生物催化不對(duì)稱還原制備氟代手性醇*

烏雅罕 吳晶晶 吳范宏

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海綠色氟代制藥工程技術(shù)研究中心，上海 201418）

多種藥物及藥物活性成分中間體中含有氟代手性醇結(jié)構(gòu)，例如化療止吐藥物阿瑞吡坦［1-2］、新型降血脂藥物依替米貝［3-5］、治療非小細(xì)胞肺癌藥物克唑替尼（Crizotinib）［6-7］、新型DP1拮抗劑［8］和抗凝劑替格瑞洛［9］等藥物前體結(jié)構(gòu)中都有氟代手性醇片段（表1）。因此，氟代手性醇類化合物的合成在手性藥物合成中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

Table 1 Application of fluorine-containing chiral alcohols in pharmaceutical synthesis表1 氟代手性醇在藥物合成中的應(yīng)用

酮的不對(duì)稱還原制備光學(xué)活性醇類化合物的一類基本反應(yīng)，通過(guò)不對(duì)稱催化還原前手性氟代酮類化合物是合成氟代手性醇類化合物的高效方法之一［10］，近年來(lái)取得顯著進(jìn)展。根據(jù)催化劑的種類不同，可以將不對(duì)稱還原方法分為化學(xué)催化還原法和生物催化還原法。與化學(xué)催化還原法相比，生物催化還原法，特別是酶催化法具有立體選擇性高、副反應(yīng)少、反應(yīng)條件溫和、無(wú)衍生產(chǎn)物、無(wú)需復(fù)雜的分離純化、減少資源消耗及廢物的產(chǎn)生、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)［11］，是合成氟代手性醇的理想方法［12］。生物催化還原法目前已廣泛應(yīng)用于藥物合成領(lǐng)域，例如抗癌藥物克唑替尼［13］、降血脂藥物依替米貝［14］、白三烯受體拮抗劑孟魯司特鈉［15］、降脂藥物瑞舒伐他汀［16］等藥物的關(guān)鍵手性中間體都可通過(guò)生物催化還原法高效獲得。本文對(duì)近幾年來(lái)生物催化還原氟代酮類化合物的研究工作，包括純化酶催化法和全細(xì)胞催化法進(jìn)行梳理和總結(jié)，旨在為高效、高立體選擇性合成手性氟代醇類藥物的研究提供新思路和新方法。

1 純化酶催化法

純化酶催化法是一種使用分離純化或過(guò)表達(dá)的酶催化還原底物的方法。經(jīng)過(guò)分離純化的純化酶催化的還原反應(yīng)對(duì)映選擇性高，可耐受高底物濃度，且體系干凈，易于分離產(chǎn)物［20-21］。

1.1 脫氫酶催化不對(duì)稱還原氟化酮

短乳桿菌（Lactobacillus brevis）中的乙醇脫氫酶LbADH曾被用于還原各類前手性酮［22］。LbADH的分子質(zhì)量為105 ku，由4個(gè)相同的亞基組成，屬于短鏈脫氫酶。2013年，Borzecka等［23］研究了LbADH催化還原各類氟代芳香酮的活性，得到了一系列具有高光學(xué)純度的（S）-氟化醇（表2，條目1）。在此基礎(chǔ)上，Rodrígue等［24］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，單鹵代化合物活性最強(qiáng)，三鹵代化合物活性最低（表2，條目2）。但是低（酶）活性并不一定意味著低轉(zhuǎn)化率，α取代的單氟，偕二氟及三氟苯乙酮均有高轉(zhuǎn)化率（轉(zhuǎn)化率（con.）>90%）及高對(duì)映選擇性（對(duì)映體過(guò)量（e.e.）值>99%）。

Table 2 Asymmetric reduction of fluorinated ketones using biocatalyst表2 利用生物催化劑不對(duì)稱還原氟代酮

最早，Noling等［25］發(fā)現(xiàn)，丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）的乙醇脫氫酶（CaADH）可不對(duì)稱催化還原羰基。2015年，Panigrahi等［26］利用CaADH對(duì)映選擇性地催化還原了β-酮-α,α-二氟烷基膦酸鹽（表2，條目3），該化合物是在化學(xué)生物學(xué)和藥物化學(xué)中具有相當(dāng)大價(jià)值的磷酸酶惰性磷酸鹽替代物［27］。結(jié)果顯示，CaADH表現(xiàn)出良好的產(chǎn)率（72%~93%）及較高的對(duì)映選擇性（e.e.值93%~99%）。且通過(guò)葡萄糖脫氫酶循環(huán)再生輔酶NADPH。2020年，Kudalkar等［28］又發(fā)現(xiàn)了CaADH還可以催化還原另一類含氟化合物，即對(duì)取代芳基三氟甲基酮（表2，條目4），其中α,α,α-三氟苯乙酮在CaADH催化下還原得到（S）-醇，其e.e.值為99%，產(chǎn)率為95%。

此外，赤紅球菌（Rhodococcus ruber）也具有催化還原酮的活性［29］。其中具有該活性的酶為乙醇脫氫酶ADH-A，該酶是由38 ku的亞基組成的同型二聚體，與來(lái)源于紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）的乙醇脫氫酶ReADH顯示出相似的亞單位大?。?8 ku），并且含有中鏈脫氫酶所述的緊密結(jié)合的鋅［30］。金屬在穩(wěn)定酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)以抵抗熱、極端pH和變性方面起著重要作用。2013年，Borzecka等［23］利用ADH-A催化還原得到了各類光學(xué)純（R）-氟化醇（表2，條目5）。通過(guò)該方法得到的產(chǎn)物（R）-2-溴-1-（4-氟苯基）乙醇是膽固醇吸收抑制劑（CAI）的前體［31］。隨后，K?dziora等［32］進(jìn)一步研究了ADH-A對(duì)α-氯-α-氟代苯乙酮的催化活性（表2，條目6）。結(jié)果顯示，ADH-A提供了良好的對(duì)映體選擇性，但非對(duì)映選擇性較低。非對(duì)稱催化還原得到二鹵代醇是許多有價(jià)值化合物的化學(xué)合成前體。2021年，Liu等［33］提出利用親水性聚多巴胺（PDA）殼包裹住源于紅色紅球菌的乙醇脫氫酶ADH及疏水性樹(shù)枝狀有機(jī)硅納米顆粒（DON）獲得兩親性核殼催化劑DON@ADH@PDA。用DON@ADH@PDA還原對(duì)氟苯乙酮和對(duì)三氟甲基苯乙酮得到其S型醇，具有良好的產(chǎn)率（86%~95%）和優(yōu)異的對(duì)映選擇性（e.e.值為99%）（表2，條目7）。內(nèi)疏水核提高了選擇性和催化活性，外親水殼提高了穩(wěn)定性和分散性。此外DON@ADH@PDA可以通過(guò)離心很容易地回收，5次循環(huán)后其催化產(chǎn)率仍然達(dá)到70%左右，有效提高了生物酶的利用率，降低成本。

（S）-3,5-雙三氟甲基苯乙醇已被納入目前正在臨床評(píng)估的許多拮抗劑中。早在2006年，Pollard等［34］就曾利用ReADH催化還原3,5-雙三氟甲基苯乙酮，得到（S）-3,5-雙三氟甲基苯乙醇（表2，條目8），轉(zhuǎn)化率>98%和e.e.值>99.9%。ReADH的分子質(zhì)量為160 ku，是由4個(gè)相同亞基組成的中鏈脫氫酶。該方法對(duì)輔酶再生系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，早期以甲酸脫氫酶為輔酶再生酶［35］，而葡萄糖脫氫酶（GDH）的熱穩(wěn)定性更好、活性更強(qiáng)，有效提高了底物濃度及時(shí)空產(chǎn)率。

在異丙醇作為氫供體的情況下，賴氏菌（Leifsoniasp.）的乙醇脫氫酶LsADH可對(duì)酮進(jìn)行不對(duì)稱還原［36］。LsADH的分子質(zhì)量為100 ku，由4個(gè)相同的亞基組成。氨基酸序列與已知的短鏈醇脫氫酶具有30%~50%的同源性。LsADH序列和LbADH近似，在37位具有天冬氨酸殘基，該殘基在決定脫氫酶對(duì)NADH的偏好中起著關(guān)鍵作用，因此LsADH是NADH依賴型脫氫酶。2012年，Itoh等［37］報(bào)道了LsADH在異丙醇（IPA）-水介質(zhì)中進(jìn)行對(duì)映選擇性生物催化還原氟化酮的例子。使用異丙醇輔酶再生系統(tǒng)，成本低、底物范圍廣、對(duì)映體選擇性高。LsADH催化還原α,α,α-三氟苯乙酮得到相應(yīng)的S型醇，其e.e.值為99%，轉(zhuǎn)化率為100%（表2，條目9）。這種光學(xué)純度和轉(zhuǎn)化率水平足以滿足工業(yè)應(yīng)用。

早期，Machielsen等［38］在超高溫古生菌（hyperthermophilic archaeon）強(qiáng)烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus）中發(fā)現(xiàn)了一種新的NADH依賴型乙醇脫氫酶PfADH。隨后，Zhu等［39］進(jìn)一步探索了PfADH催化還原氟代酮的對(duì)映選擇性（表2，條目10），該體系利用葡萄糖脫氫酶和葡萄糖實(shí)現(xiàn)輔酶再生。結(jié)果顯示，PfADH催化還原各類氟取代芳香酮均具有極好的對(duì)映選擇性（e.e.值>99%）。在此基礎(chǔ)上，Zhu等［40］以更加經(jīng)濟(jì)的異丙醇作為氫供體實(shí)現(xiàn)輔酶NADH再生。通過(guò)該方法催化還原2-氯-4'-氟代苯乙酮和2-氯-2',4'-二氟苯乙酮得到了其相應(yīng)的（R）-醇（表2，條目11），該方法具有高產(chǎn)率（89%~92%）及高立體選擇性（e.e.值為98%~99%）。不對(duì)稱還原得到的氯醇是合成具有醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)用途的生物活性化合物的重要中間體［41-45］。

Pennacchio等［46］曾在極端嗜熱耐鹽的嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）HB27中發(fā)現(xiàn)了一種新型乙醇脫氫酶TtADH。TtADH是一種四聚體酶，由256個(gè)氨基酸組成，屬于短鏈脫氫酶。該生物酶具有顯著的嗜熱性和熱穩(wěn)定性，且對(duì)常見(jiàn)有機(jī)溶劑有良好的耐受性。利用TtADH催化還原2,2,2-三氟苯乙酮得到高光學(xué)純度的（R）-2,2,2-三氟苯乙醇（e.e.值為93%）（表2，條目12）。輔酶NADH可以通過(guò)嗜熱桿菌ADH（BsADH）高效原再生。

Lavandera等［47］從矢野鞘氨醇菌（Sphingobium yanoikuyae）中分離出一種NADPH依賴型短鏈脫氫酶SyADH，也可用來(lái)還原一些常見(jiàn)羰基化合物（丙酮、乙醛、甲基異丁基酮（methyl isobutyl ketone，MIBK）、丙酮酸）。隨后，K?dziora等［32］發(fā)現(xiàn)SyADH催化還原α-氯-α-氟代苯乙酮時(shí)，相較于其他乙醇脫氫酶（ADH-A、RasADH、LbADH）可提供最高的de值（45%），但是e.e.值較低（59%）（表2，條目13）。α-氯-α-氟代醇在有機(jī)合成中有許多應(yīng)用［48］。

2019年González-Martínez等［49］發(fā)現(xiàn)，Ras-ADH可催化還原一系列1-芳基-2,2,2-三氟乙酮，以高轉(zhuǎn)化率和高選擇性獲得（R）-醇。Ras-ADH為來(lái)源于羅爾斯通氏菌屬（Ralstoniasp.）DSM 6428的NADPH依賴型乙醇脫氫酶［50］。該體系通過(guò)葡萄糖脫氫酶實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH的再生。通過(guò)該方法可還原得到組織蛋白酶K抑制劑奧達(dá)那卡替布（Odanacatib（MK-0822））的重要片段1-（4-溴苯基）-2,2,2-三氟乙醇（表2，條目14）。

如上述所示，在藥物合成領(lǐng)域中，乙醇脫氫酶的應(yīng)用十分廣泛，并已應(yīng)用到許多藥物關(guān)鍵中間體的催化還原制備過(guò)程。例如，克唑替尼是一種常見(jiàn)的抗癌藥物［51］，合成該藥物時(shí)最關(guān)鍵的一步為不對(duì)稱還原制備（S）-1-（2,6-二氯-3-氟苯基）。用常規(guī)化學(xué)方法還原時(shí)，需要利用硼氫化鈉還原后再進(jìn)行手性拆分，過(guò)程復(fù)雜、收率較低（32%）［52］。為進(jìn)一步提高收率、簡(jiǎn)化反應(yīng)過(guò)程，郭紅顏［53］提出了利用乙醇脫氫酶偶聯(lián)甲酸脫氫酶催化還原制備（S）-1-（2,6-二氯-3-氟苯基）乙醇的方法（表2，條目15）。通過(guò)該催化體系有效地將收率提高至50%，且產(chǎn)物純度為100%。體系中的甲酸脫氫酶用于輔酶NADH的再生。在此基礎(chǔ)上，邵雷課題組［54］進(jìn)一步優(yōu)化了輔酶再生系統(tǒng)，以葡萄糖脫氫酶為輔酶再生酶。用該方法催化還原2,6-二氯-3-氟苯乙酮，得到高轉(zhuǎn)化率（93.75%）、高光學(xué)純度（e.e.值為99%）的（S）-1-（2,6-二氯-3-氟苯基）（表2，條目16）。2019年，林濤等［55］發(fā)明了一種新的分離純化方法，通過(guò)此方法可有效地從酶轉(zhuǎn)化液中分離目標(biāo)產(chǎn)物，具有高收率及高除菌率，整個(gè)提取過(guò)程中只用到水作為溶劑，并且使用了更加廉價(jià)易得的異丙醇作為氫供體再生輔酶，使反應(yīng)更加經(jīng)濟(jì)。還原1-（2,6-二氯-3-氟苯基）乙酮，得到高純度（99%以上）的（S）-1-（2,6-二氯-3-氟苯基）（表2，條目17）。

大多數(shù)生物酶具有不耐高溫的缺點(diǎn)，為了尋找適用于極端條件的乙醇脫氫酶，F(xiàn)riest等［56］對(duì)能夠承受高溫的超嗜熱古菌展開(kāi)了研究，并從中分離出了NADH依賴型乙醇脫氫酶SsADH10。該酶的最佳反應(yīng)溫度為80℃，可催化還原氟比洛芬醛得到相應(yīng)S型醇（表2，條目18），具有高對(duì)映選擇性（e.e.值97%），但是收率一般（70%）。該體系以乙醇作為助溶劑及輔酶再生的氫供體。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫可使產(chǎn)物沉淀并通過(guò)過(guò)濾收集?；厥盏腟sADH10可以循環(huán)利用（經(jīng)歷5次循環(huán)，e.e.值仍為94%~96%）。

1.2 還原酶催化不對(duì)稱還原氟化酮

研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌（Bacillussp.）EU0013中的酮還原酶具有良好的立體選擇性和高底物濃度耐受性［57］。為進(jìn)一步提高對(duì)映選擇性，Ni等［58］從菌株中分離出一種NADPH依賴型醛酮還原酶（YtbE），該體系以葡萄糖脫氫酶為輔酶再生酶。YtbE屬于醛酮還原酶（AKR）超家族，其一級(jí)結(jié)構(gòu)與其他AKR超家族的還原酶具有47%~34%的同源性。YtbE作為一種通用的還原酶，對(duì)含氟酮類化合物也有良好的產(chǎn)率及光學(xué)選擇性。其中，α,α,α-三氟苯乙酮被還原得到相應(yīng)的R型醇，其e.e.值為99%，產(chǎn)率為100%。4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯被還原為高光學(xué)純度（e.e.值為99%）的（R）-4,4,4-三氟-3-羥基丁酸酯（表2，條目19），該化合物為抗抑郁藥物貝氟沙通的中間體。

與從土壤樣本中進(jìn)行耗時(shí)費(fèi)力的傳統(tǒng)篩選相比，基因組挖掘是一種更有效、更有前途的方法。2011年，Wang等［59］通過(guò)對(duì)羰基還原酶的基因組挖掘，從天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）中發(fā)現(xiàn)了一種NADH依賴型還原酶（ScCR）。以異丙醇作為NADH再生的氫供體，該酶對(duì)含氟酮類化合物具有極高的對(duì)映選擇性（e.e.值>99%）（表2，條目20）。ScCR可催化底物濃度高達(dá)600 g/L，顯示出非常高的底物耐受性和優(yōu)異的立體選擇性，表明ScCR具有工業(yè)應(yīng)用潛力。

2015年，Xu等［60］發(fā)現(xiàn)了一種羰基還原酶，即漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）中的DhCR。DhCR屬于SDR家族，是由34 ku亞基組成的同型二聚體。此酶為具有足夠活性且足夠穩(wěn)定的NADPH依賴型羰基還原酶，用于還原三氟苯乙酮得到其S型醇，產(chǎn)率為90%，e.e.值大于99%（表2，條目21）。使用葡萄糖及葡萄糖脫氫酶實(shí)現(xiàn)輔酶再生。還原酶DhCR在合成有價(jià)值的藥用α鹵代醇方面具有潛力。

之后，Contente等［61］從非傳統(tǒng)酵母畢赤酵母CBS 5766的基因組中鑒定出一種新的NADPH依賴性苯二酰還原酶（KRED1-Pglu）。該酶有效地將苯偶酰對(duì)映選擇性還原為（S）-安息香。隨后Contente等［62］發(fā)現(xiàn)，KRED1-Pglu催化還原2,2,2-三氟-1-苯基乙酮和2,2,2-三氟-1-（噻吩-2-基）乙酮均顯示較高的轉(zhuǎn)化率和對(duì)映選擇性（表2，條目22）。2021年Rabuffetti等［63］發(fā)現(xiàn)KRED1 Pglu可用于選擇性催化還原1,2-二酮衍生物。當(dāng)酮的對(duì)位有一個(gè)氟原子時(shí)，表現(xiàn)出高反應(yīng)性，產(chǎn)率高于97%，兩個(gè)羰基的反應(yīng)性相似，均具有高對(duì)映選擇性（e.e.值>98%）（表2，條目23）。這使得KRED1-Pglu成為一種適合制備光學(xué)純?chǔ)亮u基酮的催化劑。

2016年，趙志強(qiáng)等［64］介紹了一種用于合成（S）-1-（2,6-二氯-3-氟苯基）乙醇的新酮還原酶KRED82（表2，條目24），此酶具有高對(duì)映選擇性（e.e.值>99.9%）且可催化底物濃度高達(dá)621 g/L。（S）-1-（2,6-二氯-3-氟苯基）乙醇是合成克唑替尼（Crizotinib）的中間體。該工藝開(kāi)創(chuàng)了酶法合成（S）-1-（2,6-二氯-3-氟苯基）乙醇的新途徑，具有非常高的應(yīng)用價(jià)值。

2018年，陳恬等［65］開(kāi)發(fā)了一種新型羰基還原酶，可特異性還原2-氯-1-（6-氟-3,4-二氫-2H-1-苯并吡喃-2-基）乙酮（CLK）得2-氯-1-（6-氟-3,4-二氫-2H-1-苯并吡喃-2-基）乙醇（CLA）。CLA是合成心血管藥物鹽酸奈必洛爾的前體。以異丙醇作為氫供體，所有還原酶均為NADH依賴型，（R）-CLK在R-羰基還原酶的作用下，得到（R，R）-CLA產(chǎn)物；在S-還原酶的作用下，得到（R，S）-CLA產(chǎn)物；（S）-CLK在（R）-羰基還原酶的作用下，得到（S，R）-CLA產(chǎn)物；（S）-CLK在（S）-羰基還原酶的作用下，得到（S，S）-CLA產(chǎn)物（表2，條目25）。上述4種構(gòu)型得到的產(chǎn)物CLA純度≥98%，e.e.值≥99%，收率≥95%。該方法簡(jiǎn)單易操作，避免了化學(xué)還原法所需的復(fù)雜分離過(guò)程，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（CFPL）是合成抗凝劑替格瑞洛的重要手性中間體，替格瑞洛用于預(yù)防成人急性冠脈綜合征動(dòng)脈粥樣硬化［66］。2019年，竺偉等［67］首次報(bào)道了合成（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的生物催化還原方法（表2，條目26）。使用來(lái)自芳香新鞘氨醇菌的KRED突變體可以達(dá)到180 g/L的底物濃度，但是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。因此，為了提高合成效率，2022年，He等［68］在副布爾霍爾德菌（Paraburkholderia phymatum）STM815中發(fā)現(xiàn)了一種新的NADH依賴型還原酶PpKR8。將PpKR8和葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中的共表達(dá)可催化還原高達(dá)300 g/L的2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙酮（CFPO）完全轉(zhuǎn)化為（R）-CFPL，e.e.值大于99.9%（表2，條目27）。此外，該方法的反應(yīng)速率快，輔酶用量低，表明PpKR8介導(dǎo)的生物還原技術(shù)具有極好的工業(yè)潛力。

（R）-［3,5-雙（三氟甲基）苯基］乙醇（（R）-3,5-BTPE）是合成NK-1受體拮抗劑安普立坦、羅拉平坦和福薩平坦的關(guān)鍵手性中間體［69］。2019年，Tang等［70］開(kāi)發(fā)了一種高效且經(jīng)濟(jì)的酶法合成（R）-［3,5-雙（三氟甲基）苯基］乙醇的方法，即利用Leifsoniasp.S749中的羰基還原酶KR01將3,5-雙（三氟甲基）苯乙酮（BTAP）轉(zhuǎn)化為（R）-3,5-BTPE（表2，條目28），具有良好的活性和對(duì)映選擇性。在最優(yōu)反應(yīng)條件下，KR01可將600 g/L 3,5-BTAP生物還原為（R）-3,5-BTPE（e.e.>99.9%），轉(zhuǎn)化率為98.3%，產(chǎn)率為59 g/L/h。此酶為NADPH依賴型羰基還原酶，利用異丙醇再生輔酶NADPH。此外，KR01可在含有90%異丙醇的反應(yīng)混合物中重復(fù)使用多達(dá)7次。這是迄今為止報(bào)道的羰基還原酶生物還原3,5-BTAP的最高底物負(fù)荷和生產(chǎn)率，該方法是一種高效且經(jīng)濟(jì)的（R）-3,5-BTPE生產(chǎn)工藝。

2020年，Raynbird等［71］利用商用酮還原酶KRED催化還原了一系列用于合成藥物活性成分的關(guān)鍵手性醇中間體，以異丙醇作為共基質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH的再生。其中酮還原酶將將2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙酮還原為相應(yīng)（S）-醇（轉(zhuǎn)化率96%，e.e.值>99.5%）（表2，條目29）；3,5-雙（三氟甲基）苯乙酮還原為相應(yīng)（R）-醇（轉(zhuǎn)化率90%，e.e.值>99.5%），該化合物用于合成阿瑞吡坦。這有力地證明了商用KRED在用于合成手性氟代醇類藥物時(shí)的潛在價(jià)值。

2 全細(xì)胞催化法

全細(xì)胞生物催化劑與純化酶相比省去了酶的分離純化步驟，且無(wú)需添加額外的輔助因子，因此操作過(guò)程簡(jiǎn)單、反應(yīng)成本低［72］。不僅如此，許多微生物中的酶在細(xì)胞外容易失活，僅在胞內(nèi)有較強(qiáng)的活性，直接全細(xì)胞催化可規(guī)避此類問(wèn)題［73］。

2.1 微生物細(xì)胞催化不對(duì)稱還原氟化酮

近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，人們一直在探索利用面包酵母進(jìn)行生物催化還原反應(yīng)［74］，在用于不對(duì)稱還原前手性羰基的生物催化劑中，面包酵母（baker’s yeast）表現(xiàn)出廣泛的底物特異性和良好的對(duì)映選擇性［75］。早期，Yadav等［76］使用發(fā)酵的面包酵母制備了（R）-2-疊氮-1-（4-氟苯基）乙醇，產(chǎn)率為90%，e.e.值為98%（表2，條目30）。疊氮醇是腎上腺素能藥物的關(guān)鍵中間體［77］，其不對(duì)稱合成十分重要。

同樣，白地霉（G. candidum）在催化還原酮類化合物中的應(yīng)用也十分廣泛，它具有對(duì)映選擇性好、粗酶制備容易、易保存、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［78］。最早，Nakamura等［79］報(bào)道了白地霉催化還原2,2,2-三氟乙酰丙酮，獲得相應(yīng)的（S）-醇，e.e.值為98%、產(chǎn)率>99%。隨后，Matsuda等［80］利用白地霉催化還原各類氟代酮化合物，得到了具有優(yōu)異光學(xué)純度的手性氟化醇（表2，條目31）。在此基礎(chǔ)上，de Oliveira Lopes等［81］將白地霉在固定化后，在連續(xù)流動(dòng)條件下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，明顯縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了反應(yīng)效率。白地霉催化還原4'-Br-2,2,2-三氟苯乙酮和2,2,2-三氟苯乙酮時(shí)均表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)化率和較好的對(duì)映選擇性（表2，條目32）。2018年，王普等［82］利用白地霉催化還原2,6-二氯-3-氟苯乙酮合成（S）-1-（2,6-二氯-3-氟苯基）乙醇（表2，條目33），產(chǎn)率為93%，e.e.值>99.9%。（S）-1-（2,6-二氯-3-氟苯基）乙醇是克唑替尼的關(guān)鍵中間體。

依替米貝（Ezetimibe）是用于治療原發(fā)性高膽固醇血癥的有效藥物，可降低冠心病風(fēng)險(xiǎn)［83-84］。合成依替米貝的關(guān)鍵步驟即為不對(duì)稱催化還原氟代酮。2010年，Kyslíková等［85］首次發(fā)現(xiàn)了紅球菌（Rhodococcus fascians）M022可不對(duì)稱還原底物（3R，4S）-1-（4-氟苯基）-3-［3-（4-氟苯基）-3-氧代丙基］-4-（4-羥基苯基）氮雜環(huán)丁烷-2-酮制備（（3R，4S）-1-（4-氟苯基）-3-［（3S）-3-（4-氟苯基）-3-羥基丙基］-4-（4-羥基苯基）-2-氮雜環(huán)丁烷酮（依替米貝），轉(zhuǎn)化率可達(dá)95%，e.e.值為99.9%（表2，條目34）。這是首次報(bào)道利用微生物不對(duì)稱催化還原制備依替米貝。通過(guò)該方法，成功地將兩個(gè)化學(xué)步驟簡(jiǎn)化成一個(gè)單一的生物轉(zhuǎn)化。

同年，?wizdor等［86］首次發(fā)現(xiàn)了點(diǎn)火雙孢菌（Didymosphaeria igniaria）KCH 6670菌株的脫氫酶活性。該菌株將三氟苯乙酮還原為相應(yīng)的S型醇，產(chǎn)率為100%，e.e.值為82%（表2，條目35）。

生物催化法的一個(gè)明顯的缺點(diǎn)是反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，而微波輻射是一種可用于縮短反應(yīng)時(shí)間的有效工具［87-89］。Araujo等［90］報(bào)道了脂肪酶可以通過(guò)微波顯著縮短反應(yīng)時(shí)間，獲得類似于軌道振蕩的產(chǎn)率。以此為靈感，Ribeiro等［91］提出了微波條件下用嗜熱細(xì)菌（芽孢桿菌FPZSP005、枯草桿菌FPZSP088、地衣芽孢桿菌FPZSP055和BC-FPZSP051）生物還原氟代苯乙酮（表2，條目36），以此來(lái)縮短反應(yīng)時(shí)間。還原反應(yīng)在微波輻射下進(jìn)行，芽孢桿菌屬的嗜熱細(xì)菌可適度地催化還原氟代酮，產(chǎn)率在26%~42%范圍內(nèi)，e.e.值為5%~62%。當(dāng)反應(yīng)在常規(guī)加熱下進(jìn)行時(shí)，它們顯示出高轉(zhuǎn)化率和高對(duì)映選擇性（e.e.值>99%）。這是首次將微波輻射與嗜熱細(xì)菌應(yīng)用于生物催化的研究。雖然微波輻射法反應(yīng)性一般，但是有效縮短了反應(yīng)時(shí)間，是一個(gè)很有潛力的方法。

（S）-［3,5-雙（三氟甲基）苯基］乙醇（（S）-BTPE）是合成受體拮抗劑和抗抑郁劑的關(guān)鍵中間體，用于治療一系列中樞和樹(shù)枝神經(jīng)抑制［92］。2020年，Wang等［93］從土壤樣品中分離到鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）LZ1菌株，該菌株可不對(duì)稱催化還原3,5-雙（三氟甲基）苯乙酮得到（S）-［3,5-雙（三氟甲基）苯基］乙醇，收率為94%，e.e.值為99.6%。鞘氨醇單胞菌LZ1還可以不對(duì)稱地將多種前手性氟化酮還原為相應(yīng)的光學(xué)醇，并具有良好的對(duì)映選擇性（e.e.值>97%）（表2，條目37）。2021年，Wang等［94］又從土壤樣品中分離到新的菌株，即膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）NQ1菌株，該菌株可以更高的產(chǎn)率催化還原得到（S）-［3，5-雙（三氟甲基）苯基］乙醇（（S）-BTPE），產(chǎn)率為99%，e.e.值為99%（表2，條目38）。對(duì)于其他大多數(shù)氟代酮類化合物也具有更高的產(chǎn)率及對(duì)映選擇性（e.e.值93%~99%）。鑒于上述結(jié)果，膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）NQ1可以高產(chǎn)率及高對(duì)映選擇性獲得重要醫(yī)藥中間體（S）-［3，5-雙（三氟甲基）苯基］乙醇，且具有較廣泛含氟化合物的底物范圍，在手性氟代醇的合成方面顯示出很高的潛力，可用于重要醫(yī)藥中間體的工業(yè)生產(chǎn)。

（S）-1-［2-（三氟甲基）苯基］乙醇是用于合成GSK461364的關(guān)鍵手性中間體，GSK461364是一種有效、選擇性的ATP競(jìng)爭(zhēng)型Plk1抑制劑［95］。2021年，Xiong等［96］利用林生地霉（Geotrichum silvicola）ZJPH1811在深共晶溶劑/環(huán)糊精體系中高效地生物催化還原合成了（S）-1-［2-（三氟甲基）苯基］乙醇，產(chǎn)率為75.6%，e.e.值>99.2%（表2，條目39）。在反應(yīng)體系中加入深共晶溶劑乙酰膽堿/半胱氨酸（ChAc/Cys）作為共溶劑，可加速傳質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞免受底物抑制，從而提高產(chǎn)率。與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，深共晶溶劑是更環(huán)保、更有效的助溶劑［97］。此外，甲基化-β-環(huán)糊精（MCD）和ChAc/Cys在生物還原過(guò)程中具有協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步提高了底物濃度和細(xì)胞膜通透性。與普通緩沖體系相比，新開(kāi)發(fā)的ChAc/Cys-MCD體系的底物負(fù)載量和產(chǎn)物收率分別提高了6.7倍和2.4倍。這是首次報(bào)道利用林生地霉生產(chǎn)（S）-1-［2-（三氟甲基）苯基］乙醇，并對(duì)深共晶溶劑和環(huán)糊精在生物催化中的協(xié)同效應(yīng)提供了有價(jià)值的見(jiàn)解。

（R）-1-［3-（三氟甲基）苯基］乙醇（（R）-MTFPEL）是制備（R）-3-（1-（3-（三氟甲基）苯基）乙氧基）氮雜環(huán)丁-1-甲酰胺等神經(jīng)保護(hù)化合物的關(guān)鍵手性砌塊［98］。2021年，Zhuang等［99］開(kāi)發(fā)了一種全細(xì)胞催化還原制備（R）-MTF-PEL的方法。采用可提供羰基還原酶的重組大腸桿菌BL21（DE3）-pET28a（+）-LXCAR-S154Y突變體將3'-（三氟甲基）苯乙酮還原為e.e.值>99.9%的（R）-MTF-PEL（表2，條目40）。羰基還原酶基因來(lái)自雷弗松氏菌（Leifsonia xyli）HS0904。添加表面活性劑吐溫-20可增加疏水化合物的水溶性，底物濃度比純緩沖溶液中的濃度增加了4.0倍。在反應(yīng)介質(zhì)中引入天然深共晶溶劑（NADES）氯化膽堿∶賴氨酸（ChCl∶Lys，摩爾比為1∶1），進(jìn)一步提高了生物催化效率。在構(gòu)建的吐溫-20/ChCl∶Lys體系中，底物濃度為200 mmol/L時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率達(dá)到91.5%，這是（R）-MTF-PEL生產(chǎn)中有史以來(lái)最高產(chǎn)率。表面活性劑和天然深共晶溶劑的組合策略在生物催化過(guò)程和手性醇的合成中具有巨大潛力。

2.2 植物細(xì)胞催化不對(duì)稱還原氟化酮

除了微生物全細(xì)胞催化還原，還可以利用植物細(xì)胞催化。使用植物作為催化劑的主要優(yōu)勢(shì)在于使用后易于處理（因?yàn)樗鼈冊(cè)跍睾偷姆磻?yīng)條件下可生物降解），以及以極低的成本獲得廣泛的適用性。此外，這些反應(yīng)系統(tǒng)不需要進(jìn)行費(fèi)力的培養(yǎng)或開(kāi)發(fā)操作，這些操作常見(jiàn)于微生物全細(xì)胞催化反應(yīng)［100］。

植物是分離酶的極好替代品，因?yàn)檠趸€原酶、輔助因子及其再生系統(tǒng)都位于植物內(nèi)部，可以避免添加昂貴的輔助因子。然而，這種方法的一個(gè)問(wèn)題是實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性，因?yàn)檫@些生物催化劑的性質(zhì)可能取決于它們的來(lái)源。此外，即使來(lái)自同一地區(qū)，也很難在一年內(nèi)獲得性能一致的生物催化劑。2010年，Suraèz-Franco等［101］發(fā)現(xiàn)了意大利甘藍(lán)（西蘭花）具有還原芳香醛的能力。在此基礎(chǔ)上，為了避免由于材料來(lái)源和年齡的變化而導(dǎo)致還原反應(yīng)的潛在不可再生性，Mohammadi等［102］使用了發(fā)芽的意大利甘藍(lán)種子代替新鮮切下的意大利甘藍(lán)莖來(lái)還原不同的前手性酮（表2，條目41）。因?yàn)榉N子可以從任何地點(diǎn)獲得，并且可以在一年中的任何時(shí)間在合適的條件下發(fā)芽，該方法是可重復(fù)的。結(jié)果顯示，發(fā)芽的意大利甘藍(lán)種子催化還原各類氟取代芳香酮均具有較好的對(duì)映選擇性（e.e.值87%~95%）。這個(gè)過(guò)程比傳統(tǒng)的化學(xué)試劑或微生物更有效，產(chǎn)生的廢物更少。這些生物催化劑的低成本和易獲得性表明了它們可以用于大規(guī)模制備重要的手性醇。

一般常用于不對(duì)稱催化還原羰基化合物的植物細(xì)胞都來(lái)自胡蘿卜［103］、芹菜［104］、小茴香［105］、黃瓜［106］、馬鈴薯［107］、豌豆［108］等植物，而使用入侵植物細(xì)胞催化不僅原料更加廉價(jià)易得，還可以進(jìn)一步解決生態(tài)問(wèn)題。入侵植物是目前最重要的現(xiàn)代生態(tài)問(wèn)題之一，其擴(kuò)散影響了生物多樣性的保護(hù)［109］。女貞是阿根廷中部分布最廣的入侵樹(shù)種之一，現(xiàn)在已經(jīng)成為森林中非常成功的入侵者，消滅了大部分原生植被［110］?？紤]到這些因素，Aimar等［111］啟動(dòng)了一個(gè)研究外來(lái)植物果實(shí)的項(xiàng)目，即探索外來(lái)入侵植物的果實(shí)能否成為新型生物催化劑，以便為它們找到一些實(shí)際用途。其中女貞的果實(shí)將對(duì)氟苯乙酮催化還原為相應(yīng)（S）-醇（轉(zhuǎn)化率90%，e.e.值97%），將對(duì)三氟甲基苯乙酮同樣催化還原為相應(yīng)（S）-醇（轉(zhuǎn)化率84%，e.e.值78%）（表2，條目42）。研究結(jié)果表明，女貞的果實(shí)有望成為生產(chǎn)關(guān)鍵中間體的生物催化劑。通過(guò)對(duì)野生外來(lái)植物的研究，為外來(lái)植物建立了一種新的應(yīng)用，尤其是那些沒(méi)有任何其他實(shí)際用途的物種。目前正在進(jìn)行進(jìn)一步的研究，探索這種新型廉價(jià)生物催化劑的新催化活性。

3 酮類底物的酶催化還原活性受氟取代基的影響

氟原子的原子半徑與氫原子類似，且氟為電負(fù)性最強(qiáng)的元素，由于氟原子的這些特殊性質(zhì)，化合物中引入氟原子可顯著改變其物理化學(xué)性質(zhì)［112］。下面討論將氟原子引入芳香酮及脂肪酮時(shí)，對(duì)它們生物催化還原反應(yīng)的影響。

3.1 芳香酮類底物的酶催化還原活性受氟取代基的影響

利用PfADH作為生物催化劑還原取代α氯代芳香酮時(shí)，4'位和2',4'位氟代可以提高產(chǎn)率及e.e.值，原因可能是酶的活性受電子和空間因素以及底物在水緩沖液中溶解度的影響［40］。利用LbADH催化還原苯乙酮類化合物時(shí)，α單氟代的還原效率約為苯乙酮的32倍，α,α-二氟代的還原效率約為苯乙酮的7.8倍，而α,α,α-三氟代苯乙酮的還原水平約為苯乙酮的0.2倍［24］。氟原子的吸電子效應(yīng)顯著增加了生物催化劑的反應(yīng)性，而空間位阻可能會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)性降低。α,α,α-三氟代苯乙酮雖酶催化活性低，但是其轉(zhuǎn)化率（con.>99%）及對(duì)映選擇性（e.e.>99%）都極好。將α-單氟代苯乙酮的苯環(huán)對(duì)位或間位進(jìn)行氟代時(shí)，不影響轉(zhuǎn)化率和對(duì)映選擇性，均具有極好的轉(zhuǎn)化率（con.>99%）和對(duì)映選擇性（e.e.>99%）［23］。同樣，ScCR催化還原苯乙酮時(shí)，α,α,α-三氟代后產(chǎn)率明顯提高，對(duì)映選擇性也有所提高［56］。相較于苯乙酮，DhCR催化還原α,α,α-三氟代苯乙酮的活性也同樣增強(qiáng)，且DhCR催化還原的產(chǎn)率及對(duì)映選擇性都較高［59］。

這種規(guī)律同樣存在于植物細(xì)胞催化還原中，發(fā)芽的甘藍(lán)種子催化還原苯乙酮類化合物時(shí)，對(duì)比苯乙酮與對(duì)氟苯乙酮和對(duì)三氟甲基苯乙酮發(fā)現(xiàn)，氟代可提高轉(zhuǎn)化率及對(duì)映選擇性。對(duì)比苯乙酮和α,α,α-三氟代苯乙酮發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律［102］。而利用女貞的果實(shí)催化還原苯乙酮，卻發(fā)現(xiàn)將苯乙酮進(jìn)行對(duì)氟取代或?qū)θ谆〈?，其轉(zhuǎn)化率和對(duì)映選擇性都有所降低［111］。

通過(guò)微生物細(xì)胞白地霉催化還原苯乙酮及α,α,α-三氟代苯乙酮時(shí)，都具有較好的對(duì)映選擇性［80］。當(dāng)苯乙酮的苯基被對(duì)氯苯基、噻吩基取代時(shí)，其對(duì)應(yīng)的三氟代酮的對(duì)映選擇性更強(qiáng)。單氟代苯乙酮及三氟代苯乙酮的催化還原產(chǎn)物的構(gòu)型相反，均具有較高的e.e.值（>99%），而二氟代的e.e.值較低（63%）。利用點(diǎn)火雙孢菌KCH6670催化還原苯乙酮及α,α,α-三氟代苯乙酮可得到構(gòu)型不同的醇，氟代使反應(yīng)速率變快，產(chǎn)率增加，但立體選擇性稍有降低［86］。

3.2 脂肪酮類底物的酶催化還原活性受氟取代基的影響

相較于乙酰乙酸乙酯，DhCR催化還原α,α,α-三氟乙酰乙酸乙酯的活性降低，但是仍具有較高的產(chǎn)率及對(duì)映選擇性［60］。ScCR的催化還原活性及轉(zhuǎn)化率和對(duì)映選擇性不受氟取代的影響［59］。

白地霉催化還原甲基己基酮、甲基庚基酮、甲基辛基酮及甲基壬基酮等脂肪酮時(shí)發(fā)現(xiàn)，將甲基三氟代后產(chǎn)率明顯提高，e.e.值有些下降，但是仍然具有很好的對(duì)映選擇性（e.e.值為96%~99%）［80］。

綜上所述，對(duì)于大對(duì)數(shù)生物催化劑，催化還原芳香酮及脂肪酮時(shí)，氟代酮的轉(zhuǎn)化率及對(duì)映選擇性更高。氟代底物可增加酶活性，使反應(yīng)速率提高，縮短反應(yīng)時(shí)間。只有少數(shù)的生物催化劑催化還原氟代酮時(shí)產(chǎn)率及對(duì)映選擇性稍有降低。

4 結(jié)論與展望

手性氟代醇片段常見(jiàn)于藥物及藥物前體結(jié)構(gòu)中，不對(duì)稱合成是這些藥物中間體合成過(guò)程中最關(guān)鍵的一步，因此如何高效綠色地進(jìn)行不對(duì)稱還原成為了近年研究的熱點(diǎn)。自20世紀(jì)50年代，生物催化法開(kāi)始運(yùn)用于藥物合成領(lǐng)域，因其綠色高效的特性引起了廣泛關(guān)注。生物催化酶分為6大類，分別為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶和合成酶。本文綜述的氧化還原酶具有高立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性且較其他化學(xué)催化劑綠色環(huán)保，所以生物酶成為了不對(duì)稱還原氟化酮的一種首選催化劑。但是大多數(shù)酶催化反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，生物酶及輔酶價(jià)格昂貴，因此未來(lái)酶催化反應(yīng)發(fā)展趨勢(shì)是縮短反應(yīng)時(shí)間，生物酶循環(huán)利用及開(kāi)發(fā)更高效經(jīng)濟(jì)的輔酶再生系統(tǒng)等。植物細(xì)胞相較于微生物細(xì)胞更加廉價(jià)易得，綠色環(huán)保，應(yīng)進(jìn)一步研究探索其不同部位的催化活性，提高催化穩(wěn)定性。