低溫脅迫對紫花苜蓿幼苗AsA酶活性的影響

馬亞珺，楊國柱，田海寧

（1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程研究中心，青海西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；3.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海西寧 810016）

紫花苜蓿（MedicagosativaL.）是多年生豆科牧草，根系發(fā)達(dá)，主根粗大，抗寒性、抗旱性和可再生能力較為強(qiáng)大，且產(chǎn)草量高，富含蛋白質(zhì)，適口性好，固氮能力強(qiáng)，適應(yīng)性廣，被稱為“牧草之王”[1-2]。在植物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的抗氧化物中，抗壞血酸含量最為豐富，抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）又名維生素C，常起到抗氧化和輔助7-α-羥化酶促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化膽汁酸的作用，是植物和大多數(shù)生物體內(nèi)重要的抗氧化劑，在生長發(fā)育過程中起著重要作用。在高等植物中，抗壞血酸氧化酶（Ascorbate oxidase，AAO）是一種含銅的酶，位于細(xì)胞質(zhì)中或與細(xì)胞壁結(jié)合，與其他氧化還原反應(yīng)相偶聯(lián)作為末端氧化酶，能催化抗壞血酸的氧化，具有抗衰老等作用；抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一，又是維生素C 代謝的主要酶類，紫花苜蓿中豐富的維生素C 是飼草中重要活性營養(yǎng)成分[3]；脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）是調(diào)控植物體內(nèi)AsA 氧化還原態(tài)的關(guān)鍵酶，在循環(huán)利用AsA、維持植物體內(nèi)AsA 的正常代謝水平、保護(hù)細(xì)胞組分抵御氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、儀器、試劑

1.1.1 試驗材料

試驗材料為青大1 號、大業(yè)1 號、中苜1 號、中蘭2 號、甘農(nóng)3 號、甘農(nóng)9 號和WL232 紫花苜蓿幼苗。

1.1.2 試驗儀器

試驗儀器有培養(yǎng)皿、人工氣候箱、分析天平、研缽、50 mL 量筒、50 mL 三角瓶、微量滴定管、滴定架、離心機(jī)、恒溫水浴槽、洗耳球、酶標(biāo)板、EP 管及紫外分光光度計等。

1.1.3 試驗試劑

試驗試劑有碘酸鉀、冰醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、抗壞血酸、淀粉溶液、乙醇、偏磷酸、三氯乙酸、雙蒸水及牛血清蛋白等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料的準(zhǔn)備

采用盆栽試驗，選用大小均勻、顆粒飽滿的紫花苜蓿種子，將其用75%的乙醇溶液消毒后，播種在標(biāo)記好的花盆中，每盆播種50粒，每個品種播種12 盆。將播種好的花盆置于人工氣候室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，溫度保持在25 ℃。于播種后90 d 進(jìn)行試驗。

1.2.2 試驗實(shí)施

在進(jìn)行低溫處理時，將人工氣候室溫度調(diào)至4 ℃，同時設(shè)置脅迫時間，共設(shè)置0 h（CK）、24 h（T1）、48 h（T2）、72 h（T3）4 個處理，并分別測定紫花苜蓿AsA 酶活性。

1.2.3 項目測定

采用碘量法測定抗壞血酸氧化酶活性、采用紫外吸收法測定抗壞血酸過氧化物酶活性、采用微量法測定脫氫抗壞血酸還原酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010和SPSS 26.0軟件進(jìn)行繪圖與統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗抗壞血酸氧化酶活性的影響

紫花苜蓿幼苗在4 ℃低溫脅迫過程中，AAO 活性變化如圖1 所示。由圖1 可知，隨著處理時間的延長，T2、T3處理紫花苜蓿幼苗體內(nèi)AAO 活性呈上升趨勢。在T3處理下，青大1 號AAO 活性顯著高于其他品種（p＜0.05）。在T1處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)AAO 活性表現(xiàn)為WL232＞青大1 號＞大業(yè)1 號＞中苜1 號＞中蘭2 號＞甘農(nóng)9 號＞甘農(nóng)3 號；在T2處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)AAO 活性表現(xiàn)為青大1號＞W(wǎng)L232＞甘農(nóng)9 號＞中苜1 號＞大業(yè)1 號＞中蘭2 號＞甘農(nóng)3 號；在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)AAO 活性表現(xiàn)為青大1 號＞甘農(nóng)9 號＞W(wǎng)L232＞中苜1 號＞大業(yè)1 號＞中蘭2 號＞甘農(nóng)3 號。這表明低溫脅迫可促進(jìn)紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的AAO 發(fā)揮作用，清除植物體內(nèi)聚集的活性氧，使種植在高寒地區(qū)的紫花苜蓿能夠很好地抵御冷害。

2.2 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗抗壞血酸過氧化物酶活性的影響

紫花苜蓿幼苗在4 ℃低溫脅迫過程中，APX 活性變化如圖2 所示。由圖2 可知，7 個品種紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的APX 活性在T1處理下達(dá)到高峰，隨后逐漸呈現(xiàn)下降趨勢。在T2處理下，只有甘農(nóng)3 號幼苗體內(nèi)APX 活性顯著低于其他紫花苜蓿品種（p＜0.05）。在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX 活性驟然下降。對比不同品種紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的APX 活性，發(fā)現(xiàn)降幅最大的品種是甘農(nóng)3號，相比T1 處理，在T2處理和T3處理下，下降幅度分別為29%和91%；青大1 號幼苗體內(nèi)APX 活性下降幅度最小，在T2處理和T3處理下，下降幅度分別為16%和77%。在T1處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX 活性表現(xiàn)為青大1 號＞中苜1 號＞甘農(nóng)9 號＞中蘭2 號＞W(wǎng)L232＞大業(yè)1 號＞甘農(nóng)3號；在T2處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX活性表現(xiàn)為青大1 號＞大業(yè)1 號＞中蘭2 號＞中苜1 號＞甘農(nóng)9 號＞W(wǎng)L232＞甘農(nóng)3 號；在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX活性表現(xiàn)為青大1號＞中蘭2號＞W(wǎng)L232＞中苜1號＞甘農(nóng)9 號＞大業(yè)1 號＞甘農(nóng)3 號。這說明適度的低溫處理可以很好地激活紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX 活性，有助于清除活性氧給植物帶來的損傷，但是長時間低溫會使幼苗體內(nèi)O2-·和H2O2大量積累，而積累的活性氧必將攻擊紫花苜蓿的植物膜，導(dǎo)致并加速冷害的發(fā)生，使APX 失活，不利于植物抵抗寒冷。

圖2 不同處理時間下不同品種紫花苜蓿APX 活性

2.3 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗脫氫抗壞血酸還原酶活性的影響

紫花苜蓿幼苗在4 ℃低溫脅迫過程中，DHAR 活性變化如圖3 所示。由圖3 可知，7 種紫花苜蓿幼苗在CK 處理下，即不經(jīng)過低溫處理，幼苗體內(nèi)DHAR活性處在一個較低的水平，但隨著低溫脅迫時間的延長，DHAR 活性呈上升趨勢。在T1處理下，大業(yè)1 號和WL232 幼苗體內(nèi)DHAR 較活躍，增幅較CK 均達(dá)到了88%；各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)DHAR 活性表現(xiàn)為WL232＞大業(yè)1 號＞甘農(nóng)9 號＞甘農(nóng)3 號＞中苜1 號＞青大1 號＞中蘭2 號；在T2處理下，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)DHAR 活性表現(xiàn)為青大1 號＞中蘭2 號＞中苜1 號＞大業(yè)1 號＞甘農(nóng)9 號＞W(wǎng)L232＞甘農(nóng)3 號；在T3處理下，各紫花苜蓿幼苗中DHAR 活性表現(xiàn)為青大1 號＞中苜1 號＞中蘭2 號＞大業(yè)1 號＞W(wǎng)L232＞甘農(nóng)9 號＞甘農(nóng)3 號。這說明連續(xù)的長時間低溫處理使紫花苜蓿幼苗中活性氧大量聚集，破壞了苜蓿的細(xì)胞膜，苜蓿體內(nèi)的DHAR 響應(yīng)低溫脅迫。

圖3 不同處理時間下不同品種紫花苜蓿DHAR 活性

3 討論

3.1 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗中AAO 活性影響的探討

抗壞血酸氧化酶活性與植物的生長發(fā)育與抗衰老有著密切的關(guān)系，尤其是以葉片為收獲物的農(nóng)作物，低溫可以降低農(nóng)作物呼吸速率，抑制抗壞血酸氧化酶的活性，減緩抗壞血酸降解速度，還可減緩冷害發(fā)生[5]。

此次試驗結(jié)果表明，各紫花苜蓿幼苗體內(nèi)AAO酶活性在低溫脅迫24 h 和48 h 處理下增幅較大，此時苜蓿開始受到低溫的迫害，苜蓿體內(nèi)的抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)開始運(yùn)作，產(chǎn)生AAO 以抵抗低溫的迫害。其中，青大1 號紫花苜蓿在低溫脅迫48 h 和72 h 處理下增幅驟然增加，說明隨著低溫脅迫時間的增加，苜蓿幼苗受傷嚴(yán)重，體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)加大運(yùn)作力度產(chǎn)生大量的AAO，以減少低溫引起的傷害，且低溫脅迫時間越長，抗壞血酸氧化酶活性在青大1 號紫花苜蓿體內(nèi)愈高。由此可見，青大1 號紫花苜蓿對低溫的響應(yīng)比較好，比較適合種植在高寒地區(qū)，能夠很好地抵御冷害。

3.2 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗中APX 活性影響的探討

酶活性極易受到環(huán)境的影響，在低溫脅迫下，活性氧在苜蓿幼苗體內(nèi)快速累積，導(dǎo)致脂膜過氧化，細(xì)胞受到損傷，此時苜蓿抗氧化酶系統(tǒng)中的APX 可以迅速有效清除活性氧，減輕低溫對植物的迫害[6-7]。此次試驗結(jié)果表明，在0～24 h 低溫脅迫下，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX 活性增幅最大，幼苗體內(nèi)APX 對低溫脅迫的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)極為敏感，在24 h 時幼苗體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)加大運(yùn)作力度產(chǎn)生大量的APX，以減輕低溫對苜蓿造成的傷害。在24～48 h 低溫脅迫下，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)APX 活性升高，但增幅下降。低溫處理時間越長，苜蓿幼苗體內(nèi)APX 活性越高，其體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)越活躍，說明APX 是苜蓿幼苗體內(nèi)用來抵抗低溫傷害的抗氧化酶系統(tǒng)中重要的一種保護(hù)酶。但隨著低溫脅迫時間的延長，幼苗體內(nèi)會積累大量的和H2O2，會攻擊紫花苜蓿的植物膜，導(dǎo)致并加速冷害的發(fā)生，使APX 失活，不利于植物抵抗寒冷。此次試驗中，青大1 號紫花苜蓿在低溫脅迫下表現(xiàn)較好。

3.3 低溫脅迫對不同品種紫花苜蓿幼苗中DHAR 活性影響的探討

DHAR 存在于葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中[8-9]。根據(jù)文獻(xiàn)報道，低溫鍛煉可使植物體內(nèi)的AsA 含量隨著DHAR 活性的增強(qiáng)而增加[10-12]。在長期低溫脅迫處理下，紫花苜蓿體內(nèi)會聚集大量活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，從而使植物的抗寒性變?nèi)酢Ｔ诹己玫沫h(huán)境下，植物通常將活性氧維持在較低水平；而在周圍環(huán)境不利的情況下，如此次試驗低溫脅迫環(huán)境下，植物細(xì)胞代謝失調(diào)，體內(nèi)活性氧水平升高，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成潛在威脅。而DHAR 是一種非常重要的酶，可以清除植物體內(nèi)的活性氧，對逆境有著很好的響應(yīng)。此次試驗結(jié)果表明，在0～72 h 低溫脅迫下，紫花苜蓿體內(nèi)DHAR 活性總體先上升后下降。在低溫脅迫24 h后，DHAR 迅速在體內(nèi)積累，在低溫脅迫48 h時，DHAR酶活性上升程度較為明顯，之后又在低溫脅迫72 h 后下降。不同品種、不同處理時間，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)DHAR 活性都要高于CK，但品種間的DHAR 活性差異性不顯著，其中青大1 號紫花苜蓿幼苗體內(nèi)DHAR 活性最強(qiáng)，甘農(nóng)3 號紫花苜蓿幼苗體內(nèi)DHAR 活性最弱。

4 結(jié)論

此次試驗分析了不同品種紫花苜蓿在低溫脅迫下生理生化指標(biāo)的變化，研究了不同品種紫花苜蓿的生理生化指標(biāo)與其抗寒性的關(guān)系。結(jié)果表明，青大1 號紫花苜蓿對低溫的響應(yīng)比較好，體內(nèi)的AAO、APX、DHAR 活性增強(qiáng)，可有效清除由低溫帶來的活性氧，使細(xì)胞膜損傷程度下降，比較適合在高寒地區(qū)種植。