黃瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS2 克隆與表達調控

袁曉，楊盼迪，朱云娜，王玉昆，王斌

(韶關學院生物與農業(yè)學院/廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室，廣東韶關 512005)

非生物脅迫如干旱、重金屬、高低溫、鹽漬、水浸等會對植物的生長發(fā)育和地理分布、作物產量和品質等造成嚴重影響[1，2]。 隨著全球氣候變暖，各種極端天氣頻繁發(fā)生，加劇了非生物脅迫對農作物生產的影響[3]。 與動物可隨時移動不同，植物一旦在特定介質上固著，便不能自主移動[4]，因此，植物與動物應對非生物脅迫的方式有著很大不同，植物必須依靠自身的防御系統(tǒng)抵抗或適應非生物脅迫。 植物適應非生物脅迫的途徑主要包括:激活自身的抗氧化防御系統(tǒng)，誘導抗逆相關基因轉錄和蛋白積累，促進滲透物質的積累以保持細胞內外滲透平衡[5]。

在遇到非生物脅迫時，植物細胞內可溶性糖等滲透性物質的合成積累，被認為是植物增強非生物脅迫抗性的重要方式[6]。 增加細胞內滲透性物質的含量，能提高細胞滲透勢，增強植物對逆境脅迫的耐受性[7]。 棉子糖系列寡糖(raffinose family oligosaccharides， RFOs)是重要的滲透調節(jié)物質[8]，同時也是葫蘆科植物同化物的主要運輸形式[9]。 因此，RFOs 在葫蘆科植物中具有雙重作用，既起到滲透調節(jié)的作用，還負責同化物的運輸。 肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase，GolS)是催化RFOs 合成第一步反應的關鍵調節(jié)酶，直接催化肌醇和UDP-半乳糖形成肌醇半乳糖苷[6]。 因此，GolS 在調控RFOs 合成和增強葫蘆科植物抗逆性中具有重要作用。

黃瓜(Cucumis sativus)是葫蘆科黃瓜屬一年生攀援性草本植物，喜溫，是我國重要的經濟作物[10，11]。 黃瓜對高低溫、鹽堿等非生物脅迫的耐受能力較差，鹽脅迫和高低溫脅迫嚴重影響其生長發(fā)育，甚至降低采后黃瓜的品質和耐貯性，往往導致嚴重的經濟損失[12，13]。 據報道，黃瓜基因組中共含有4 個GolS基因，它們在多種非生物脅迫處理后在黃瓜葉片中顯著上調表達，其中GolS1表達上調能在低溫脅迫條件下促進同化物在韌皮部的裝載，提高葉片光合作用效率，促進RFOs 積累[9]。 低溫和干旱脅迫處理誘導黃瓜GolS4基因在葉片中的表達，過表達GolS4基因提高RFOs 含量，降低活性氧(reactive oxygen species， ROS)含量；相反，沉默GolS4基因表達的轉基因黃瓜在干旱脅迫處理后更容易萎蔫[14]。 這些研究結果表明，GolS基因在黃瓜抵抗低溫和干旱等非生物脅迫過程中具有重要作用。 采后黃瓜屬于離體器官，黃瓜GolS基因的功能在離體器官和非離體器官中是否保守，目前仍不清楚。

本研究從黃瓜中克隆了GolS2基因，分析了其氨基酸序列特性及與其他植物GolS2 的序列差異，并研究了GolS2基因在黃瓜幼苗和采后黃瓜中響應非生物脅迫的差異，以期為揭示黃瓜GolS2基因的生物學功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗處理

所用黃瓜品種為“翠夏”和“津春2 號”，克隆載體為pMD18－T，VIGS 實驗載體為pTRV1 和pTRV2，均由本實驗室自行擴繁保存。 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞購自上海唯地生物有限公司，高保真PCRTaq酶和植物總RNA 提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供，cDNA 合成試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司。

于2020 年5 月在本地黃瓜種植基地采收即將上市的黃瓜果實，室溫條件下一小時內運回實驗室。 挑選成熟度基本一致、大小均一的黃瓜果實作為試驗材料。 將挑選好的采后黃瓜分成兩組，每組含有3 個獨立的生物學重復，每個生物學重復含有10 根黃瓜。 采后黃瓜裝框，并用塑料薄膜保鮮袋密封包裝，分別在5℃和10℃貯藏庫(相對濕度95%～98%)中貯藏72 h。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃瓜GolS2基因全長克隆 在黃瓜基因組數據庫(http:/ /www.cucurbitgenomics.org/)中檢索GolS2(登錄號:CsaV3＿1G015730)基因，并根據mRNA 序列設計特異引物。 引物由生工生物工程(上海)有限公司廣州分公司合成，序列如表1 所示。 使用植物RNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取黃瓜總RNA，運用反轉錄試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)合成cDNA。以cDNA 為模板，采用RT－PCR 擴增黃瓜GolS2全長序列。 PCR 反應程序:94℃預變性5 min；94℃變性35 s，58℃退火35 s，72℃延伸5 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。 PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳確認長度后，回收并連接到pMD18－T(日本Takara 公司) 載體上，并轉化DH5α 感受態(tài)細胞。 挑取陽性單菌落擴繁，并送至生工生物工程(上海)有限公司廣州分公司測序鑒定。

表1 引物信息

1.2.2 生物信息學分析 在ExPASy 平臺完成黃瓜GolS2 蛋白理化性質分析，利用Cell－PLoc 2.0在線預測蛋白的亞細胞定位。 在黃瓜基因組中調出GolS2翻譯起始密碼子ATG 上游1 500 bp 長度的DNA 序列，提交PlantCARE 分析其啟動子中的順式作用元件，并用TBtools 軟件繪制作用元件在啟動子中的定位[15]。 在NCBI 數據庫中同源比較，挑選出同源性較高的同源蛋白。 使用DNAMAN 軟件比對氨基酸序列，并用MEGA 軟件(Neighbor－Joining 法)構建系統(tǒng)進化樹。 本研究用到的生物信息學分析軟件或在線工具見表2。

表2 本研究用到的生物信息學分析工具

1.2.3 采后黃瓜VIGS 沉默實驗 黃瓜HHO2(hypersensitive to low Pi － elicited primary root shortening homologue 2)是一個MYB like 轉錄因子，GRP3(glycine－rich RNA－binding protein 3)是一個RNA 結合蛋白，他們對低溫應答基因的表達具有調節(jié)作用[16－19]。 為研究兩基因對黃瓜GolS2基因表達的調節(jié)作用，對采后黃瓜進行VIGS 沉默實驗。

在HHO2和GRP3基因全長序列的3′端附近設計引物，并在上、下游引物序列的5′端加入BamH Ⅰ酶切位點序列，引物信息見表1。 以cDNA 為模板，使用高保真PCRTaq酶擴增目的片段。 目的片段經酶切和凝膠電泳分離后，與pTRV2 質粒相連接。 重組質粒轉化DH5α 感受態(tài)細胞，經測序鑒定后，提取重組質粒并轉化農桿菌感受態(tài)GV3101 細胞。

將含有pTRV1 空載的農桿菌分別與含pTRV2－HHO2 和pTRV2－GRP3 重組質粒的農桿菌單獨或同時等體積混勻，室溫靜置2 h。 使用醫(yī)用注射器，將農桿菌分別注射在黃瓜果實的三個部位(遠離果蒂5 cm、遠離果柄5 cm、果柄和果蒂之間的最中間部位)。 然后將果實裝在果籃中，用聚乙烯塑料薄膜袋包裝果籃。 室溫(25℃)暗培養(yǎng)48 h，使農桿菌恢復活性，充分沉默目的基因。 將整個果籃轉移至5℃冷庫貯藏72 h，檢測沉默HHO2和GRP3基因對采后黃瓜GolS2基因表達的影響。

1.2.4 基因的表達分析 由北京百邁客生物科技有限公司完成處理樣品的總RNA 提取和測序建庫，并利用Illumina next seq 2500 測序平臺完成轉錄組測序工作，測序流程和數據處理方法見參考文獻[20]。 用FPKM(fragments per kilobase per million mapped reads) 值表示GolS2的表達水平。

1.3 數據分析

在Mircrosoft Excel 2016 軟件中整理數據，利用SPSS 22.0 軟件分析數據之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 黃瓜GolS2 基因克隆及結構分析

如圖1A 所示，從黃瓜中克隆出了一條約1 000 bp的DNA 片段，總體與黃瓜GolS2基因長度(981 bp)一致。 將該DNA 片段與pMD18－T 載體相連接，轉化DH5α 感受態(tài)細胞擴繁，經測序驗證，目的產物正是CsGolS2基因。 該基因定位在1號染色體，ORF 由4 個不同長度的外顯子構成(圖1B)，第一個外顯子最長(406 bp)，第三個外顯子長度只有135 bp。

圖1 黃瓜果實GolS2 全長PCR 電泳圖(A)及其在染色體上的定位(B)

2.2 CsGolS2 基本特征分析

CsGolS2基因ORF 全長981 bp，編碼326 個氨基酸(圖2)。 理論分子量為37.83 kDa，等電點為5.51。 氨基酸中帶負電荷的殘基總數為42 個，帶正電荷的殘基總數為32 個。 編碼蛋白質的不穩(wěn)定系數為41.45，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪族指數為78.31，平均疏水指數為－0.34。

圖2 黃瓜CsGolS2 開放閱讀框序列及推導的氨基酸序列

CsGolS2 蛋白的氨基酸序列中含有5 個保守的絲氨酸磷酸化位點，在C 端還含有1 個疏水性APSAA 五肽結構(圖2)，這些是植物GolS 蛋白的典型特征[21]。 亞細胞定位預測結果顯示，Cs-GolS2 蛋白可能定位在細胞壁、葉綠體、細胞質和線粒體等亞細胞器中。

2.3 多序列比對與進化分析

CsGolS2 與葫蘆科其他4 種植物GolS2 的氨基酸序列一致性很好(圖3)，表明葫蘆科植物GolS2 蛋白保守性很高，推測葫蘆科植物GolS2 蛋白的生物學功能可能保守。 其中，CsGolS2 與甜瓜(Cucumis melo)CmeGolS2 蛋白(XP＿008463593.1)的序列一致性最好。

圖3 5 種葫蘆科植物GolS2 蛋白的氨基酸多序列比對

CsGolS2 與其他8 種植物GolS2 蛋白的同源性分析結果如表3 所示，可見CsGolS2 與其他8種植物GolS2 蛋白的氨基酸序列同源性介于73.06%～97.85%之間，與甜瓜GolS2 的同源性最高，為97.85%。 說明植物GolS2 在進化過程中高度保守，暗示著它們具有相似的生物學功能。

表3 不同植物GolS2 蛋白同源性比較 (%)

比較了CsGolS2 蛋白與4 種模式植物GolS2蛋白的氨基酸序列相似性和結構域保守性，結果(圖4)顯示，盡管5 種植物GolS2 蛋白的氨基酸序列長度有所不同，但序列中均含有一個糖基轉移酶保守結構域，屬于糖基轉移酶超級家族；且保守結構域的氨基酸序列一致性很高，表明保守結構域的保守性很高。

圖4 黃瓜與4 種模式植物GolS2 蛋白的氨基酸序列比對

在擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因組數據中共鑒定出了9 個GolS基因，分別命名為At-GolS1～AtGolS9。 擬南芥通常被作為研究候選基因功能的模式植物，相關基因的功能已研究的比較清楚，因此，比較了CsGolS2 蛋白與擬南芥GolS家族蛋白的進化關系(圖5)，以期在一定程度上推測CsGolS2 蛋白的生物學功能。 可以看出，擬南芥GolS 家族蛋白可分為兩組，AtGolS8 和At-GolS9 聚在一組，黃瓜GolS2 與其他7 個擬南芥GolS 蛋白聚在另一分支，CsGolS2 與AtGolS2 和AtGoLS3 的親緣關系最近。

圖5 黃瓜GolS2 蛋白與擬南芥GolS 家族的親緣關系

2.4 基于文獻的鹽脅迫和低溫脅迫對黃瓜幼苗GolS2 基因表達的影響

前人利用轉錄組測序分析了黃瓜基因組中所有基因的表達水平，我們從中挑選了黃瓜幼苗GolS2基因在鹽脅迫和低溫脅迫后的表達數據[22]，結果(圖6)顯示，鹽脅迫顯著上調GolS2基因在黃瓜幼苗中的表達，表達量比對照(CK)高42.10 倍；低溫處理顯著誘導GolS2基因表達，處理6 h 和12 h 的表達量顯著高于處理2 h。 表明黃瓜GolS2是一個抗逆性相關基因，其表達可能與黃瓜幼苗對鹽脅迫和低溫脅迫的應答密切相關。

圖6 鹽脅迫(A)和低溫脅迫(B)處理對黃瓜幼苗GolS2 表達的影響

2.5 黃瓜GolS2 基因啟動子分析

由于鹽脅迫和低溫脅迫顯著上調GolS2基因在黃瓜幼苗中的表達，推測該基因啟動子中可能含有逆境響應元件。 因此，從基因組數據中調出位于起始密碼子上游1 625 bp 長度的DNA 序列，分析啟動子中的瞬時作用元件，結果(圖7)顯示，CsGolS2基因啟動子中含有豐富的逆境脅迫響應相關元件。 其中，有2 個元件與晝夜節(jié)律(circadian)調節(jié)相關，有9 個光響應元件(4 個G－Box、2 個Box 4、1 個TCT－motif、1 個LAMP－element、1個chs－CMA1a)，3 個厭氧誘導元件ARE，2 個茉莉酸甲酯響應元件(TGACG－motif 和CGTCA－motif)，6 個乙烯響應元件(4 個ERE 和2 個Wbox)，3 個ABA 響應元件ABRE。 這些結果再次證明黃瓜GolS2是一個典型的逆境脅迫相關基因。 此外，啟動子中還鑒定出多個轉錄因子結合位點，比如8 個MYB 轉錄因子結合位點，3 個MYC 結合位點，表明黃瓜GolS2基因的表達可能受到MYB 和MYC 類轉錄因子的調控。

圖7 黃瓜GolS2 啟動子中與逆境相關的順式作用元件分析

2.6 低溫處理對采后黃瓜GolS2 基因表達的影響

與黃瓜幼苗不同的是，采后黃瓜由于脫離了母體，沒有營養(yǎng)供應來源，只能通過呼吸代謝維持生命活動[7，16]。 在響應低溫脅迫過程中，GolS2在采后黃瓜和黃瓜幼苗中的表達模式是否一致，目前未見相關報道。 鑒定能同時提高植株和采后果實耐冷性的功能基因，對于培育耐冷黃瓜新品種具有重要意義。 為此，本研究分析了GolS2在采后黃瓜中響應低溫處理的表達模式，結果(圖8)顯示，與幼苗中的表達模式不同，GolS2表達水平在5℃和10℃低溫處理后顯著下降，且處理時間越長，下降越明顯；10℃低溫處理對GolS2表達的抑制作用強于5℃低溫處理。 表明低溫處理抑制采后黃瓜GolS2表達，可能負調控采后黃瓜耐冷反應。

圖8 低溫處理對采后黃瓜果實GolS2 表達的影響

2.7 沉默GRP3 和HHO2 基因對采后黃瓜GolS2基因表達的影響

為研究HHO2和GRP3是否對GolS2基因表達具有調節(jié)作用，分析了沉默GRP3和HHO2基因對采后黃瓜GolS2表達的影響，結果(圖9)顯示，不論單獨沉默GRP3或HHO2基因，還是同時沉默GRP3和HHO2基因，均顯著下調GolS2表達，表明GRP3 和HHO2 蛋白可能調控GolS2表達。

圖9 GRP3 和HHO2 沉默對采后黃瓜GolS2 表達的影響

3 討論與結論

肌醇半乳糖苷合成酶是調節(jié)棉子糖系列寡糖合成的關鍵酶，對細胞滲透調節(jié)具有重要作用[23]。 因此，克隆黃瓜GolS家族基因，并分析其響應非生物脅迫的表達模式，有助于豐富和完善植物GolS家族基因的功能。 本研究從黃瓜中克隆了GolS2基因，其編碼326 個氨基酸殘基。 序列分析結果顯示，黃瓜GolS2 與擬南芥GolS 家族蛋白的親緣關系較近，與其他植物GolS 蛋白的同源性也很高，序列中均含有一個糖基轉移酶保守結構域。 同時，黃瓜GolS2 蛋白氨基酸序列具有植物GolS 蛋白的典型特征，比如在氨基酸序列C端含有保守的疏水性APSAA 五肽結構。 這些結果證實，黃瓜GolS2 屬于植物GolS 大家族。

植物GolS家族基因的表達受多種非生物脅迫因子誘導，表達上調可促進RFOs 積累和增強抗逆性。 在大豆[Glycine max(L.) Merr.]幼苗中，包括高低溫、干旱及高鹽等在內的多種非生物脅迫可不同程度地誘導GmGolS1基因表達，且高溫脅迫對GmGolS1基因表達的誘導作用最強烈[24]。 干旱和高鹽脅迫顯著誘導AtGolS1和At-GolS2基因的表達，而AtGolS3基因表達受低溫脅迫誘導，超表達AtGolS2基因的轉基因擬南芥抗旱性顯著提高[25]。 干旱脅迫誘導芝麻(Sesamum indicumL.)SmGolS6基因的表達，在擬南芥中異源超表達該基因，提高了轉基因擬南芥的抗旱性[26]。 鹽脅迫和低溫脅迫處理顯著誘導黃瓜幼苗GolS2基因表達，且該基因啟動子中含有豐富的逆境脅迫響應元件，表明黃瓜GolS2是一個逆境響應基因，其表達上調可能是黃瓜幼苗適應非生物脅迫的重要機制。

盡管植物GolS 蛋白的功能在進化中保守性較好，但同一基因在不同類型器官中的功能是否存在明顯差異，目前仍不明確。 在黃瓜幼苗中，干旱和低溫脅迫處理顯著誘導GolS2基因的表達；但在離體的采后黃瓜中，低溫處理卻顯著下調GolS2基因的表達，且10℃處理比5℃處理的抑制更強。 此外，黃瓜GolS2基因啟動子中含有豐富的光響應元件。 這些結果表明，黃瓜GolS2基因的生物學功能可能在不同類型器官中存在較大差異，非生物脅迫對黃瓜GolS2基因表達的誘導作用可能依賴于光照；也意味著在采后黃瓜中增強GolS2基因表達，或許并不能增強采后黃瓜的耐冷性，若需要通過轉基因的方法提高采后黃瓜耐冷性，GolS2基因可能不是一個有效的候選基因。葉片是植物進行光合作用的主要器官，黃瓜GolS1和GolS4基因在葉片中表達上調，能提高葉片的光合作用效率，促進RFOs 的積累[9，14]。 而果實是養(yǎng)分貯藏器官和生殖器官，采收后一般貯藏在密閉或黑暗空間中[27]，采后黃瓜在貯藏過程中很難進行光合作用，盡管黃瓜果實中也含有葉綠體[20]，表明黃瓜GolS2促進RFOs 積累與同化物轉運效率的提高有關。

植物GolS家族基因的表達還受轉錄調節(jié)因子的調控。 旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)WRKY1轉錄因子可直接與BhGolS1基因啟動子中的Wbox 元件結合，調控其表達[28]。 葡萄(Vitis viniferaL.)AQUILO 是一個MYB like 轉錄因子，其通過調節(jié)VvGolS家族基因的表達促進RFOs 合成和積累[29]。 本研究中，黃瓜GolS2基因啟動子中發(fā)現了多個MYB 和MYC 轉錄因子的結合位點，沉默HHO2基因顯著下調采后黃瓜GolS2表達，表明HHO2 可能是直接調控GolS2基因表達的MYB轉錄因子。 HHO2 是否直接調控GolS2表達，以及具體的調控機制是怎樣的，尚需更多研究進一步探明。 植物GRP 蛋白具有類似分子伴侶的功能，對mRNA 的穩(wěn)定性調節(jié)具有重要作用[30]。 本研究中，沉默GRP3顯著抑制采后黃瓜GolS2基因表達，表明GRP3 蛋白可能同時在轉錄和轉錄后水平上調控GolS2基因表達。

總之，本研究從黃瓜中克隆了GolS2基因，其屬于植物GolS基因超級家族。GolS2是一個逆境應答相關基因，高鹽和低溫處理誘導GolS2基因在黃瓜幼苗和葉片中的表達，但低溫處理卻下調其在采后黃瓜中的表達，表明其可能通過提高黃瓜光合效率和同化物轉運效率促進RFOs 積累。由于采后黃瓜在貯藏期間很難進行光合作用，若利用分子育種方法培育果實耐冷性強的轉基因黃瓜，GolS2可能不是一個有效的目標基因。