金黃色葡萄球菌分離株在住院患者中的臨床分布及耐藥性分析

徐貝，李萍，張青松

宣城市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 宣城 242000

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, SA）屬于葡萄球菌屬、革蘭染色陽(yáng)性球菌，是臨床重要的病原菌。金黃色葡萄球菌可引起人體多種感染，是導(dǎo)致肺炎和其他呼吸道感染，手術(shù)部位、假體關(guān)節(jié)和心血管感染以及菌血癥的主要病原菌[1]。其中皮膚和軟組織感染最為常見(jiàn)，涉及皮膚或皮下組織、筋膜和肌肉，臨床表現(xiàn)復(fù)雜、感染程度嚴(yán)重[2]。近年來(lái)，廣譜抗生素的不恰當(dāng)使用使得醫(yī)療資源過(guò)度浪費(fèi)，甚至誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥，產(chǎn)生二重感染等嚴(yán)重情況，給臨床治療帶來(lái)較大考驗(yàn)[3]。本研究對(duì)從宣城市中心醫(yī)院住院患者呼吸道、皮膚軟組織及血液等部位分離出來(lái)的金黃色葡萄球菌進(jìn)行臨床分布特點(diǎn)及耐藥性分析，以期為及時(shí)準(zhǔn)確診治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 所有菌株均分離自宣城市中心醫(yī)院住院患者，采樣時(shí)間為2021 年9 月—2023 年3月，采樣部位為呼吸道、皮膚軟組織及血液等。感染患者均有相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，包括呼吸道癥狀、皮膚局部紅腫、發(fā)熱、炎性分泌等。

1.2 主要儀器及試劑 VITEK2-compact 全自動(dòng)微生物分析儀及配套藥敏板卡（法國(guó)梅里埃公司）；PCR 擴(kuò)增儀（Bio-Rad 公司）；PCR 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；培養(yǎng)基及藥敏紙片（英國(guó)OXOID公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 分離菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 對(duì)疑似金黃色葡萄球菌采用VITEK2-compact 全自動(dòng)微生物分析儀及配套藥敏板卡進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，若鑒定為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）菌株，再經(jīng)微量肉湯稀釋法確認(rèn)。MRSA 鑒定遵循美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)2021 標(biāo)準(zhǔn)[4]，苯唑西林最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 μg/mL為mecA 介導(dǎo)的耐藥；苯唑西林MIC≤2 μg/mL 為mecA 介導(dǎo)耐藥陰性。參照美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局文件[5]規(guī)定的替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行金黃色葡萄球菌藥敏檢測(cè)結(jié)果判讀。質(zhì)控菌株為溫州康泰生物科技有限公司提供的金黃色葡萄球菌ATCC29213（mecA陰性）和ATCC43300（mecA陽(yáng)性）。

1.3.2 耐藥基因及毒力基因檢測(cè) 采用PCR 法檢測(cè)表型為MRSA 菌株的mecA 和殺白細(xì)胞素（Panton-Valentine leukocidin，PVL）基因。采用煮沸法[6]提取DNA 模板，挑取目的菌株至雙蒸水中制備菌懸液，100 ℃加熱煮沸10 min，冷卻至室溫后9 600g離心10 min，提取上清液作為PCR 擴(kuò)增模板。引物參照文獻(xiàn)［6］設(shè)計(jì)，由上海生工生物有限公司合成。見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，10×Taq buffer（含Mg2+）2 μL，nDTP 1.2 μL，rTaq酶0.1 μL，上下游引物各0.6 μL，補(bǔ)ddH2O 至20 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳成像，并由上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 金黃色葡萄球菌mecA及PVL基因測(cè)序條件Table 1 Primer sequence of mecA and PVL gene of Staphylococcus aureus

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 20.0 軟件分析臨床數(shù)據(jù)，采用WHONET 5.6軟件分析金黃色葡萄球菌的耐藥性。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示。

1.4 倫理學(xué)聲明 本研究所有參與患者均簽署知情同意書(shū)并獲得宣城市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過(guò)（2021009）。

2 結(jié) 果

2.1 臨床患者分布特征 共有133 例金黃色葡萄球菌感染患者納入分析，男性占62.4%（83/133），女性占37.6%（50/133），平均年齡為（53.9±22.7）歲。單個(gè)科室中，患者來(lái)源占比前兩位的是呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（21.8%，29/133）和重癥醫(yī)學(xué)科（18.8%，25/133）。感染主要類(lèi)型為皮膚癤癰、褥瘡類(lèi)感染，占47.4%（63/133），上、下呼吸道感染分別占23.3%（31/133）、13.5%（18/133）。高血壓和糖尿病患者分別占24.8%（33/133）、20.3%（27/133）。見(jiàn)表2。

表2 金黃色葡萄球菌致患者感染的臨床特征分布Table 2 Clinical distribution of patient infection caused by Staphylococcus aureus

2.2 金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果 133 株金黃色葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、替加環(huán)素、呋喃妥因及利福平敏感率為100.0%，對(duì)青霉素的耐藥率最高，為88.0%（117/133），對(duì)紅霉素、克林霉素的耐藥率分別為34.6%（46/133）、30.1%（40/133），對(duì)復(fù)方磺胺甲惡唑、慶大霉素、環(huán)丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星耐藥率均低于10.0%。MRSA 檢出率為23.3%（31/133），甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）檢出率76.7%（102/133），且MRSA 比MSSA 對(duì)大部分抗菌藥物耐藥率更高。31 株MRSA 對(duì)青霉素的耐藥率為100.0%（31/31），對(duì)紅霉素、克林霉素耐藥率分別為58.1%（18/31）、51.6%（16/31），102 株MSSA 對(duì)青霉素的耐藥率為84.3%（86/102），對(duì)紅霉素、克林霉素的耐藥率分別為27.5%（28/102）、23.5%（24/102）。見(jiàn)表3。

表3 金黃色葡萄球菌耐藥特點(diǎn)Table 3 Characteristics of drug-resistance of Staphylococcus aureus detected

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)PCR 檢測(cè)，31 株MRSA 中有30 株攜帶耐藥基因mecA，6 株攜帶PVL基因，其中有5株同時(shí)攜帶mecA和PVL基因。

3 討 論

本研究顯示，宣城市中心醫(yī)院的金黃色葡萄球菌分離株絕大部分來(lái)自呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科和重癥醫(yī)學(xué)科，可能因長(zhǎng)期住院而發(fā)生醫(yī)院感染，且與醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生執(zhí)行不規(guī)范和院內(nèi)傳播有關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在尿路感染中也不少見(jiàn)，與李曉芹等[8]研究基本相同。隨著抗生素的廣泛使用，耐藥的金黃色葡萄球菌也逐年增多，本研究中MRSA的檢出率為23.3%，31株MRSA中有30株攜帶耐藥基因mecA，與蔣麗遷等[9]的研究相近。MRSA 感染后癥狀更為嚴(yán)重，臨床治療更為棘手，甚至危及生命，因此對(duì)疑似金黃色葡萄球菌感染的患者標(biāo)本應(yīng)盡早送實(shí)驗(yàn)室做相關(guān)檢測(cè)。

金黃色葡萄球菌攜帶多種毒素，其中PVL 與社區(qū)獲得性金黃色葡萄球菌感染有較大相關(guān)性[10]。中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等有核細(xì)胞是PVL 的靶細(xì)胞，PVL 還可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，與皮膚軟組織感染和壞死性肺炎相關(guān)[11-13]。攜帶PVL 基因的MRSA 毒力更強(qiáng)，危害性也更大[14]，所以對(duì)耐藥的金黃色葡萄球菌要及時(shí)進(jìn)行mecA 和PVL基因檢測(cè)，以期獲得早期精準(zhǔn)治療。本研究中檢測(cè)出31 株MRSA，且MRSA 株比MSSA 株明顯耐藥，這與MRSA 產(chǎn)生一種獨(dú)特的青霉素結(jié)合蛋白有關(guān)。MRSA 株對(duì)紅霉素、克林霉素的耐藥率較高，提示對(duì)于患者的金黃色葡萄球菌感染應(yīng)謹(jǐn)慎使用紅霉素及克林霉素類(lèi)藥物。對(duì)于萬(wàn)古霉素，利奈唑胺，替加環(huán)素、呋喃妥因及利福平，MRSA 和MSSA都敏感。

糖尿病足感染（diabetic foot infection，DFI）是糖尿病的一種嚴(yán)重且常見(jiàn)的并發(fā)癥，老年人感染預(yù)后明顯較中青年差，且多重耐藥性明顯升高。金黃色葡萄球菌是DFI 主要致病菌[15]，如果不進(jìn)行及時(shí)、合理的治療，DFI 可能無(wú)法治愈，導(dǎo)致膿毒性壞疽，甚至截肢[16]。本研究中合并高血壓、糖尿病患者占比分別為24.8%和20.3%，這比詹師等[17]研究偏低，可能與本次研究樣本量不足有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。對(duì)于高血壓、糖尿病患者應(yīng)積極預(yù)防金黃色葡萄球菌等細(xì)菌引起的相關(guān)感染[18]。

利益沖突聲明全部作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明徐貝負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、論文撰寫(xiě)；李萍負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集和整理；張青松負(fù)責(zé)技術(shù)指導(dǎo)、論文撰寫(xiě)指導(dǎo)和修改