基于納米酶的比色生物傳感器在生物醫(yī)學檢測中的應(yīng)用*

袁琳 陸冬筱 李金華

（長春理工大學物理學院，納米光子學與生物光子學吉林省重點實驗室，長春 130022）

對于疾病進行有效控制和治療的關(guān)鍵是可以在早期進行準確的檢測。目前醫(yī)學診療手段日益豐富，但是如計算機斷層掃描（CT）等常規(guī)檢查項目無法在早期對一些慢性?。ㄈ缣悄虿　⑼达L以及阿爾茨海默病等）進行準確判斷。建立快速、靈敏度高、選擇性好的檢測方法具有十分重要的意義。納米材料和技術(shù)的快速發(fā)展為生物傳感器的研究和發(fā)展提供了很重要的平臺和手段，目前已經(jīng)有多種生物傳感器應(yīng)用于生物檢測，根據(jù)生物傳感器中的信號不同可以將其分為電化學生物傳感器、熱學生物傳感器、壓電生物傳感器、場效應(yīng)管生物傳感器和光學生物傳感器等。電化學傳感器在進行檢測時，對溫度十分敏感，所以要進行內(nèi)部溫度補償，盡可能保持溫度穩(wěn)定，同時，電化學傳感器在使用壽命內(nèi)會老化，需要頻繁校準；熱學傳感器在進行測試時對測量溫度的范圍有一定的限制，程序也較為復(fù)雜；壓電型生物傳感器由于傳感器的表面與液體之間的結(jié)構(gòu)會影響最后模型的建立，情況也比較復(fù)雜；場效應(yīng)管生物傳感器在將生物物質(zhì)與傳感器固化過程中容易引起生物物質(zhì)失活等問題，同時操作比較復(fù)雜。而作為一種典型的光學傳感器——基于納米酶的比色生物傳感器，與無納米酶的比色生物傳感器相比，具有制作成本低、操作簡單、靈敏度高以及肉眼可視等特點，所以被越來越多的研究者所青睞。本文主要綜述基于納米酶的比色生物傳感器的相關(guān)原理、納米酶的分類以及在生物檢測方面的應(yīng)用和最新進展。

1 基于納米酶的比色生物傳感器

1.1 基于納米酶的比色生物傳感器的傳感機理

比色傳感技術(shù)主要是以顏色變化為基礎(chǔ)，通過肉眼觀察分析物的存在和濃度變化，進行定性的判斷，基于納米酶的比色傳感主要是基于過氧化氫（H2O2）可以催化某些顯色底物發(fā)生氧化反應(yīng)，從而使顯色底物變色，達到可視化檢測目的。在沒有納米酶存在的情況下也可以對H2O2進行檢測，但存在耗時更長、選擇性一般等不足，因此，基于納米酶構(gòu)建的比色生物傳感器被越來越多的人認可。比色法主要采用目視法和分光光度計法兩種方法。目視法是直接通過肉眼觀察溶液顏色的深淺變化；分光光度計法是通過對物質(zhì)的吸光度值變化進行測定，不僅可以定性地對待測物質(zhì)進行識別，同時也可以定量地進行分析檢測，在滿足快速便捷的同時還具有較好的準確性。目前檢測的顯色底物一般為3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），也有其他的顯色底物如2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）或鄰苯二胺（OPD）等。以顯色底物TMB為例，基于納米酶的比色生物傳感器顯色過程主要是，納米酶中的活性位點首先吸附TMB，給納米酶表面提供一定的孤電子對，導(dǎo)致納米酶的電子密度和遷移率增加，由于此時體系界面上的強相互作用，活性位點將會得到電子被還原，同時將電子轉(zhuǎn)移到H2O2，活性位點在此被氧化，從而加速了納米酶與TMB之間的電子轉(zhuǎn)移過程，使檢測時間大大縮短。

1.2 基于納米酶的比色生物傳感器的幾種器件構(gòu)建形式

a. 紙基生物檢測。首先將沃特曼（Whatman）濾紙穿孔成大小一致的小圓盤，并以納米酶作為基礎(chǔ)，將納米酶載于紙上，以獲得一次性高靈敏度的紙質(zhì)生物分析儀，然后再通過智能手機應(yīng)用程序（如：Color Assist）在RGB模式下監(jiān)測添加待測物質(zhì)后紙質(zhì)設(shè)備上的比色信號，并進行擬合，得到試紙條顏色與待測物質(zhì)濃度的函數(shù)關(guān)系。紙基的檢測方法主要是，先將定性濾紙浸入含有TMB的溶液中一段時間，在室溫下風干后，滴加含有納米酶和待檢測物質(zhì)的溶液，觀察紙張的顏色變化，再進一步采用軟件進行分析，如Jin等［1］首先制備了具有高靈敏性的氫氧化鈷（CoOOH）納米酶，然后應(yīng)用于制備紙基納米酶試紙條，并通過結(jié)合智能手機和軟件，成功構(gòu)建了檢測乙酰膽堿酯酶（AChE）傳感器，圖1為基于納米酶紙基法檢測H2O2的示意圖。采用紙基生物檢測可以實現(xiàn)低成本、快速、便攜檢測，為臨床應(yīng)用提供了一種有前景的設(shè)計。

Fig. 1 Schematic diagram of detecting H2O2 based on nanozyme paper-based method圖1 基于納米酶紙基法檢測H2O2的示意圖

b. 便攜式水凝膠試劑盒檢測。首先制備納米酶和TMB的水凝膠裝置，然后在加入待檢測的物質(zhì)，等待一段時間，讓待測物質(zhì)更好的擴散到水凝膠裝置中，采用數(shù)碼相機記錄檢測結(jié)果，然后再用Image J軟件等進行量化，并對數(shù)據(jù)進行分析，采用圖像處理的方法得到待測物質(zhì)濃度與水凝膠顏色深淺度的線性直方圖。便攜式水凝膠試劑盒具有操作簡單、選擇性好以及成本低等優(yōu)點，可以滿足頻繁的篩查和診斷跟蹤需要。

c. 瓊脂糖凝膠試劑條檢測。首先制備瓊脂糖試劑條，然后將納米酶和TMB固定于瓊脂糖凝膠中，用于待測物質(zhì)的比色檢測，一段時間后，可以觀察到瓊脂糖凝膠試劑條的顏色變化，用UV-vis分析儀進一步分析，得到試劑條吸光度與待測物質(zhì)濃度的關(guān)系曲線。瓊脂糖試劑條靈敏度高［2］，有望對氣體進行檢測。

由于具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點，已經(jīng)有越來越多基于比色生物傳感器的器件被成功構(gòu)建，這為生物檢測提供了更多思路的同時，也為現(xiàn)場實時檢測提供了有力的支持。但是當需要對體內(nèi)的血液、尿液或其他體液進行檢測時，則要保證納米酶可以與生物物質(zhì)很好地兼容，所以對于納米酶生物相容性的要求也大大提高。

1.3 納米酶的特點及分類

納米酶是一類具有類似于天然酶活性的納米材料，既具有接近天然酶的催化活性，又具有性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、易于合成等優(yōu)點，所以納米酶在生物檢測領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)，多種納米材料均具有天然酶活性，可以表現(xiàn)出模擬過氧化物酶活性，并將具有過氧化酶活性的納米酶應(yīng)用于比色生物傳感器的制備，目前基于納米酶的比色傳感器為人們的生活以及醫(yī)療方面提供了越來越多的便捷。對基于納米酶的比色生物傳感器而言，納米酶的模擬過氧化物酶活性對傳感器的靈敏度等性能至關(guān)重要。根據(jù)核心材料分類，納米酶大致可分為貴金屬基納米酶、石墨烯基納米酶、過渡金屬基納米酶等。

[15]參見[德]Pro.Manfred Wolf：《德國物權(quán)法》，吳越、李大雪譯，北京：韋伯文化國際出版有限公司，法律出版社，2006年，第276頁。

1.3.1 基于貴金屬納米酶的比色生物傳感器

貴金屬納米材料由于具有獨特的物理及化學性質(zhì)、較好的活性位點以及局域表面等離子體共振特性，在一些領(lǐng)域得到較好的應(yīng)用［3-6］。目前，已發(fā)現(xiàn)一些貴金屬具有很好的模擬酶的催化活性，如金、銀、鉑等。Xu等［7］用不同濃度的Cu2+離子對金納米棒進行誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，不同Cu2+離子會誘導(dǎo)金納米棒（Au NRs）出現(xiàn)不同的高指數(shù)晶面，加速了活性電子從納米酶轉(zhuǎn)移到H2O2的過程，從而表現(xiàn)出較好的過氧化物酶活性，在此基礎(chǔ)上對維生素飲料中的抗壞血酸進行了檢測（圖2），檢測限可以達到25 μmol/L，為檢測抗氧化分子提供了一個新的平臺。與此同時，近年來對于金屬Pt的報道也越來越多，由于Pt具有類辣根過氧化物酶的特性，也被越來越廣泛地應(yīng)用，Li等［8］研究基于BSA對金屬Pt進行包覆得到BSA-Pt納米酶，其中Pt（0）參與底物與H2O2的釋放過程，從而顯示出較好的類辣根過氧化物酶活性，而Hg2+離子可以通過與Pt間的親金屬相互作用調(diào)節(jié)其過氧化物酶活性，從而達到比色的效果。綜上，貴金屬納米酶可以很好地應(yīng)用于比色生物傳感器的構(gòu)建，進而很好地應(yīng)用于相關(guān)生物分析檢測和醫(yī)學檢驗當中，本文也列出基于貴金屬納米酶的比色生物傳感器的檢測物質(zhì)以及靈敏度（表1）。

Table 1 Colorimetric biosensor based on noble metal nanozyme was used for colorimetric detection表1 基于貴金屬納米酶比色生物傳感器用于比色檢測

Fig. 2 TEM images of Au NRs under different copper ion concentrations and the mechanism of ascorbic acid detection［7］圖2 不同銅離子濃度下Au NRs的透射電子顯微鏡（TEM）照片以及檢測抗壞血酸機制［7］

1.3.2 基于石墨烯基納米酶的比色生物傳感器

近年來，碳納米材料因具有多種良好的物理性質(zhì)而被廣泛地利用［13-17］。作為碳材料中最具代表性的材料之一，石墨烯是一種碳原子以sp2雜化形成的，其中碳原子緊密堆積形成具有二維蜂窩狀結(jié)構(gòu)的材料，石墨烯每一個晶格內(nèi)的σ鍵都十分穩(wěn)定，同時都貢獻p軌道上一個電子形成大π鍵，由于π電子可以自由運動，所以石墨烯具有良好的導(dǎo)電性［18］。

石墨烯的重要衍生物之一是氧化石墨烯和還原氧化石墨烯。氧化石墨烯的表面含有較多的含氧官能團（如：羥基、羧基和環(huán)氧基等），因此氧化石墨烯具有更好的水溶性，也更易與其他分子偶聯(lián)，尤其是單層的氧化石墨烯，具有更大的比表面積以及π電子結(jié)構(gòu)，其他分子可以更加容易地通過非共價的形式結(jié)合在其表面［19］。Li等［20］采用簡單的鐵自催化過程，在室溫下成功合成還原石墨烯（RGO）-鐵納米顆粒（INs），原位形成的氧化殼可以有效引導(dǎo)鐵的循環(huán)，同時產(chǎn)生具有高活性的羥基自由基（·OH），從而表現(xiàn)出良好的過氧化物酶活性（圖3），基于此建立了基于該納米酶的比色生物傳感器，成功采用比色法對過氧化氫和葡萄糖進行檢測。碳基納米材料由于具有良好的導(dǎo)電性、水溶性和生物相容性，被越來越多的研究者應(yīng)用于比色傳感的分析檢測中，本文也列出基于石墨烯納米酶的比色生物傳感器的檢測物質(zhì)以及靈敏度（表2）。

Table 2 Colorimetric biosensor based on graphene nanozyme is used for colorimetric detection表2 基于石墨烯納米酶比色生物傳感器用于比色檢測

Fig. 3 Characterization and synthesis of RGO-Ins圖3 RGO-Ins表征及合成示意圖

1.3.3 基于過渡金屬納米酶的比色生物傳感器

過渡金屬通常是指由元素周期表的d區(qū)域中（如Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、Mo等）的金屬元素組成的單質(zhì)，且這些金屬都有很強的電化學特性和促進電子轉(zhuǎn)移性質(zhì)。過渡金屬納米材料具有極好的導(dǎo)電性、光學、化學穩(wěn)定性，擁有大量的活性催化位點，其晶體結(jié)構(gòu)可調(diào)，帶隙與材料厚度息息相關(guān)。上述優(yōu)勢激發(fā)起愈來愈多研究者對過渡金屬納米材料的研究和關(guān)注［26-31］。過渡金屬材料一定的修飾后會表現(xiàn)出其他材料無法比擬的物理特性［32］，同時也憑借著較大的比表面積以及良好的導(dǎo)電性成為了可以檢測化學物質(zhì)或者生物物質(zhì)的新型材料。

二硫化鉬（MoS2）是一種典型的過渡金屬硫化物，具有二維層狀結(jié)構(gòu)，因其較大的比表面積以及較高的載流子遷移率等優(yōu)點，被研究者們稱為“無機石墨烯”。MoS2合成方法也較多，主要有化學氣相沉積法［33］、水熱法［34］、溶劑熱法［35］以及剝離法［36］等，所以受到越來越多研究者們的關(guān)注。本課題組采用化學氣相沉積法制備了MoS2薄膜，然后將金納米陣列與單層的MoS2進行復(fù)合，用于水產(chǎn)品抗菌藥物殘留的檢測，在此基礎(chǔ)上，成功實現(xiàn)了對蝦體內(nèi)的抗菌藥物殘留的檢測［37］。同時我們還對單層、雙層二硫化鉬的超快動力學特性進行了研究［38］。

Lin等［39］首次發(fā)現(xiàn)，MoS2納米片具有固有的類過氧化物酶活性，可以催化H2O2氧化TMB，產(chǎn)生藍色的氧化物，在此基礎(chǔ)上建立了一種具有較高靈敏度可以對血清中葡萄糖進行檢測的方法，同時也構(gòu)建了瓊脂糖水凝膠試劑盒，可以更加簡單、廉價、便攜地對血清中的葡萄糖進行檢測。研究表明，MoS2納米粒子的過氧化物酶活性與其表面所帶的電荷息息相關(guān)，檢測示意圖如圖4所示［40-41］。很多研究者對其進行了一定的表面修飾以獲得較高的靈敏度。MoS2因比表面積大、電子遷移率高等優(yōu)點被很好地應(yīng)用于比色分析中。單純裸露的MoS2不溶于水，所以通常要對其表面進行修飾或與其他材料復(fù)合以增強其穩(wěn)定性和分散性。MoS2催化活性往往受其層數(shù)、厚度和形狀等的影響，目前對其如何調(diào)控還需要進一步的研究。此外，研究表明，還有一些過渡金屬硫化物也具有良好的類酶特性，如二硫化鎢（WS2）、硫化鈷（CoS）等。Lin等［42］首次發(fā)現(xiàn)，WS2具有過氧化物酶活性，可以對葡萄糖采用比色法進行檢測和分析；Das課題組［43］基于CoS/還原石墨烯的復(fù)合材料較好的納米酶特性，研制了一種簡單的比色法對Hg2+進行分析。對于過渡金屬硫族化合物的研究越來越廣泛，也成功地應(yīng)用于比色生物傳感領(lǐng)域，這為相關(guān)醫(yī)學檢測的應(yīng)用提供了有力幫助，本文也列出基于過渡金屬納米酶的比色生物傳感器的檢測物質(zhì)以及靈敏度（表3）。

Table 3 Colorimetric biosensors based on transition metal nanoenzymes are used for colorimetric detection表3 基于過渡金屬納米酶比色生物傳感器用于比色檢測

Fig. 4 Preparation process of SDS-MoS2 NPs and schematic diagram of detecting H2O2 and glucose［40］圖4 SDS-MoS2 NPs的制備過程以及檢測H2O2和葡萄糖示意圖［40］

目前已經(jīng)有越來越多的材料被發(fā)現(xiàn)可以作為納米酶，納米酶的出現(xiàn)不僅彌補了天然酶的穩(wěn)定性差等不足，也大大推進了在生物醫(yī)學檢測方面的進步和應(yīng)用，讓疾病的早期干預(yù)和治療變成可能，同時也為人們的生活提供了更多的保障。

2 基于納米酶的比色生物傳感器在生物醫(yī)學檢測中的應(yīng)用

與天然酶相比，納米酶具有性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、易于合成同時可以將一些信號放大等優(yōu)點?；诩{米酶的比色生物傳感器具有較高的靈敏度和較低的成本，因此，在生物環(huán)境檢測、生物體內(nèi)相關(guān)標志物檢測和癌癥早期篩查等有方面有著較好的應(yīng)用前景。

2.1 生物環(huán)境檢測應(yīng)用

生物環(huán)境與人們的生產(chǎn)生活等方面息息相關(guān)，尤其在食品安全方面的相關(guān)檢測需要更加準確且便捷。其中常見的檢測物質(zhì)是H2O2，H2O2經(jīng)常作為穩(wěn)定劑、防腐劑、漂白劑或于消毒劑來使用，尤其是牛奶等相關(guān)飲品的處理和包裝當中，殘留的H2O2可能對人體造成一定的危害，所以對于食品中H2O2的檢測具有重要意義。Fu等［49］通過簡單的溶劑熱方法制備了MIL-88B-Fe-MOF納米酶，證明其具有良好的酶活性，并建立基于該納米酶的比色傳感平臺。該傳感平臺在10~100 μmol/L范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的靈敏度，其用于牛奶和啤酒樣品中H2O2的可行性得到了初步驗證。上述工作體現(xiàn)了納米酶在食品分析檢測中的巨大潛力。與大尺寸的Fe基納米酶相比，超小型的量子點水溶性可以大大提高，同時也增強了其與底物之間的親和能力。2022年，Li等［50］通過實驗發(fā)現(xiàn)，采用兩步水熱法制備的超小型Fe3O4量子點，比Fe3O4納米顆粒具有更高的酶活性，并用海藻酸鈉（SA）將所制備的量子點包覆，不僅提高了量子點的水溶性同時也顯著增強了其酶活性。酶活性的顯著提高可能歸因于SA基質(zhì)的引入可以很好地增強納米酶與TMB之間的親和力。此外，利用SA的強成膜功能，他們將TMB涂覆在陣列毛細管上，開發(fā)并建立了一種陣列毛細管的快速比色分析方法，其濃度檢測范圍可以達到10~400 μmol/L，這種便攜式比色傳感裝置可以提高現(xiàn)場評估能力，同時也有望應(yīng)用于食品安全的檢測中。與單純的納米顆粒相比，具有三維結(jié)構(gòu)的納米酶由于其具有更高的比表面積進而會增加與底物之間的接觸面積，從而對催化活性有一定的提高。本課題組制備了具有獨特三維結(jié)構(gòu)的ZIF-67/rGO納米酶，并制作了基于該納米酶的生物傳感平臺（圖5），實現(xiàn)了對H2O2的靈敏檢測（檢測限低至3.81 μmol/L），同時也通過對牛奶樣品中H2O2的檢測，證明了其作為比色生物傳感器具有很大的適用性，為一些實際應(yīng)用檢測提供了很大的幫助［51］。抗氧化劑在食物系統(tǒng)中的綜合活性是生物或食物環(huán)境等分析中必不可少的參數(shù)之一，選擇具有較強抗氧化能力的食物可以在一定程度上減少致病的風險，延長壽命［52］。Liang等［53］從墨魚汁中提取天然黑色素納米顆粒作為載體并以Fe3+進行功能化，得到具有較高穩(wěn)定性和活性的Fe-NMPs納米酶，用于生物環(huán)境中抗壞血酸（AA）的檢測，檢測范圍為5~250 μmol/L，最低檢出限達到12.61 μmol/L，測試結(jié)果與飲料和水果中結(jié)果相似，驗證了該納米酶進行實際抗氧化能力檢測的可行性［53］。谷胱甘肽（GSH）作為一種天然多肽存在于穩(wěn)定的細胞環(huán)境中，維持著正常生物體的免疫系統(tǒng)功能，血漿中GSH異常會導(dǎo)致衰老、心血管疾病等［54］，Li等［55］首先制備了WS2材料，將其應(yīng)用于GSH檢測，在100 pmol/L~10 nmol/L范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，這也為食品以及細胞環(huán)境GSH的測定提供了有力的幫助和支持。

Fig. 5 Schematic of the colorimetric detection of H2O2 using daisy-like ZIF-67/rGO nanozyme biosensor platform［51］圖5 基于ZIF-67/rGO生物傳感平臺比色檢測H2O2示意圖［51］

2.2 生物標志物檢測應(yīng)用

疾病的發(fā)生一般會引起體內(nèi)某種標志物的特征性指標發(fā)生變化，從而可以通過測定特定的生物標志物以獲得生物體所處狀態(tài)。本文將對乙酰膽堿、膽固醇、葡萄糖等生物體內(nèi)重要標志物的檢測及相關(guān)的檢測原理進行總結(jié)，同時也為其他相關(guān)標志物的檢測和應(yīng)用提供一定的思路和方向。

2.2.1 乙酰膽堿的檢測

乙酰膽堿（ACh）在生物體內(nèi)發(fā)揮著不可或缺的作用。作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，ACh在生物體內(nèi)的神經(jīng)信號傳遞中發(fā)揮重要作用，其紊亂與一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病、帕金森?。?6］等，密切相關(guān)。準確地測定生物體內(nèi)ACh含量對于臨床診斷相關(guān)疾病具有十分重要的意義。ACh的檢測原理是，首先AChE降解ACh后生成膽堿，在溶解氧的存在下，膽堿氧化生成甜菜堿和H2O2，H2O2在納米酶的催化下，可以將一些顯色底物進行氧化，生成肉眼可見的有色物質(zhì)。

Ni等［57］采用Ag［I］離子-TMB通過比色法對AChE及其抑制劑進行檢測。實驗表明，該方法具有較高的靈敏度，檢測限可以達到4.3 nU/L。該系統(tǒng)也可以應(yīng)用于AChE抑制劑的檢測。該系統(tǒng)檢測方法簡單，靈敏度較高，具有較好的應(yīng)用前景。2019年，Lu課題組［1］設(shè)計了一種基于膽堿氧化酶/氧化鈷（CHO/CoOOH）的新型比色傳感器，用于AChE的靈敏檢測，并將其制備成試紙條，可以目視和定性地檢測AChE，同時使用智能手機和Image J軟件實現(xiàn)對AChE的定量檢測。該組也開發(fā)了一種新的基于蛋白質(zhì)-無機雜交納米花作為人工過氧化物酶的比色傳感器（圖6）該傳感器主要包括一個測試工具和一個智能手機閱讀器，可以較為準確地測定人體血清中的ACh。Lu課題組利用該平臺制備了用于ACh快速定性監(jiān)測的便攜式瓊脂糖凝膠試劑盒，結(jié)合手機Image J程序，將檢測試劑的圖像信息轉(zhuǎn)化為色相參數(shù)，為檢測ACh提供了直接的定量工具［58］。Lu課題組方案的提出不僅為檢測溶液中的ACh提出了新的想法，也為檢測方法的實際應(yīng)用提供了更多的便利。通過將紙基和瓊脂糖等器件與智能手機有機結(jié)合，成功構(gòu)建了AChE監(jiān)測傳感器，為臨床應(yīng)用提供了新的設(shè)計方案。

Fig. 6 Determination of acetylcholine in serum and its absorption spectrum by protein-inorganic hybrid nanoflowers圖6 蛋白質(zhì)-無機雜交納米花檢測血清中乙酰膽堿及吸收光譜

2.2.2 膽固醇的檢測

膽固醇的測定對于多種臨床疾?。ㄈ纾旱偷鞍装Y、貧血、敗血癥、營養(yǎng)不良、高血壓、冠心病、動脈硬化以及心肌梗死等）的診斷以及預(yù)防具有重要意義［59］。建立一種簡單方便、經(jīng)濟實惠的膽固醇準確檢測方法十分重要。膽固醇［60］在膽固醇氧化酶存在的情況下，可以產(chǎn)生膽甾烯酮和H2O2，進而H2O2將顯色底物氧化，從而達到比色法檢測的目的。

Hong等［61］通過耦合具有過氧化物酶活性的聚吡咯納米粒子（PPy NPs）和膽固醇氧化酶（ChOx），構(gòu)建了一種簡單、方便的利用比色法對膽固醇進行檢測的方法，其線性范圍為10~100 μm，檢測限為3.5 μm。他們利用該體系設(shè)計了一種簡易的檢測試劑盒，實現(xiàn)了對人體血清中膽固醇可視化檢測，為臨床診斷以及健康管理提供了有力的幫助。目前，有越來越多的檢測方案采用有機分子對無機納米材料進行一定的修飾，以獲得更好的催化活性，從而對生物分子進行更靈敏的檢測。Liu課題組［62］用5,10,15,20-四（4-羧基苯基）卟啉功能化NiS2納米顆粒，然后將其錨定在石墨烯（Por-NiS2/GO）表面。卟啉分子和二維石墨烯的引入極大增強了Por-NiS2/GO的過氧化物酶活性。由此，他們構(gòu)建了基于Por-NiS2/GO納米酶的快速、靈敏且具有選擇性的比色生物傳感平臺（圖7），通過對血清樣本中膽固醇的檢測驗證了其有效性。該組還采用簡單有效的溶劑熱方法制備了5,10,15,20-四（4-羧基苯基）卟啉功能化NiCo2S4蛋黃殼納米球（Por-NiCo2S4），證明與純NiCo2S4納米顆粒相比，Por-NiCo2S4具有更加明顯的催化活性，并結(jié)合膽固醇氧化酶（Chox）建立基于Por-NiCo2S4的比色生物傳感平臺，該平臺可在0.1~9.0 mmol/L范圍內(nèi)進行檢測，檢測限低至19.36 μmol/L。該納米酶也成功用于測定人體血清中的膽固醇水平［63］。將無機納米材料與有機分子進行復(fù)合可以在一定程度上增強其過氧化酶活性，有機分子的引入也可以在一定程度上增強其水溶性，避免了部分納米酶水溶性不好的問題，為納米酶的進一步發(fā)展和應(yīng)用于更多生物分子的檢測提供了思路和可能。

Fig. 7 Schematic illustration of the fabrication procedure of Por-NiS2/GO and the process of detecting cholesterol［62］圖7 Por-NiS2/GO納米酶的制備和檢測膽固醇過程的示意圖［62］

2.2.3 葡萄糖的檢測

葡萄糖在細胞新陳代謝中發(fā)揮重要作用，是生物體的重要能量來源，對于維持人體正常的生理功能具有重要意義。越來越多的研究者也致力于葡萄糖檢測研究。通常檢測葡萄糖的機理如下，由于葡萄糖氧化酶（GOx）存在時，可以將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，同時產(chǎn)生H2O2，然后再對顯色底物TMB進行氧化，得到不同葡萄糖濃度與吸光度之間的線性關(guān)系［64］。2018年，Vinita等［65］在二硫化鉬上修飾金納米粒子簡單合成了AuNPs@MoS2-QD，構(gòu)成了一個比色法檢測平臺，該平臺在室溫下性能穩(wěn)定，可以對葡萄糖進行靈敏和選擇性分析。Wang等［66］通過在還原氧化石墨烯（rGO）上修飾MoS2納米花和V2O5納米顆粒得到一種新的納米酶（3D V2O5-MoS2/rGO），并證明其具有過氧化物酶活性，可以對人體血樣和尿液中的葡萄糖可以靈敏檢測。三維納米酶的制備在一定程度上更好地提供了催化位點，與rGO的復(fù)合也更大程度上解決了MoS2的水溶性差的問題，進一步提高了納米酶的催化活性。越來越多的納米酶采用綠色合成的方法，在保證無污染、催化活性高的同時也更好地增加了其生物相容性。2021年，Alle等［67］采用新型微波綠色原位合成陽離子納米纖維（C.CNF）負載金納米粒子（AuNPs）的方法，合成了（AuNPs@C.CNF）納米酶薄膜，并建立基于此的比色生物傳感平臺，此平臺具有靈敏、快速、操作簡單和可回收等優(yōu)點，在生物醫(yī)學、生物檢測等相關(guān)領(lǐng)域具有十分廣闊的前景。

2.3 癌癥診斷應(yīng)用

21世紀，癌癥已嚴重地影響了人類健康，目前對于癌癥的診斷、篩查手段主要有CT和核磁共振檢查等，但是無論哪種檢測方法對于身體都是有一定的傷害。有報道指出，癌細胞內(nèi)H2O2的含量明顯高于人體正常細胞內(nèi)H2O2的含量［68］，可以通過對H2O2的含量檢測實現(xiàn)對癌癥的診斷做到早期干預(yù)和治療。Zhang等［69］通過將多孔鉑納米粒子原位生長在氧化石墨烯的表面獲得了具有較強過氧化物酶活性的納米酶，成功對乳腺癌細胞（MCF-7）中的H2O2進行比色檢測。2021年，Lian等［70］通過調(diào)節(jié)聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）作為不同的模板劑，設(shè)計了一種雙金屬硫化物NiCo2S4（PVP）和NiCo2S4（CTAB）納米材料，并證明NiCo2S4（PVP）NP表現(xiàn)出優(yōu)異的過氧化物酶活性和高特異性。NiCo2S4（PVP）NP具有優(yōu)異的催化活性的主要可能歸因于其具有較高的Ni/Co比，而較高的特異性則歸因于TMB的陽離子與NiCo2S4（PVP）NP陰離子之間的強靜電驅(qū)動協(xié)同作用，在較強的靜電驅(qū)動作用下進行檢測可以在一定程度上增強其特異性。雙金屬硫化物的構(gòu)建也使NiCo2S4（PVP）NP穩(wěn)定性在一定程度上有所增強。以NiCo2S4（PVP）NP基納米酶模擬物作為傳感平臺，可以實現(xiàn)對H2O2的高靈敏、高選擇檢測，在具有良好的生物相容性的同時生物毒性較低，可以檢測人乳腺癌（MDA-MB-231）細胞中產(chǎn)生的H2O2，這為建立高特異性納米酶提供了新的方向和思路。

2.4 病毒、重金屬檢測應(yīng)用

納米酶還可用于對病毒、重金屬離子等的檢測。Khoris等［71］通過采用自組裝的方法制備了蛋白質(zhì)-無機銅納米花作為納米酶，并通過自組裝和納米共沉淀制備了TMB-NP包覆PLGA納米囊泡作為信號放大源，該方法用于高選擇和高靈敏度地檢測流感病毒（IV）/A，在緩沖液和血清中的檢出限分別低至32.37 pg/L和54.97 pg/L，該方法還可檢測到臨床分離的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）IV/A/H3N2和刺突蛋白，檢出限分別為17 pfu/ml和143 fg/L，實現(xiàn)了較高靈敏度的檢測。Khoris等的方法為各種呼吸道感染病毒的檢測提供了一個可靠、易于適應(yīng)且高靈敏的檢測平臺。Buyuksunetci等［72］合成了具有磁性的γFe2O3納米酶，并通過比色法檢測了SARS-CoV-2，同時也將其應(yīng)用于實際樣品檢測，得到的結(jié)果與聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）檢測法一致，同時該方法也可以很好地應(yīng)用于新冠病毒α型的變異檢測，該檢測系統(tǒng)為新型冠狀病毒感染（COVID-19）疑似病例的診斷和篩查提供了強有力的支持和保障。如今，公眾越來越注重健康和環(huán)保，所以快速、高靈敏度和高選擇性地對水中有毒物質(zhì)進行檢測也具有重要意義。Zhang等［73］通過化學鍵合成了rGO/PEI/Au納米酶，當溶液中存在微量Cr6+離子時，在納米酶的催化下，可以觸發(fā)TMB與H2O2的反應(yīng)，從而產(chǎn)生視覺上的變化，實現(xiàn)可視化檢測，檢測限低至2.14 nmol/L；Borthakur等［74］采用溶劑熱的方法合成了CuS/prGO和NiS/p-rGO納米酶，當H2O2存在時，納米酶可以催化其氧化TMB，而Hg（II）存在時可以抑制納米酶的氧化，阻斷催化活性位點，降低催化效率，從而達到可視化檢測的目的，合成的CuS/prGO和NiS/p-rGO納米酶對Hg（II）的靈敏度可達13.05 nmol/L和48.73 nmol/L。

3 總結(jié)與展望

本文主要對常見幾種標志物——乙酰膽堿、膽固醇和葡萄糖的檢測進展和檢測原理以及癌癥的早期篩查和診斷進行了相關(guān)綜述和介紹，同時也對其他方面如病毒和重金屬離子的相關(guān)檢測進行了介紹和分析，這將為生物體內(nèi)其他標志物的檢測以及醫(yī)學上檢測和早期診斷提供了有力支持和保障。

目前基于納米酶在生物傳感領(lǐng)域研究與應(yīng)用的綜述很多，但是都僅給出了基于納米酶在傳感領(lǐng)域的相關(guān)檢測應(yīng)用和一些納米酶的進展，并未全面給出基于納米酶的比色生物傳感器的相關(guān)檢測機理，本文綜述了納米酶的相關(guān)典型分類以及對生物物質(zhì)的檢測原理和相關(guān)機理，同時也對目前基于納米酶的比色生物傳感器總結(jié)出以下問題并進行展望。

3.1 現(xiàn)存問題

作為天然酶替代物的納米酶與底物的特異性關(guān)系尚未很好地解決；目前存在的納米酶的反應(yīng)類型對于所有酶反應(yīng)來說還不夠全面；納米酶的生物毒性以及生物相容性還有待進一步探索。

3.2 展望

可以通過引入一些配體（如適配體或分子聚合物等），采用底物結(jié)合特異性較高的材料進行復(fù)合，擴大可適用的催化條件等以提高納米酶與底物的特異性關(guān)系。目前納米酶的反應(yīng)類型主要有氧化還原、水解等，未來需要對于不同納米酶種類的反應(yīng)進行分類研究，進一步增加納米酶的類酶種類，以適應(yīng)更多的酶反應(yīng)。由于納米酶在未來是面向生物檢測，所以在提高納米酶的酶活性的同時也要考慮其生物相容性、生物毒性，以及是否會對環(huán)境造成污染，也可以對納米酶進行適當?shù)谋砻嫘揎棧瑺幦⊙兄瞥鼍G色、環(huán)保的納米酶以更好地應(yīng)用于生物醫(yī)學檢測。