6-姜酚通過(guò)Akt/GSK3-β信號(hào)通路改善心肌缺血再灌注損傷的研究

［摘要］目的通過(guò)Akt/GSK3-β信號(hào)通路研究6-姜酚對(duì)心肌缺血再灌注損傷（I/R）的影響。方法（1）選取相同月齡的健康雄性Wistar大鼠32只，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組1、I/R1組、I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組各8只，對(duì)I/R1組、I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組制備I/R模型，分別給予I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組2 mg/kg及4 mg/kg的6-姜酚溶液2 mL灌胃，對(duì)照組1及I/R1組大鼠灌注等量蒸餾水。比較各組干預(yù)后心肌細(xì)胞凋亡水平、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、血清乳酸脫氫酶（LDH）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、核因子κB（NF-κB）、Akt、p-Akt、GSK3-β及p-GSK3-β表達(dá)水平。（2）H9C2心肌細(xì)胞分為對(duì)照組2、I/R2組、I/R2+50 mmol/L組、I/R2+100 mmol/L組，每組3份。對(duì)I/R2組、I/R2+50 mmol/L組、I/R2+100 mmol/L組H9C2心肌細(xì)胞建立I/R模型，分別將對(duì)照組2、I/R2組、I/R2+50 mmol/L組及I/R2+100 mmol/L組H9C2心肌細(xì)胞置于含有0 mmol/L、0 mmol/L、50 mmol/L和100 mmol/L的6-姜酚DMEM培養(yǎng)基中，比較H9C2心肌細(xì)胞干預(yù)后的凋亡水平、Caspase-3、LDH、Akt、p-Akt、GSK3-β、p-GSK3-β的表達(dá)水平。結(jié)果（1）I/R+4 mg/kg組的細(xì)胞凋亡面積及Caspase-3、LDH、IL-6、TNF-α及NF-κB水平均低于I/R1組（Plt;0.05），且I/R+4 mg/kg組的細(xì)胞凋亡面積及Caspase-3及IL-6水平低于I/R+2 mg/kg組（Plt;0.05）；I/R+4 mg/kg組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均高于I/R1組及I/R+2 mg/kg組（Plt;0.05）。（2）I/R2+100 mmol/L組的細(xì)胞凋亡率、Caspase-3及LDH均低于I/R2組及I/R2+50 mmol/L組（Plt;0.05），I/R2+100 mmol/L組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均高于I/R2 組及I/R2+50 mmol/L組（Plt;0.05）。結(jié)論6-姜酚處理后的大鼠心肌細(xì)胞I/R程度顯著減輕，炎癥因子降低，心肌細(xì)胞的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β信號(hào)通路相關(guān)蛋白比值升高，考慮6-姜酚通過(guò)激活A(yù)kt/GSK3-β信號(hào)通路達(dá)到改善心肌I/R的效果。

［關(guān)鍵詞］6-姜酚；大鼠；H9C2心肌細(xì)胞；缺血再灌注損傷；Akt/GSK3-β信號(hào)通路

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2023.03.011

6-Gingerol Improving Myocardial Ischemia-Reperfusion Injuryby Akt/GSK3-β Signaling Pathway

Zeng Xiaoman，Chen Zejiang，Zhang Laxi，Zeng Xiaohui，Li Xiuxia，Qiu Xunwu，F(xiàn)u Dapeng，Lin Keli，Zheng Yingzhuo

Department of Cardiology，Wenchang People's Hospital of Hainan Province，Wenchang571300

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of 6-gingerol on myocardial ischemia-reperfusion injury（I/R） by Akt/GSK3-β signaling pathway.Methods（1）Thirty-two healthy male Wistar rats with the same age were divided into control group 1，I/R1 group，I/R+2 mg/kg group and I/R+4 mg/kg group according to the random number table，with 8 rats in each group.I/R model was prepared for I/R1 group，I/R+2 mg/kg group and I/R+4 mg/kg group.The rats in the I/R+2 mg/kg group and I/R+4 mg/kg group were given 2 mg/kg and 4 mg/kg of 6-gingerol solution by gavage，respectively，and the rats in the control group 1 and I/R1 group were given the same volume of distilled water.The levels of myocardial cell apoptosis，Caspase-3，serum lactate dehydrogenase（LDH），interleukin-6（IL-6），tumor necrosis factor-α（TNF-α），nuclear factor κB（NF-κB），Akt，p-Akt，GSK3-β and p-GSK3-β were compared between the groups after intervention.（2）H9C2 cardiomyocytes were divided into control group 2，I/R2 group，I/R2+50 mmol/L group，and I/R2+100 mmol/L group，with 3 in each group.I/R model was established for H9C2 cardiomyocytes in I/R2 group，I/R2+50mmol/L group，and I/R2+100 mmol/L group.The H9C2 cardiomyocytes in control group 2，I/R2 group，I/R2+50 mmol/L group and I/R2+100 mmol/L group were cultured in DMEM medium containing 0 mmol/L，0 mmol/L，50 mmol/L，and 100 mmol/L of 6-gingerol，respectively.The levels of apoptosis，Caspase-3，LDH，Akt，p-Akt，GSK3-β，and p-GSK3-β in H9C2 cardiomyocytes were compared between the groups after intervention.Results（1）Apoptotic area and the levels of Caspase-3，LDH，IL-6，TNF-α and NF-κB in I/R+4 mg/kg group were lower than those in I/R1 group（Plt;0.05）.The apoptotic area and the levels of Caspase-3 and IL-6 in I/R+4 mg/kg group were lower than those in I/R+2 mg/kg group（Plt;0.05）.The levels of p-Akt/Akt and p-GSK3-β/GSK3-β in I/R+4 mg/kg group were higher than those in I/R1 group and I/R+2 mg/kg group（Plt;0.05）.（2）The apoptotic rate，the levels of Caspase-3 and LDH in I/R2+100 mmol/L group were lower than those in I/R2 group and I/R2+50 mmol/L group（Plt;0.05）.The ratio of p-Akt/Akt and p-GSK3-β/GSK3-β in I/R2+100 mmol/L group were higher than those in I/R2 group and I/R2+50 mmol/L group（Plt;0.05）.ConclusionAfter treated with 6-gingerol，the myocardial cells show reduced ischemia-reperfusion injury and inflammatory response，elevated ratio of signaling pathway-related proteins such as p-Akt/Akt and p-GSK3-β/GSK3-β.It is considered that 6-gingerol may improve the ischemia-reperfusion injury by activating the Akt/GSK3-β signaling pathway in myocardial cells.

［Key words］6-Gingerol；Rats；H9C2 cardiomyocytes；Ischemia-reperfusion injury；Akt/GSK3-β signaling pathway

心肌梗死如不能得到有效的治療會(huì)危及患者的生命，第一時(shí)間解除狹窄恢復(fù)血供是改善預(yù)后的首要措施。但缺血的心肌細(xì)胞在血管再通血液重新灌注后可能出現(xiàn)損傷程度加重、心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，甚至出現(xiàn)冠脈無(wú)復(fù)流等嚴(yán)重心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia-reperfusion injury，I/R）表現(xiàn)，為臨床救治帶來(lái)嚴(yán)重困擾［1］。6-姜酚是生姜中產(chǎn)生辛辣味覺(jué)的主要物質(zhì)，研究表明其具有改善機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)抗細(xì)胞凋亡等作用，其生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮可能與多種信號(hào)通路的激活有關(guān)［2］。本研究通過(guò)Akt/GSK3-β信號(hào)通路研究6-姜酚對(duì)I/R的影響，為臨床治療I/R提供方案。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取體質(zhì)量250～300 g的健康雄性Wistar大鼠32只，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組1、I/R1組、I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組，各8只。各組均采用常規(guī)飼養(yǎng)方法進(jìn)行飼養(yǎng)，其中I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組在I/R手術(shù)后分別按照2 mg/kg及4 mg/kg的劑量進(jìn)行6-姜酚灌胃10 d，I/R1組及對(duì)照組灌胃等體積的蒸餾水。

取H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和分組，分別為對(duì)照組2、I/R2組、I/R2+50 mmol/L組、I/R2+100 mmol/L組，各組H9C2心肌細(xì)胞分別在含0 mmol/L、0 mmol/L、50 mmol/L和100 mmol/L的6-姜酚的DMEM培養(yǎng)基（未添加血清及葡萄糖）中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1模型制備動(dòng)物模型制備：對(duì)照組1大鼠僅做開(kāi)胸掛線手術(shù)，冠狀動(dòng)脈的左前降支血管未結(jié)扎。缺血再灌注損傷模型的造模方法依據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行［3］。使用乙醚吸入麻醉法將大鼠麻醉，麻醉后扣戴半開(kāi)放式乙醚吸入面罩，經(jīng)口氣管插管接大鼠人工呼吸機(jī)（呼吸頻率110 次/min）。開(kāi)始手術(shù)，將大鼠固定后，沿胸骨左側(cè)2 mm處切開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉直至見(jiàn)肋骨，之后分離肋間肌，在第4肋間隙處的位置使用拉鉤將胸壁拉開(kāi)，然后剪開(kāi)心包膜，用棉簽輕輕按壓住心臟。取針（8-0絲線）在左心耳下緣1～2 mm處進(jìn)針，進(jìn)針深度約為1 mm，之后斜向右上方肺動(dòng)脈圓錐方向出針，針距約2 mm，結(jié)扎左前降支近端，驗(yàn)證模型制作是否成功，成功標(biāo)志為結(jié)扎血管供應(yīng)區(qū)的心肌腫脹或變?yōu)樯n白色。缺血時(shí)間為30 min，之后松開(kāi)線結(jié)解除阻斷行再灌注。最后逐層縫合胸部肌肉、皮膚。

細(xì)胞模型制備：將對(duì)照組2、I/R2組、I/R2+50 mmol/L組及I/R2+100 mmol/L組H9C2心肌細(xì)胞置于填充低氧含量氣體培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，后以2 L/min速度通入空氣并置入常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，以完成再灌注（即復(fù)氧）模型的建立。

1.2.2標(biāo)本采集及檢測(cè)按照預(yù)定干預(yù)方式對(duì)各組大鼠進(jìn)行為期10 d的連續(xù)喂養(yǎng)后，取大鼠左心室血液、冠狀動(dòng)脈左前降支供應(yīng)區(qū)域心肌組織及H9C2心肌細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組H9C2心肌細(xì)胞的凋亡水平。分別采用半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性試劑盒及血清乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒檢測(cè)各組Caspase-3及LDH的表達(dá)水平。用ELISA法檢測(cè)大鼠血清炎癥因子白細(xì)胞介素6（Interleukin- 6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）的表達(dá)情況。采用免疫印記法分別檢測(cè)各組大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支供應(yīng)區(qū)域心肌組織及各組H9C2心肌細(xì)胞的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β的表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料采用±s表示，多組計(jì)量資料采用單因素方差分析，任意兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠心肌細(xì)胞損傷情況及炎癥因子水平比較

各組細(xì)胞凋亡面積及Caspase-3、LDH、IL-6、TNF-α及NF-κB水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。其中，I/R1組、I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組的細(xì)胞凋亡面積及Caspase-3、LDH、IL-6、TNF-α及NF-κB水平均高于對(duì)照組（Plt;0.05），I/R+4 mg/kg組的細(xì)胞凋亡面積及Caspase-3、LDH、IL-6、TNF-α及NF-κB水平均低于I/R1組（Plt;0.05），I/R+4 mg/kg組的細(xì)胞凋亡面積及Caspase-3及IL-6水平低于I/R+2 mg/kg組（Plt;0.05），見(jiàn)表1。

2.2大鼠心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

各組p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。其中，I/R1組、I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均低于對(duì)照組（Plt;0.05），I/R+4 mg/kg組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均高于I/R1組及I/R+2 mg/kg組（Plt;0.05），見(jiàn)表2。

2.3H9C2心肌細(xì)胞損傷情況以及凋亡因子水平比較

各組H9C2心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率、Caspase-3及LDH比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。其中，I/R2組、I/R2+50 mmol/L組以及I/R2+100 mmol/L組的細(xì)胞凋亡率、Caspase-3及LDH均高于對(duì)照組2，I/R2+100 mmol/L組的細(xì)胞凋亡率、Caspase-3及LDH均低于I/R2組及I/R2+50 mmol/L組（Plt;0.05），見(jiàn)表3。

2.4H9C2心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

各組H9C2心肌細(xì)胞的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。I/R2組、I/R2+50 mmol/L組及I/R2+100 mmol/L組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均低于對(duì)照組2，I/R2+100 mmol/L組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均高于I/R2組及I/R2+50 mmol/L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見(jiàn)表4。

3討論

I/R是一種常出現(xiàn)于心肌梗死、器官移植、擠壓傷綜合征后因血流中斷一段時(shí)間后再次恢復(fù)血供，組織器官不僅未出現(xiàn)明顯缺血缺氧狀態(tài)的好轉(zhuǎn)，反而出現(xiàn)損傷加重、細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡情況進(jìn)一步加劇的現(xiàn)象［4-8］。有研究表明，I/R的發(fā)生和發(fā)展與NF-κB、Akt/GSK3-β等介導(dǎo)的信號(hào)通路激活狀態(tài)改變密切相關(guān)［2］。組織細(xì)胞處于缺血狀態(tài)時(shí)，大量黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化成為黃嘌呤氧化酶，三磷酸腺苷徹底氧化供能產(chǎn)生次黃嘌呤，當(dāng)重新恢復(fù)血供時(shí)次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下一次轉(zhuǎn)化為黃嘌呤和尿酸，并在此過(guò)程中生成大量的自由基，而缺血導(dǎo)致清除自由基的抗氧化酶生成不足，自由基大量堆積對(duì)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生持續(xù)損傷作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷及凋亡的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，I/R后組織細(xì)胞釋放大量IL-6、TNF-α及NF-κB等炎癥因子引發(fā)異?；钴S的炎癥反應(yīng)，激活溶酶體酶并對(duì)自身細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用，是組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷的重要因素之一［9-12］。因此，緩解I/R組織細(xì)胞自由基堆積及減輕局部炎癥反應(yīng)程度是降低I/R的重要突破口。

6- 姜酚是生姜中形成辛辣味覺(jué)的主要物質(zhì)，研究表明6-姜酚具有明顯的降低炎癥反應(yīng)的功效，應(yīng)用6-姜酚后機(jī)體出現(xiàn)明顯的抑制炎癥細(xì)胞聚集，降低IL-6、TNF-α及NF-κB等炎癥因子的產(chǎn)生，從而達(dá)到抑制溶酶體酶激活，降低細(xì)胞損傷的作用［13-15］。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)6-姜酚通過(guò)干預(yù)NF-κB的表達(dá)，降低氧自由基對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及DNA損傷作用［16］。據(jù)報(bào)道，6-姜酚在發(fā)揮對(duì)炎癥反應(yīng)抑制作用的同時(shí)對(duì)損傷細(xì)胞的凋亡也具有緩解作用，應(yīng)用6-姜酚后機(jī)體細(xì)胞凋亡情況及Caspase-3、LDH等細(xì)胞凋亡指標(biāo)均有明顯改善［17］。6-姜酚具有強(qiáng)大的抗自由基作用，可顯著降低I/R過(guò)程中產(chǎn)生蓄積的大量自由基，從而顯著降低由此而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷及組織結(jié)構(gòu)損害［18-19］。

本研究表明，2 mg/kg劑量的6-姜酚應(yīng)用于在體研究心肌I/R模型大鼠后，各項(xiàng)指標(biāo)均有改善但并不顯著，4 mg/kg劑量的6-姜酚明顯降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平，改善血清細(xì)胞凋亡指標(biāo)及炎癥因子水平，由此可見(jiàn)6-姜酚的治療效果與應(yīng)用劑量有關(guān)。離體研究中，6-姜酚應(yīng)用于H9C2心肌細(xì)胞后同樣發(fā)揮明顯抗細(xì)胞凋亡作用。有研究表明，6-姜酚的抗自由基損傷及抗凋亡作用依賴于p-Akt等相關(guān)信號(hào)通路正常激活，當(dāng)p-Akt等蛋白相關(guān)信號(hào)通路被抑制時(shí)，Caspase-3等凋亡激活蛋白水平提高，細(xì)胞凋亡被激活從而出現(xiàn)細(xì)胞損傷［20-22］。應(yīng)用6-姜酚后大鼠的Akt、p-Akt、GSK3-β及p-GSK3-β水平顯著升高，考慮6-姜酚的顯著抗細(xì)胞凋亡及抗炎癥反應(yīng)機(jī)制與Akt/GSK3-β信號(hào)通路系統(tǒng)的激活有關(guān)，本研究與國(guó)內(nèi)外其他相關(guān)研究結(jié)果一致［13，23-24］。機(jī)體通過(guò)激活A(yù)kt/GSK3-β信號(hào)通路系統(tǒng)，降低炎癥細(xì)胞聚集并抑制IL-6、TNF-α及NF-κB等炎癥因子的釋放及進(jìn)一步可能發(fā)生的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)；緩解組織細(xì)胞的炎癥損傷及凋亡進(jìn)程，從而達(dá)到降低I/R改善預(yù)后的治療效果。鑒于本研究樣本量及實(shí)驗(yàn)條件有限，本次研究結(jié)果尚需進(jìn)一步探討研究。

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（2022-08-19收稿）