川芎嗪對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及糖酵解的調(diào)控作用

王韓英,陳 勇,朱雙媚

王韓英,陳勇,朱雙媚,麗水市人民醫(yī)院腫瘤放化療科 浙江省麗水市 323000

王韓英,主治醫(yī)師,主要從事腫瘤方面的基礎(chǔ)與臨床研究.

0 引言

據(jù)國家癌癥中心2022年發(fā)布的全國癌癥統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示,胃癌作為常見的消化系統(tǒng)腫瘤,其發(fā)病例數(shù)和死亡率均位居第三[1].臨床上胃癌早期篩出率較低,常見為中晚期胃癌患者,手術(shù)及放化療效果有限[2,3],尋找高效的抗腫瘤藥物及靶點依舊是臨床胃癌輔助治療的重點研究領(lǐng)域.2000年和2011年Weinberg及其研究伙伴[4,5]總結(jié)了包括能量代謝異常、持續(xù)的增殖信號、逃避生長抑制以及侵襲轉(zhuǎn)移等在內(nèi)的腫瘤十大特征.能量代謝在腫瘤細(xì)胞的惡性增殖過程中具有重要的作用,研究顯示,胃癌細(xì)胞的糖酵解代謝十分活躍,符合Warburg效應(yīng)的代謝特征[3,6].抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解代謝對抑制腫瘤的生長具有重要的意義,也為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新的方向和思路.中醫(yī)藥在腫瘤的治療上具有獨特的優(yōu)勢,川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是中藥川芎的主要活性成分,目前常用于輔助治療心腦血管疾病.但現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,TMP具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多效作用,且對機體多個系統(tǒng)均具有調(diào)節(jié)效應(yīng),臨床應(yīng)用前景廣闊[7-9].本研究以胃癌細(xì)胞株為對象,評估TMP對其增殖、遷移的影響,并從葡萄糖代謝的角度初步探討其可能的作用機制,為TMP的臨床應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料 細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司;川芎嗪(TMP,純度＞98%)購自上海源葉生物科技有限公司;胃癌細(xì)胞株AGS和SGC7901購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心;蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、p-AKT和β-actin抗體購自美國Cell Signaling公司;葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transporter-1,GLUT1)、己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)及乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)抗體購自美國Abcam公司;CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海莼試生物技術(shù)有限公司;葡萄糖(glucose,GLU)、乳酸(lactic acid,LD)、己糖激酶(hexokinase,HK)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及CCK-8細(xì)胞活力測定: 胃癌細(xì)胞株AGS和SGC7901生長于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件: 5%二氧化碳、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱,定期更換培養(yǎng)基并傳代,維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài).將消化后的AGS和SGC7901細(xì)胞(5000個/孔)分別接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中,同步化處理后加TMP濃度梯度設(shè)置: (0、5、10、20、40、80) μM分別干預(yù)24 h、48 h、72 h.每孔中加入10 μL的CCK-8試劑,孵育2 h后經(jīng)酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度值(OD).每組均設(shè)置三個復(fù)孔,結(jié)果取其均值,同時設(shè)不加細(xì)胞的單孔作為空白對照;繪制細(xì)胞生長曲線.實驗重復(fù)3次(n=3).

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測: 采用細(xì)胞克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖情況.將生長良好的細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中,貼壁同步化后,依據(jù)實驗分組加藥干預(yù)至實驗預(yù)定的時間.吸棄培養(yǎng)基,加4%多聚甲醛固定后,結(jié)晶紫染色并于顯微鏡下拍照計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù),計算細(xì)胞克隆形成率.細(xì)胞分組設(shè)置: 對照組(control,Ctrl)、低劑量TMP組(TMP-L,培養(yǎng)基中TMP濃度為10 μM)、中劑量TMP組(TMP-M,培養(yǎng)基中TMP濃度為20 μM)、高劑量TMP組(TMP-H,培養(yǎng)基中TMP濃度為40 μM).

1.2.3 細(xì)胞遷移檢測: 采用transwell細(xì)胞遷移實驗檢測細(xì)胞的遷移.依據(jù)實驗分組設(shè)計,將AGS和SGC7901細(xì)胞對應(yīng)的各自的細(xì)胞懸液加入transwell小室的上室中,下室中加入相應(yīng)的培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h.移除上室表面未遷移的細(xì)胞,遷移細(xì)胞經(jīng)甲醇固定后加結(jié)晶紫染液染色,置于顯微鏡下拍照觀察并計算細(xì)胞遷移率.

1.2.4 細(xì)胞侵襲檢測: 采用transwell細(xì)胞侵襲實驗檢測細(xì)胞的侵襲能力.預(yù)先將Matrigel膠均勻鋪至Transwell小室底部膜的上室面,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育,使基質(zhì)膠聚合成薄膜,用以模擬細(xì)胞外基質(zhì);而后將各組處理的AGS和SGC7901細(xì)胞對應(yīng)的各自的細(xì)胞懸液加入transwell小室的上室中,操作步驟同1.2.3,最后經(jīng)結(jié)晶紫染色,并置于顯微鏡下拍照觀察并計算細(xì)胞侵襲率.

1.2.5 細(xì)胞葡萄糖代謝指標(biāo)檢測: AGS和SGC7901細(xì)胞分別經(jīng)相應(yīng)的上述分組處理后,均依據(jù)公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行GLU攝取、LD產(chǎn)量、HK及LDH指標(biāo)的檢測操作.

1.2.6 氧消耗速率(oxygen consumption rate,OCR)及細(xì)胞外酸化率(extra-cellular acidification rate,ECAR)檢測: 采用細(xì)胞能量分析儀(Seahorse XF24,美國Seahorse Bioscience公司)檢測細(xì)胞經(jīng)TMP干預(yù)后OCR以及ECAR.將胃癌細(xì)胞株AGS和SGC7901細(xì)胞分別接種至專用培養(yǎng)板(10000個/孔).依據(jù)說明書操作如下: 貼壁后更換細(xì)胞培養(yǎng)基為檢測液,先監(jiān)測基礎(chǔ)條件下的OCR和ECAR,依次加藥(寡霉素、解偶聯(lián)劑FCCP、抗霉素A)后檢測并分析OCR和ECAR的結(jié)果.

1.2.7 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測: 采用western blot實驗檢測各組胃癌細(xì)胞株AGS和SGC7901經(jīng)TMP干預(yù)后葡萄糖代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)以及AKT/GLUT1信號通路的活性.RIPA裂解并離心收集細(xì)胞蛋白,BCA蛋白定量法對細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量后,采用SDS-PAGE蛋白凝膠電泳上樣并分離目的蛋白,之后通過電轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上.5%的脫脂牛奶孵育封閉后,按說明書要求依次加入相應(yīng)的一抗和二抗孵育,暗室中利用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,定影并對結(jié)果進(jìn)行灰度半定量分析.

統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)錄入GraphPad 8.3軟件中進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間的比較采用方差分析,各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗,P＜0.05表示有顯著差異.

2 結(jié)果

2.1 TMP對胃癌細(xì)胞活力的影響 CCK-8法檢測細(xì)胞活力的結(jié)果顯示如圖1所示,隨TMP濃度及作用時間增加,胃癌細(xì)胞AGS和SGC7901的活力均逐步降低.本實驗后續(xù)選取10 μM、20 μM和40 μM的TMP處理胃癌細(xì)胞48 h分別作為低、中、高劑量處理組.

圖1 川芎嗪對胃癌細(xì)胞增殖活力的影響. A: CCK-8法檢測的梯度濃度(0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM和80 μM)TMP干預(yù)AGS細(xì)胞不同時間(24 h、48 h、72 h)后的細(xì)胞活力數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果;B: CCK-8法檢測的梯度濃度(0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM和80 μM)TMP干預(yù)SGC7901細(xì)胞不同時間(24 h、48 h、72 h)后的細(xì)胞活力數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果.TMP: 川芎嗪.n=3.

2.2 TMP對胃癌細(xì)胞增殖和遷移的影響 克隆形成實驗檢測胃癌細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果如圖2A所示,TMP可劑量依賴性抑制AGS和SGC7901細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群落;統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示,中、高劑量組克隆形成數(shù)顯著低于對照組(P＜0.05).

Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實驗檢測胃癌細(xì)胞AGS和SGC7901的遷移情況及侵襲情況,結(jié)果如圖2B和C所示,TMP可劑量依賴性抑制AGS和SGC7901細(xì)胞遷移及侵襲;統(tǒng)計學(xué)分析表明,中、高劑量組細(xì)胞遷移率和侵襲率均顯著低于對照組(P＜0.05).

2.3 TMP對胃癌細(xì)胞葡萄糖代謝的影響 檢測結(jié)果如表1所示,中、高劑量的TMP可顯著抑制胃癌細(xì)胞對葡萄糖的利用,并抑制細(xì)胞內(nèi)乳酸生成;同時中、高劑量TMP組的OCR和ECAR值較對照組顯著降低.

表1 川芎嗪對胃癌細(xì)胞葡萄糖代謝的影響

2.4 TMP對胃癌細(xì)胞葡萄糖代謝過程中關(guān)鍵酶活性的影響 進(jìn)一步檢測TMP對胃癌細(xì)胞葡萄糖代謝過程中關(guān)鍵酶HK、LDH活性的影響,結(jié)果顯示(圖3),高劑量TMP可顯著抑制HK和LDH的活性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).

圖3 川芎嗪對胃癌細(xì)胞葡萄糖代謝過程中關(guān)鍵酶活性的影響.A: HK活性的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果,n=3,mean±SD,aP＜0.05,bP＜0.01 vs Ctrl組AGS細(xì)胞;cP＜0.01 vs Ctrl組SGC7901細(xì)胞.B: LDH活性的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果;n=3,mean±SD,aP＜0.05 vs Ctrl組AGS細(xì)胞;bP＜0.05 vs Ctrl組SGC7901細(xì)胞.Ctrl: 對照組;TMP-L: 低劑量川芎嗪組;TMP-M: 中劑量川芎嗪組;TMP-H: 高劑量川芎嗪組;HK: 己糖激酶;LDH: 乳酸脫氫酶.

2.5 TMP對胃癌細(xì)胞AKT/GLUT1信號及葡萄糖代謝相關(guān)蛋白的影響 Western blot檢測結(jié)果如圖4所示,與對照組相比,TMP孵育可顯著降低胃癌AGS及SGC7901細(xì)胞中磷酸化AKT的水平,總AKT蛋白表達(dá)不變;同時可抑制AGS及SGC7901細(xì)胞中GLUT1、HK2及LDHA的蛋白表達(dá)水平.

圖4 川芎嗪對胃癌細(xì)胞AKT/GLUT1信號及葡萄糖代謝相關(guān)蛋白的影響. A: AGS細(xì)胞,n=3,mean±SD,aP＜0.05,cP＜0.05,eP＜0.05,gP＜0.05,bP＜0.01,dP＜0.01,fP＜0.01,gP＜0.01 vs Ctrl組;B: SGC7901細(xì)胞,aP＜0.05,eP＜0.05,bP＜0.01,cP＜0.05,dP＜0.01,fP＜0.01 vs Ctrl組.Ctrl: 對照組;TMP-L: 低劑量川芎嗪組;TMP-M: 中劑量川芎嗪組;TMP-H: 高劑量川芎嗪組.

3 討論

TMP具有抗腫瘤活性,在胃癌中的研究顯示,TMP可通過激活ROS/AMPK通路促進(jìn)SGC7901胃癌細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑凋亡[9].另一項研究也同樣表明[10],在SGC7901胃癌細(xì)胞中TMP可通過核因子κB及周期調(diào)控因子發(fā)揮抑制增殖及促凋亡的效應(yīng).本研究旨在探討TMP對AGS及SGC7901胃癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響以及其中涉及的能量代謝異常問題.結(jié)果顯示TMP可濃度依賴性降低AGS及SGC7901胃癌細(xì)胞活力,并抑制其增殖及遷移.

本實驗進(jìn)一步從能量代謝的角度研究了TMP抑制胃癌細(xì)胞生長可能涉及的作用機制.依據(jù)Warburg效應(yīng),AGS和SGC7901胃癌細(xì)胞與其他腫瘤細(xì)胞類似,以有氧糖酵解代謝為主要的能量來源;為維持自身無限增殖的信號,胃癌細(xì)胞對一方面培養(yǎng)環(huán)境中葡萄糖的需求量較大,另一方面有氧糖酵解代謝會生成大量的乳酸,維持其生存所需的酸性微環(huán)境[11,12].故而本研究首先檢測了胃癌細(xì)胞及培養(yǎng)體系中葡萄糖的消耗量和乳酸的生成量,結(jié)果顯示經(jīng)TMP干預(yù)后,AGS細(xì)胞及SGC7901細(xì)胞消耗的葡萄糖量及乳酸的生成量顯著降低.OCR測量細(xì)胞的耗氧量可以反應(yīng)線粒體的氧化磷酸化作用,ECAR測定的培養(yǎng)基酸化速率也是一種檢測葡萄糖代謝的方法.檢測結(jié)果表明TMP可降低胃癌細(xì)胞的耗氧量和培養(yǎng)基酸化速率;這些結(jié)果均提示TMP可抑制AGS及SGC7901胃癌細(xì)胞利用葡萄糖進(jìn)行有氧糖酵解代謝,能量代謝異?？赡苁菍?dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖及遷移能力下降的原因之一.

腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解代謝過程中同樣需要己糖激酶、乳酸脫氫酶等關(guān)鍵酶的催化.胃癌細(xì)胞中HK2表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[13];HK2水平降低可阻礙細(xì)胞利用葡萄糖,抑制糖酵解的順利進(jìn)行.作為乳酸生成的關(guān)鍵酶之一,LDHA在胃癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁正常對照組織,且LDHA的高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[14,15].故而本研究進(jìn)一步檢測了胃癌細(xì)胞中,HK2和LDH的表達(dá)以及活性.結(jié)果顯示,TMP可顯著抑胃癌細(xì)胞中HK2和LDH的活性,同時抑制HK2和LDHA的蛋白表達(dá).AKT信號已被證實參與調(diào)節(jié)腫瘤生長代謝,磷酸化激活A(yù)KT之后可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)以及轉(zhuǎn)位,進(jìn)而增加細(xì)胞攝取葡萄糖的速度,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解代謝和腫瘤的生長[16,17].本研究的檢測結(jié)果顯示,TMP可顯著抑制胃癌細(xì)胞中AKT的磷酸化和GLUT1的蛋白表達(dá)水平.以上結(jié)果提示TMP可抑制AKT/GLUT1信號軸,下調(diào)糖酵解代謝關(guān)鍵酶HK2和LDHA的表達(dá),進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的有氧糖酵解代謝;然而該信號軸是否會對胃癌細(xì)胞其他相關(guān)的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響,所涉及的具體機制如何,還需進(jìn)一步的研究.

4 結(jié)論

綜上所述,TMP可抑制AGS及SGC7901胃癌細(xì)胞增殖及遷移,并通過AKT/GULT1信號軸抑制胃癌細(xì)胞有氧糖酵解代謝.

文章亮點

實驗背景

川芎嗪具有多種抗癌作用,而其對胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響和潛在的細(xì)胞學(xué)機制尚不完全清楚.

實驗動機

糖酵解在胃癌細(xì)胞的生長以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮巨大作用,川芎嗪抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲的過程中是否涉及抑制糖酵解并不清楚.

實驗?zāi)繕?biāo)

評估川芎嗪對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,并以糖酵解的角度初步探討其涉及的細(xì)胞學(xué)機制.

實驗方法

用10 μM、20 μM和40 μM川芎嗪處理胃癌細(xì)胞后,檢測細(xì)胞活性、遷移與侵襲、葡萄糖代謝指標(biāo)、葡萄糖代謝關(guān)鍵酶活性的變化;并用Western blot分析糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)和蛋白激酶B/葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1信號活性.

實驗結(jié)果

川芎嗪抑制胃癌細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移、侵襲和蛋白激酶B/葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1信號活性.

實驗結(jié)論

川芎嗪抑制胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用可能涉及到抑制蛋白激酶B/葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1信號軸介導(dǎo)的糖酵解.

展望前景

川芎嗪可能是潛在的抗胃癌藥劑.