滸苔多糖降解菌的篩選及其碳源利用譜分析

黎芯怡 王靜涵 甄莉 徐展 戴景程 閆達中 陳靜

摘 要：滸苔中含有大量的滸苔多糖，分解、利用及轉(zhuǎn)化滸苔多糖對藻類資源利用以及海洋碳循環(huán)具有重要意義。為篩選出能降解滸苔多糖的微生物，提高滸苔生物量的回收利用效率，本研究利用微生物分離鑒定以及基質(zhì)測試技術(shù)從滸苔綠潮中分離鑒定了浮游及滸苔附著微生物，成功地從分離到的菌株中篩選出能降解滸苔多糖的菌株，并選取黃桿菌Algibacter lectus S7和交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6作為代表菌株進行碳源利用譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黃桿菌Algibacter lectus S7可以分解利用滸苔多糖、木聚糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖；交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6可以分解利用滸苔多糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、木聚糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖和糊精。從生長曲線可見，兩菌株均能高效分解利用滸苔多糖，并分別揭示了兩菌株對碳源利用情況，為海洋微生物對滸苔多糖的分解代謝研究及工業(yè)上提高滸苔生物量回收利用效率提供菌種資源及碳源參考。

關(guān)鍵詞：滸苔；滸苔多糖；滸苔多糖降解菌；碳源利用譜

中圖分類號：Q93-33 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2023.03.017

0 引言

滸苔（Ulva prolifera， Enteromorpha prolifera），隸屬于綠藻門石莼科滸苔屬，俗稱“海青菜”“綠紫菜”[1]，是生活在近海灘涂中的天然野生綠藻，也是我國東南沿海最常見的海洋綠藻之一。自2007年起，每年夏季我國黃海都會爆發(fā)由滸苔引發(fā)的大規(guī)模綠潮[2]。其中，2008年青島暴發(fā)的滸苔綠潮是世界上最大的綠潮，影響海域超過2萬km2，實際覆蓋面積超過400 km2 [3]。大量漂浮滸苔遮蔽陽光，消耗水中氧氣，造成海洋生物死亡，對養(yǎng)殖業(yè)及海洋環(huán)境帶來極大的危害[4]。為減少滸苔綠潮對海洋環(huán)境的污染，政府每年都要花費巨額資金，出動大量人力來打撈滸苔，同時面臨著提高滸苔生物量資源的回收利用效率問題[5]。

滸苔多糖是滸苔生物量的主要成分，占滸苔干重的20% ～ 70%[6]。滸苔多糖具有免疫調(diào)節(jié)[7] 、抗腫瘤 [8-9]、抗病毒[10]、抗氧化[11-12] 、降血脂[13-14]等多種生理活性功能。而低分子量的滸苔寡糖具有更好的生物活性及水溶性，更廣泛地應(yīng)用于藥物及功能性食物中 [15-16]。同時，滸苔可作為生產(chǎn)生物柴油及生物乙醇的材料[17-18]。目前對滸苔生物量的資源利用還存在成本高、轉(zhuǎn)化效率低的問題。因此，篩選出能高效降解滸苔多糖的微生物及酶類，加快多糖物質(zhì)的降解，是提高滸苔生物質(zhì)利用效率及實現(xiàn)資源轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，也是滸苔綠潮污染治理中重要的一環(huán)。

滸苔多糖主要成分為葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸等，并且含有以糖醛酸和硫酸基為主要結(jié)構(gòu)的水溶性多糖，其中糖醛酸和硫酸根的含量相對比較穩(wěn)定[19]。目前對滸苔多糖降解微生物的研究還十分匱乏。Li等[20]從腐爛滸苔綠藻表面底泥中分離到一株γ-變形菌門的交替單胞菌（Alteromonas sp. A321），發(fā)現(xiàn)它能產(chǎn)生某種可分解滸苔多糖的酶。此外，黃桿菌在滸苔綠潮爆發(fā)時期大量出現(xiàn)。Liu等[21]分析并比較了膠州灣滸苔綠潮爆發(fā)區(qū)域中不同時期滸苔附著微生物及海水中微生物的結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)滸苔綠潮中期的海水中黃桿菌的豐度最高，達45%。另據(jù)Lin 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，爆發(fā)滸苔的養(yǎng)殖水體中黃桿菌豐度是沒有爆發(fā)滸苔的水體中的3～5倍。黃桿菌的大量出現(xiàn)可能是由于黃桿菌能首先分解利用滸苔多糖，因而在與其他微生物競爭碳源時占據(jù)優(yōu)勢，得以大量生長繁殖。

本研究對滸苔綠潮期間的微生物進行了分離及鑒定，篩選出了能降解滸苔多糖的微生物，并選取2株代表菌進行了多糖底物利用譜分析。以期能篩選出高效降解滸苔多糖的微生物，并解析其多糖底物利用譜，為由滸苔引起的海洋污染的治理問題提供理論基礎(chǔ)和菌種資源；為工業(yè)上提高滸苔生物量回收利用效率提供新思路。

1 材料與方法

1.1 滸苔及微生物樣品的采集及分離鑒定

在廣西北海金海灣紅樹林海域和山東青島棧橋及金沙灘海域的滸苔綠潮爆發(fā)地用無菌自封袋和采樣瓶分別采集滸苔及海水樣品。分別分離滸苔附著微生物和海水中的浮游微生物。

滸苔附著微生物的分離方法：取50 g新鮮滸苔用500 mL無菌海水清洗3遍后瀝干，裝入1 000 mL無菌錐形瓶中，加入500 mL無菌海水，置于超聲清洗機中超聲水?。?5 kHz）并用振蕩的方法分離，收集液體[23]。

分別取海水及滸苔附著菌液，梯度稀釋后均勻涂布于2216E固體海洋培養(yǎng)基平板上，倒置放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，觀察菌落生長情況。挑取單菌落，接種于2216E液體培養(yǎng)基中，放入28 ℃恒溫搖床培養(yǎng)24 h。用16S rRNA 通用引物對27F/1492R PCR 擴增后送測序公司測序，通過比對NCBI數(shù)據(jù)庫，鑒定微生物的種類，并將分離鑒定后的菌株用20%甘油保存于-80 ℃ 冰箱中。

選取重點分析的5個菌株，分別根據(jù)NCBI中序列的比對結(jié)果，選取相似度高的幾株菌的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在 Mega X中用Clustal W 對序列進行比對后用鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 滸苔多糖的提取

采取已建立的熱水浴加乙醇沉降的方法提取滸苔多糖，具體步驟為：將滸苔清洗干凈后，取適量于無菌水中，置于90 ℃水浴鍋水浴7 h，收集液體，重復(fù)操作2次。將所得液體離心（4 800g（g為重力加速度），15 min）去雜質(zhì)后濃縮至50 mL。加1/5提取液體積的氯仿正丁醇溶液（氯仿∶正丁醇 = 5∶1）劇烈震蕩30 min后離心，取水相，去除提取液中的蛋白質(zhì)，重復(fù)3次至無白色沉淀，收集上清液。將收集的液體用3倍體積的無水乙醇沉降，離心去上清，待干燥后加入適量無菌雙蒸水溶解備用。

1.3 滸苔多糖降解微生物的篩選

將提取的滸苔多糖以5 g/L的終濃度加入無碳的海洋無機鹽培養(yǎng)基（minimum marine medium，MMM）中，該培養(yǎng)基含有25.95 g NaCl， 2 g MgCl2·6H2O，3 g MgSO4·7H2O， 0.12 g CaCl2·2H2O，27 mL 0.5 mol/L Na2EDTA，25 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH=8），10 mL 1 mol/L NH4Cl，0.8 g K2HPO4，0.2 g KH2PO4，0.015 g FeSO4·7H2O，0.03 g H4MoNa2O6，1 mL 微量元素混合液（含H3BO3 2.86 g/L，MnCl2·4H2O 1.86 g/L，Zn SO4·7H2 O 0.22 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.39 g/L，CuSO4·5H2O 0.08 g/L，Co（NO3）2·6H2O 0.05 g/L）和1 mL 1 000 * 維生素混合物。將分離到的菌株接種到以滸苔多糖為唯一碳源的MMM液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)，根據(jù)生長情況判斷各菌株對滸苔多糖的利用能力，篩選出能利用滸苔多糖的菌株。同時，按照BIOLOG使用方法，用PM2A碳源利用板測試幾株菌對PM2A板上各碳源的利用情況。

1.4 滸苔多糖降解菌的生長曲線測定

為了測試篩選出的滸苔多糖降解菌株A1-6和S7對滸苔多糖的利用能力及對其他碳源的利用情況，用2216E液體培養(yǎng)基加上滸苔多糖及其他碳源測試菌株的生長曲線及碳源利用譜。除滸苔多糖外，測試的碳源有：葡萄糖、α-乳糖、D-果糖、D-麥芽糖、D-半乳糖、蔗糖、木聚糖、糊精、可溶性淀粉及明膠。配制以上各種糖的儲備液，質(zhì)量濃度為20 g/L。所用糖溶液經(jīng)121 ℃、15 min高溫蒸汽滅菌后使用。取保存的A1-6和S7菌種，用2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接3代活化。取15 mL無菌培養(yǎng)管，每管加入2216E培養(yǎng)基9 mL，待測糖儲備液1 mL（終質(zhì)量濃度為2 g/L），接種菌液1 mL。以不加糖儲備液的培養(yǎng)物作為對照。每組培養(yǎng)物各重復(fù)做3次。用分光光度計檢測培養(yǎng)物在600 nm下的OD值[24]。

2 結(jié)果分析

2.1 采樣點滸苔綠潮的情況

2020年2月廣西北海爆發(fā)了滸苔綠潮。圖1（a）為廣西北海金海灣海域的綠藻，發(fā)現(xiàn)引發(fā)此次綠潮的綠藻主要有2種：絲狀的滸苔及片狀的滸苔。2021年7月，山東青島爆發(fā)了滸苔綠潮，圖1（b）為山東青島棧橋海域的綠藻，引發(fā)此次綠潮的綠藻主要為絲狀滸苔。

2.2 北海及青島樣品分菌結(jié)果分析

北海樣品分離的微生物鑒定結(jié)果見表1。北海樣品中共分離到13種菌，其中海水樣品中有8種，絲狀滸苔附著菌分離到7種，片狀滸苔附著菌分離到4種（3個樣品中分離到的菌株存在部分重復(fù)，如交替單胞菌Alteromonas macleodii和Alteromonas oceani在3個樣品中都分離到；Polaribacter marinaquae和Maribacter dokdonensis分別在2個樣品中都有分離到）。共分離到3種黃桿菌：Polaribacter marinaquae、Maribacter dokdonensis、Cellulophaga lytica。其中，在海水及片狀滸苔上有分離到Polaribacter marinaquae（片狀滸苔上4次都分離到），絲狀滸苔上沒有分離到Polaribacter marinaquae；在片狀滸苔上和絲狀滸苔上都有分離到Maribacter dokdonensis（絲狀滸苔上2次分離到），海水中沒有分離到Maribacter dokdonensis；只在絲狀滸苔上分離到1株Cellulophaga lytica。

青島樣品分離的微生物鑒定結(jié)果見表2。青島樣品中共分離到22種菌，其中海水樣品中有10種，絲狀滸苔附著菌分離到12種，共分離到4種黃桿菌：Meridianimaribacter flavus、Tenacibaculum geojense、Tenacibaculum mesophilum和Algibacter lectus，4株都是在絲狀滸苔上分離到的，海水中沒有分離到。對比2個采樣點的分菌結(jié)果，只有Alteromonas confluentis在北海和青島樣品中都有分離到。其他菌株均不相同，包括2個樣點分離到的黃桿菌也不相同。

在菌株鑒定的基礎(chǔ)上，對重點分析的5株菌：菌株 A1-6、S7、A2-2、aA1-7和aA1-9構(gòu)建了基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）。從圖2可見，菌株A1-6與Alteromonas confluentis親緣關(guān)系最近，聚成一支，且屬于γ變形菌（γ-proteobacteria）。菌株S7、 aA1-7、 aA1-9 、A2-2分別與Algibacter lectus、Cellulophaga lytica、Maribacter dokdonensis和 Polaribacter marinaquae聚成一支，都隸屬于黃桿菌（Flavobateria）。

2.3 菌株多糖底物分析及滸苔多糖降解菌的篩選

用BIOLOG對Alteromonas confluentis A1-6及3株黃桿菌Polaribacter marinaquae A2-2、Cellulophaga lytica aA-7 和Maribacter dokdonensis aA-9 的碳源利用譜進行了檢測，結(jié)果見表3。從表3可見，在PM2A板的碳源底物中，4株菌都能利用果膠（Pectin）；除Polaribacter marinaquae A2-2外，其他3株菌都能利用糊精（Dextrin）；只有Cellulophaga lytica aA-7 可以利用硫酸軟骨素C （Chondroitin Sulfate C）。4株菌都不能利用甘露聚糖（Mannan）、明膠（Gelatin）、菊粉（Inulin）、環(huán)糊精（α-/β-/γ-Cyclodextrin）、糖原（Glycogen）。

2.4 菌種生長曲線的測定

為了進一步檢測篩選的菌株對滸苔多糖及其他碳源的利用情況，挑選交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6（圖3（a）和黃桿菌Algibacter lectus S7（圖3（b））2株菌進行生長監(jiān)測，并繪制了菌株Algibacter lectus S7（圖4）和Alteromonas confluentis A1-6（圖5）在添加了不同碳源的2216E液體培養(yǎng)基中的生長曲線。

圖3（a）為γ變形菌門的交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6的菌落形態(tài)，其菌落呈乳白色，全緣，菌落表面濕潤光滑，光澤度好。圖3（b）—圖3（e）分別為擬桿菌門的黃桿菌Algibacter lectus S7、Polaribacter marinaquae A2-2、Cellulophaga lytica aA1-7和Maribacter dokdonensis aA1-9的菌落形態(tài)，可見其菌落均呈橙色或黃色，全緣，表面濕潤光滑。其中菌株S7和A2-2菌落形態(tài)和顏色相似；菌株aA1-7菌落更為濕潤且呈現(xiàn)微弱的綠色熒光；菌株aA1-9菌落顏色為淺黃色。

菌株 S7在不同碳源2216E培養(yǎng)基中的生長曲線如圖4所示，黃桿菌Algibacter lectus S7在葡萄糖、半乳糖、滸苔多糖、木聚糖及蔗糖中的生長較對照組明顯增強，說明菌株S7可以利用這些糖作為碳源生長。這些碳源中葡萄糖、半乳糖為單糖，蔗糖為二糖，滸苔多糖和木聚糖為多糖，說明菌株S7能分解利用滸苔多糖和木聚糖。菌株在乳糖、果糖、可溶性淀粉中的生長曲線在對照組之下，可見菌株S7對乳糖、果糖、可溶性淀粉幾乎沒有利用，同時菌株在糊精、明膠及麥芽糖中的生長與對照差不多，無明顯生長，說明菌株S7不能利用這些碳源。重點對比木聚糖和滸苔多糖，可以看出菌株S7對木聚糖的利用曲線在滸苔多糖曲線之下，但相差不大，可以猜想菌株S7對滸苔多糖的降解可能是作用在與木聚糖結(jié)構(gòu)相似的木糖單體上。簡而言之，菌株S7能利用滸苔多糖、木聚糖、半乳糖和蔗糖，但不能利用可溶性淀粉、糊精、麥芽糖、明膠、乳糖和果糖。

菌株Alteromonas Confluentis A1-6在不同碳源2216E培養(yǎng)基中的生長曲線如圖5所示。與對照組相比，交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6除了在明膠和果糖中無明顯生長外，其他碳源中都有生長，說明交替單胞菌A1-6對碳源的利用較黃桿菌S7更具有廣譜性。其中對滸苔多糖、半乳糖和糊精的利用最明顯，以這些碳源作底物，菌體的生長情況較其他糖類物質(zhì)作底物時更好。菌株A1-6不能利用明膠和果糖，可以利用葡萄糖、滸苔多糖、半乳糖、乳糖、木聚糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖和糊精。

通過以上分析，可以得出菌株Alteromonas confluentis A1-6和黃桿菌Algibacter lectus S7都可以利用滸苔多糖進行生長，且生長情況較好。同時，生長測試實驗中所選取的糖類碳源并不是都能被菌株A1-6和S7利用，這說明不同菌株對于碳源底物的利用是有選擇性的。菌株的碳源利用譜越廣，則菌株對環(huán)境的適應(yīng)能力越強，能占據(jù)更多的生態(tài)位。這可能是Alteromonas confluentis（菌株A1-6）可以同時在廣西北海和山東青島2個采樣地都分離到的原因之一。

3 討論

滸苔中含有大量的滸苔多糖，加快多糖物質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化，是提高滸苔生物質(zhì)利用效率、實現(xiàn)資源轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，也是滸苔綠潮污染治理中重要的一環(huán)。因此，篩選出能高效降解滸苔多糖的微生物，為滸苔多糖降解提供優(yōu)質(zhì)菌種資源是非常必要且迫切的。而分析滸苔多糖降解菌的碳源利用譜可了解菌株對不同碳源的利用能力，為菌株的培養(yǎng)提供碳源指導(dǎo)。

本研究成功篩選出2株滸苔多糖降解菌：黃桿菌Algibacter lectus S7和交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6。值得注意的是，之前研究中報道的滸苔綠潮中常大量出現(xiàn)的交替單胞菌屬（Alteromonas sp.）在廣西北海樣品中多次分離到。而青島樣品中，只在海水樣品中分離到1株Alteromonas confluentis A1-6。一方面說明不同的地方滸苔多糖降解菌的組分有差異，另一方面可知Alteromonas confluentis是常見且重要的滸苔多糖降解菌。另外，課題組在青島海水樣品中分離到7株弧菌（Vibrio sp.），且屬于不同種。而在北海的海水樣品中只分離到1株弧菌?；【ǔＩ瞄L降解幾丁質(zhì)[25]，有些也是病原菌[26]。青島滸苔綠潮地大量出現(xiàn)弧菌，可能與綠潮引起蝦、蟹等富含幾丁質(zhì)的生物死亡，使得此處幾丁質(zhì)含量較高有關(guān)。同時也建議盡量避免在滸苔綠潮爆發(fā)海域活動或接觸污染海水，避免接觸到病原菌。

由于BIOLOG的測試碳源中沒有滸苔多糖及與其結(jié)構(gòu)相似的多糖，因此，采用以滸苔多糖為唯一碳源的MMM培養(yǎng)基來測試菌株能否利用滸苔多糖進行生長。分離到的黃桿菌中只有Algibacter lectus S7生長良好，Cellulophaga lytica aA1-7能少量生長；交替單胞菌幾乎都能生長。由于MMM培養(yǎng)基營養(yǎng)成分簡單，菌株在MMM中的生長受到除碳源外的其他因素限制，因此繪制的生長曲線不明顯。從有生長的菌株中挑選Algibacter lectus S7和 Alteromonas confluentis A1-6作代表，用2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)并繪制生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2株菌能很好地利用滸苔多糖。由于滸苔多糖和木聚糖結(jié)構(gòu)較相似，都富含木聚糖的單體，因此，重點比較菌株對滸苔多糖和木聚糖的利用能力。分析發(fā)現(xiàn)菌株A1-6對滸苔多糖的利用能力強于對木聚糖的利用能力，而菌株S7對滸苔多糖和木聚糖的利用能力相差不大?？梢酝茰y出交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6和黃桿菌Algibacter lectus S7分解利用滸苔多糖的代謝途徑不一樣。菌株A1-6對滸苔多糖這類結(jié)構(gòu)的多糖利用較木聚糖有一定的偏向性，而黃桿菌S7對滸苔多糖和木聚糖的降解可能存在一個相似的酶系統(tǒng)，比如作用于木糖苷鏈的木糖酶，故而對含木糖的多糖降解能力更強。菌株對滸苔多糖的具體代謝途徑以及高效的滸苔多糖降解酶類的挖掘尚需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究以滸苔綠潮為背景，在廣西北海及山東青島的滸苔綠潮爆發(fā)地分離、鑒定了海水中及滸苔綠藻上附著的微生物，從北海樣品中分離到3種黃桿菌、4種交替單胞菌，從青島樣品中分離到4種黃桿菌、1種交替單胞菌。通過以滸苔多糖為唯一碳源的MMM成功篩選出2株代表性的滸苔多糖降解菌：黃桿菌Algibacter lectus S7及交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6。菌株S7可以利用滸苔多糖、木聚糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖；菌株A1-6可以利用滸苔多糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、木聚糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖和糊精，2株菌均能高效分解利用滸苔多糖。本研究成功篩選出滸苔多糖降解菌株：黃桿菌Algibacter lectus S7及交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6，為海洋微生物及CAZymes對滸苔多糖的分解代謝機理提供了理論基礎(chǔ)，為工業(yè)上提高滸苔生物量回收利用效率提供新思路。

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Screening of Ulva prolifera polysaccharide-degrading bacteria and analysis of its carbon source utilization spectrum

LI Xinyi1， WANG Jinghan1， ZHEN Li2，XU Zhan1， DAI Jingcheng1，

YAN Dazhong1， CHEN Jing*1

（1.School of Life Science and Technology， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China;

2. China General Nuclear Power Environmental Protection Industry Co.， Ltd.， Shenzhen 518038， China）

Abstract： The Ulva prolifera produces a large deal of Ulva prolifera polysaccharide， the decomposition， utilization and transformation of which are of great significance to the utilization of algal resources and the marine carbon cycle. In order to screen the Ulva prolifera polysaccharide-decomposing microbes and improve the recycling efficiency of the Ulva prolifera biomass， planktonic and Ulva prolifera attaching microorganisms were isolated and identified from the green tide of Ulva prolifera by microbial isolation， identification and substrate testing techniques. We successfully screened out the strains that can degrade the polysaccharide of Ulva prolifera from these isolated microbes. And we selected the representative Flavobacterium Algibacter lectus S7 and Alteromonas confluentis A1-6 for further carbon source utilization analysis. The results showed that Algibacter lectus S7 could use Ulva prolifera polysaccharide， xylan， glucose， galactose and sucrose， while Alteromonas confluentis A1-6 could use Ulva prolifera polysaccharide， glucose， galactose， lactose， xylan， sucrose， soluble starch， maltose， dextrin. The growth curves showed that both strains could decompose and utilize Ulva prolifera polysaccharide， and the carbon source utilization spectrum of the two strains was revealed respectively. This study provides references both for the research of the catabolism of Ulva prolifera polysaccharides by marine microorganisms and for strain and carbon resources for the recycle of Ulva prolifera biomass in industry.

Key words： Ulva prolifera; Ulva prolifera polysaccharide; Ulva prolifera polysaccharide degrading bacteria; carbon source utilization spectrum

（責(zé)任編輯：羅小芬）