E-mail: lxlgood868@163.com

E-mail: sugarhuxin@163.com

本研究由云南基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2019FA016), 云南基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(202201AU070200)和云南省種子種業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(202205AR070001-09)資助。

This study was supported by the Yunnan Fundamental Research Projects (2019FA016), the Yunnan Fundamental Research Projects (202201AU070200), and the Yunnan Seeds and Seed Industry Joint Laboratory Project (202205AR070001-09).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230309.1742.008.html

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